O melanoma é a forma mais mortal de câncer de pele, origina-se de células produtoras de pigmentos, os melanócitos. Esses podem ser cutâneos ou não-cutâneos (encontrados no revestimento da membrana coróide do olho, nas meninges, e nos tratos gastrintestinal e geniturinário). O aumento da incidência de melanomas malignos nas últimas décadas, e sua alta taxa de mortalidade e grande resistência a maior parte das terapias, tem sido um enorme desafio para a comunidade científica. Particularmente, a falta de habilidade de indução à morte por apoptose em resposta à quimioterapia e outros estímulos externos permitem uma vantagem seletiva para progressão tumoral, formação de metástase e resistência à terapia em melanomas. O estresse oxidativo e espécies reativas de oxigênio (EROs) vêm sendo, há muito tempo, reconhecidos como importantes desencadeadores e moduladores da apoptose. Porém o exato papel do estresse oxidativo no processo apoptótico ainda é uma questão de debate. Antioxidantes tendem a possuir propriedades regulatórias de tradução de sinais que devem ou não estar ligadas as suas capacidades de inativar oxidantes. Porém em certas condições, um forte ambiente oxidante onde há falta de suporte para regenerar (reduzir) antioxidantes oxidados, permite que alguns antioxidantes assumam características de um pró-oxidante. Foi demonstrada a capacidade citotóxica de um potente antioxidante, 4-nerolidilcatecol (4-NC), extraído da planta Pothomorphe umbellata L. Miq, sobre linhagens tumorais de melanoma e sobre fibroblastos humanos normais. Esse composto foi capaz de induzir a parada do ciclo celular em G1, bem como diminuir a atividade de MMPs e em outras linhagens de melanoma foi capaz de induzir a morte celular por apoptose. Estudos subseqüentes mostraram que o mecanismo de ação deste composto inicia-se com a formação e acúmulo de EROs, além da inibição da enzima catalase. O 4-NC foi capaz de induzir a morte por apoptose via mitocondrial, aumentando os níveis das proteínas p53, Noxa, Mcl-1, clivando Bax e Bid e induzindo a clivagem das caspases 3 e 9. Além disso, em modelo de pele artificial contendo melanoma, o 4-NC foi capaz de conter a invasão do melanoma para a estrutura dérmica da pele reconstituída. Foram utilizadas como controle de diferenciação as proteínas Queratina 10 e 14, Involucrina e, como marcador do melanoma, a proteína S100. Parte desta invasão é contida devido à inibição da ativação das MMP-2 e -9 e ativação de TIMP-2 pelo 4-NC. Sendo assim, esse composto se mostra como um potencial quimioterápico no tratamento do melanoma humano. / Melanoma is the most agressive form of skin cancer, it arises from the pigment-producing cells, melanocytes. These may be cutaneous or non-cutaneous (found in the lining membrane of the eye choroid, the meninges, and gastrointestinal and genitourinary tracts). The increased incidence of malignant melanomas in recent decades, its high mortality rate and high resistance to most therapies has been a major challenge to the scientific community. It\'s particularly difficult to induce cell death by apoptosis in response to chemotherapy and other external stimuli, which may provide a selective advantage for tumor progression, metastasis formation and resistance to therapy in melanoma. Oxidative stress and reactive oxygen species (ROS) have been recognized for a long time as important triggers and modulators of apoptosis, but the exact role of oxidative stress in the apoptotic process is still a matter of discussion. Antioxidants tend to possess properties to regulate transduction signals that may not be related to their ability to inactivate oxidants. Under certain conditions, in a strong oxidizing environment where there is lack of support to regenerate (reduce) oxidized antioxidants, some antioxidants can assume characteristics of pro-oxidant. The 4-nerolidylcatechol (4-NC) is a potent antioxidant that is extracted from the plant Pothomorphe umbellata L. Miq. Its citotoxic potential has been demonstrated on melanoma tumor cell lines and on normal human fibroblasts. This compound was able to induce cell cycle arrest in G1, decrease the activity of MMPs and cell death by apoptosis. Subsequent studies showed that the mechanism of action of this compound starts with the formation and accumulation of ROS, and inhibition of the enzyme catalase. The 4-NC was able to induce apoptosis via mitochondria, increasing the levels of p53, Noxa, Mcl1, cleaving Bax and Bid and inducing cleavage of caspases 3 and 9. Furthermore, in a model of artificial skin containing melanoma 4-NC was able to contain the invasion of melanoma to the dermal part of the skin. Proteins keratin 10 and 14, involucrin and S100 were used as control of differentiation. Part of this invasion is restrained due to TIMP-2 activation and the inhibition of MMP-2 and -9 activation by 4-NC. Concluding, this compound can be used as a potential chemotherapeutic agent in the treatment of human melanoma.

Endostatina é um inibidor específico de proliferação de células endoteliais, migração e um potente inibidor de angiogênese. Foi demonstrado que a administração contínua de endostatina é mais efetiva na supressão tumoral do que a mesma dose administrada s.c. diariamente. Encontrar a concentração de endostatina para combater o crescimento tumoral é complicado pela pequena meia vida da proteína. O transplante de células encapsuladas em dispositivos de imunoisolamento é uma abordagem promissora para muitas doenças, pois permite uma liberação por longo tempo da proteína com propriedades terapêuticas. A membrana semipermeável pode proteger as células da rejeição do sistema imune, para evitar o problema de toxicidade, meia vida limitada e variação nos níveis circulantes. O dispositivo Theracyte® é um sistema de membranas semipermeáveis para macroencapsulamento que permite o implante de células geneticamente modificadas para liberação de proteínas terapêuticas in vivo sem a necessidade de imunosupressão do hospedeiro. Foi demonstrado neste estudo que fibroblastos murinos (células LM) expressando 0,4 µg de endostatina murina/106 células em 24 horas se apresentam como uma abordagem promissora para terapia tumoral. O sistema de liberação é composto de células LM produtoras de endostatina encapsuladas em macrocápsulas Theracyte para imunoisolamento de células. Para demonstrar a utilidade deste sistema, modelos de camundongos com tumores de Ehrlich e melanoma foram tratados com 107 células encapsuladas expressando endostatina. Foram analisados dois protocolos para o implante dos dispositivos: No primeiro, os dispositivos foram implantados nos animais e após 14 dias (cicatrização das feridas), as células expressando endostatina foram implantadas no interior destes dispositivos. Em um segundo, os dispositivos contendo as células foram implantados nos animais. O crescimento do tumor melanoma foi reduzido de 42% pela utilização do primeiro protocolo de implante e de 54% quando o segundo protocolo foi utilizado. O crescimento do tumor de Ehrlich foi reduzido de 25% utilizando o primeiro protocolo de implante. A imunohistoquímica utilizando anticorpo anti-endostatina demonstrou a liberação da endostatina para o estroma ao redor do dispositivo, mostrando que a endostatina, secretada pelas células recombinantes confinadas permeou através da membrana, atingindo os tecidos adjacentes. A efetividade da ação da endostatina na neovascularização de melanoma (B16-F10) foi determinada pela análise do número de estruturas vasculares, analisadas por imunohistoquímica utilizando anticorpo anti-CD34. Foi demonstrado um decréscimo de 41,5% no número de estruturas vasculares, 35,9% no número de vasos viáveis e de 33,5% na extensão da área vascular no grupo tratado. Os resultados descritos são promissores e podem oferecer uma alternativa para uma variedade te tipos de tumores. / Endostatin is a specific inhibitor of endothelial cell proliferation, migration and a potent angiogenesis inhibitor. It has been shown that continuous administration of endostatin is more effective in tumor suppression than the same dose administered s.c. daily. Achieving concentration of endostatin to combat tumor growth is complicated by the short life of the protein. Transplantation of encapsulated cells in immunoisolation devices is a promising approach for many diseases since it allows a long-term delivery of the therapeutic protein and the semi-permeable membrane can protect cell from host’s immune rejection, to circumvent the problem of toxicity, limited half life and variation in circulating levels. The Theracyte® device is a semi-permeable membrane macroencapsulation system for implantation of genetically engineered cells for therapeutic proteins delivery in vivo and which does not require host immunosuppression. It was shown in this study that encapsulated recombinant murine fibroblasts (LM) expressing 0.4µg of murine endostatina/106 cells in 24 hours presents a feasible approach to tumor therapy. The delivery system was composed of recombinant endostatin-producing LM murine cells encapsulated into Theracyte macrocapsule for immunoisolation of cells. To demonstrate the usefulness of this system, experimental mice models with Ehrlich and Melanoma tumors were treated with 107 encapsulated endostatin-expressing cells. Two protocols were used for the implant of the devices: 1) The devices were implanted in the animals and after 14 days (wound healing), the cells expressing endostatin were implanted into the device and 2) the devices were implanted in the animals containing the cells. Melanoma tumor growth was reduced by 42% using the first implant protocol and by 54% when the second protocol was used. Ehrlich tumor growth was reduced by 25% using the first device implant protocol. As revealed by anti-endostatin immunostaining, there was a release of endostatin to the tissue outside the devices, demonstrating that endostatin, secreted by the confined recombinant cells, permeated trough the membrane, reaching the surrounding tissues. The effectiveness of endostatin delivery on the neovascularization of melanoma (B16-F10) was determined by analysis of the number of vascular structures, accessed by immunohistochemistry using anti-CD-34 antibody. It was shown that there was a decrease of 41.5% in the number of vascular structures, 35.9% in the number of viable vessels and 33.5% in the extension of vascular area in the treated group. The results described are quite promising and may offer an alternative for the treatment of a variety of tumor types. LISTA

Apesar dos constantes avanços no tratamento de câncer, essa doença continua sendo umas das principais causas de mortalidade no mundo todo, portanto, é imperativo que novas modalidades de tratamento sejam desenvolvidas. Venenos de serpentes causam uma variedade de efeitos biológicos, pois constituem uma mistura complexa de substâncias como disintegrinas, proteases (serino e metalo), fosfolipases A2, L-aminoácido oxidases entre outras. No presente trabalho pesquisou-se em alguns venenos de serpentes frações com atividade antitumoral, pois há relatos de compostos ofídicos que apresentam esta atividade. Após fracionamento de venenos de serpentes das famílias Viperidae e Elapidae foram feitas incubações das frações obtidas com células normais de fibroblasto L929 e de melanoma B16-F10. Os resultados mostraram que as frações do veneno da serpente Notechis ater niger apresentaram a maior especificidade e potencial antitumoral em células de melanoma murino B16-F10 que os demais venenos utilizados. Este achado, aliado ao fato de ser um veneno pouco explorado foram determinantes para que este veneno fosse selecionado para dar continuidade aos estudos. As frações citotóxicas deste veneno foram submetidas a análises para identificar e caracterizar os componentes que apresentaram esta atividade atitumoral. Ensaios de western-blot e zimografia sugerem que estas proteínas não pertencem à classe das metalo e serinoproteinases. / Despite the constant advances in the treatment of cancer, this disease remains one of the main causes of mortality worldwide. So, the development of new treatment modalities is imperative. Snake venom causes a variety of biological effects because they constitute a complex mixture of substances as disintegrins, proteases (serine and metalo), phospholipases A2, L-amino acid oxidases and others. The goal of the present work is to evaluate a anti-tumor activity of some snake venoms fractions. There are several studies of components derived from snake venoms with this kind of activity. After fractionation of snake venoms of the families Viperidae and Elapidae, the fractions were assayed towards murine melanoma cell line B16-F10 and fibroblasts L929. The results showed that the fractions of venom of the snake Notechis ater niger had higher specificity and potential antitumor activity on B16-F10 cell line than the other studied venoms. Since the components of this venom are not explored yet coupled with the potential activity showed in this work, we decided to choose this venom to develop further studies. The cytotoxic fractions were evaluated to identify and characterize the components that showed antitumoral activity. Western blot assays and zymography suggests that these proteins do not belong to the class of metallo and serine proteinases.

Diagnóstico precoce e tratamento de melanoma, um tumor cutâneo com o pior prognóstico, é extremamente importante para um resultado clínico favorável. A biblioteca de peptídeos phage display é um recurso útil de triagem para identificar peptídeos bioativos que interagem com alvos em cânceres. O objetivo desse estudo foi a avaliação de dois traçadores de tecnécio-99m com sequências peptídicas RGD e NGR, conjugados com o quelante bifuncional MAG3. Os conjugados peptídicos (10 μL de uma solução μg/μL) foram marcados com tecnécio-99m usando tampão de tartarato de sódio. A avaliação radioquímica foi feita por ITLC e confirmada por CLAE. O coeficiente de partição foi determinado e ensaios de internalização foram realizados em duas linhagens celulares de melanoma (B16F10 e SKMEL28). A avaliação da biodistribuição dos traçadores foi realizada em animais sadios em diferentes tempos e também em camundongos portadores de células tumorais aos 120 min após a sua administração. Estudos de bloqueamento também foram conduzidos pela co-injeção de peptídeo frio. O desempenho dos conjugados peptídicos mostraram-se bastante parecidos em diversas avaliações. Eles foram radiomarcados com alta pureza radioquímica (>97%). Ambos são hidrofílicos, com excreção renal preferencial. A captação tumoral foi maior para células SKMEL28 do que para as células B16F10, especialmente para o 99mTc-MAG3-PEG8-c(RGDyK) (7,85±2,34 %DI/g) aos 120 min pós-injeção. O desempenho do 99mTc-MAG3-PEG8-c(RGDyk) foi superior que o do traçador com NGR, quanto à captação no melanoma humano podendo ser considerado como um promissor radiofármaco para diagnóstico de melanoma. / Early diagnosis and treatment of melanoma, a cutaneous tumor with a serious prognosis, is extremely important for optimal clinical outcome. Phage display peptide libraries are a useful screening resource for identifying bioactive peptides that interact with cancer targets. The aim of this study was the evaluation of two technetium-99m tracers for angiogenesis detection in melanoma model, using cyclic peguilated pentapeptide with RGD and NGR motifs conjugated with bifunctional chelator MAG3. The conjugated peptides (10 μL of a μg/μL solution) were labeled with technetium-99m using a sodium tartrate buffer. Radiochemical evaluation was done by ITLC and confirmed by HPLC. Partition coefficient was determined and internalization assays were performed in two melanoma cells (B16F10 and SKMEL28). Biodistribution evaluation of the tracers was done in healthy animals at different times and also in mice bearing the tumor cells at 120 min post injection. Blocking studies were also conducted by co-injection of cold peptides. The conjugated showed the same profile in many evaluations. They were radiolabeled with high radiochemical purity (>97%). Both were hydrophilic, with preferential renal excretion. Tumor uptake was higher for human melanoma cells than for murinic melanoma cells, specially for 99mTc-MAG3-PEG8-c(RGDyK) (7.85±2.34 %ID/g) at 120 min post injection. The performance of 99mTc-MAG3-PEG8-c(RGDyk) was much better than NGR tracer concerning human melanoma uptake and might be considered in future investigations focusing radiotracers for melanoma diagnosis.

O melanoma cutâneo maligno é uma lesão neoplásica originada nos melanócitos epidérmicos, sendo altamente invasiva e agressiva, com elevada taxa de mortalidade, cuja incidência vem aumentando nos últimos anos. O tratamento do melanoma é cirúrgico e os pacientes com metástase podem receber quimioterapia com cisplatina que ao formarem adutos com o DNA alteram o processo de replicação da célula cancerosa. Sugere-se que os sistemas de reparo do DNA tenham um papel importante na etiologia do melanoma (reparo deficiente) e no tratamento do mesmo (eficiente eliminação dos adutos). A identificação prévia da resposta dos pacientes com melanoma ao tratamento com cisplatina pode ser um indicador biológico importante na clínica oncológica. O presente trabalho teve como objetivo, a partir de linfócitos de sangue periférico de pacientes com melanoma e de controles, avaliar o dano no DNA antes e após a adição, in vitro, de cisplatina (10?M, 100?M e 250?M), além de estimar a capacidade de reparo do DNA, após a retirada da droga (1h, 2,5h e 5h). Foram utilizados os testes do micronúcleo (MN - dano basal) e do Cometa (dano basal, ação da cisplatina e reparo do DNA). A análise citogenética foi possível em 20 pacientes com melanoma (10 homens e 10 mulheres, média de 50,6 ± 5,9 anos) e 19 controles (9 homens e 10 mulheres, média de 49,9 ± 5,5 anos) que também responderam a um questionário sobre hábitos e tipos de exposição a fatores de risco ao melanoma. A frequência do dano basal pelo teste do MN e do Cometa em linfócitos de pacientes (MN = 1,2 ± 1,2 e Cometa = 59,3 ± 62,5) foi praticamente o dobro da observada nos controles (MN = 0,6 ± 1,0 e Cometa = 35,3 ± 18,6) embora a diferença entre os grupos, em ambos os testes, não tenha sido considerada estatisticamente significante (p=0,23 e p=0,85, respectivamente). O tratamento in vitro com cisplatina, em comparação com o dano basal, aumentou a frequência de Cometas nas três concentrações estudadas (10?M, 100?M e 250?M) tanto para os pacientes (65,50 ± 50,06, 72,74 ± 50,89 e 77,26 ± 44,16) quanto para os controles (66,53 ± 49,85, 66,53 ± 26,33 e 81,74 ± 43,12) diferença esta considerada significante somente para o grupo controle, nas três concentrações avaliadas (p=0,0175, p=0,0002, e p=0,0002, respectivamente). Quanto aos diferentes tempos de reparo (1h, 2,5h e 5h), após a retirada de cisplatina nas diferentes concentrações estudadas, verificou-se aumento na frequência média de Cometas tanto para os pacientes com melanoma (93,88 ± 33,7, 101,75 ± 35,7 e 99,31 ± 32,30) quanto para os controles (92,45 ± 38,4, 100,82± 38,8 e 100,81± 31,7), diferença que foi estatisticamente significante quando comparada ao dano basal observado nos pacientes (p<0,001) e nos controles (p<0,001). Resultados semelhantes foram observados quando comparados em conjunto os escores dos tempos de reparo com o escore obtido após tratamento com cisplatina nos pacientes (71,09 ± 48,2; p<=0,005) e nos controles (71,59 ± 40,5; p<=0,005). Os resultados obtidos parecem indicar um padrão de resposta semelhante em relação à cisplatina e ao reparo do DNA nos dois grupos de indivíduos avaliados. O período de incubação das células, após a retirada da cisplatina, bem como o número de indivíduos avaliados podem ter influenciado nos resultados obtidos. Por outro lado, a resposta observada nos linfócitos in vitro, pode não ser representativa do efeito in vivo da célula tumoral. Entretanto, a identificação de marcadores de resposta a tratamentos com quimioterápicos, a partir de linfócitos de sangue periférico pode ser uma estratégia de pesquisa importante na prática clínica, inclusive para o melanoma. / Cutaneous melanoma is a malignant tumor originated from epidermal melanocytes, highly invasive and aggressive, with high mortality, and incidence that has been increasing over the years. The treatment for melanoma is surgery and patients with metastasis may receive chemotherapy with cisplatin, that results in DNA adducts that alters the replication process in cancer cells. It is suggested that the DNA repair systems have an important role in the etiology of melanoma (risk due to deficient repair) and treatment efficiency (removal of DNA adducts can decrease the treatment results). The prior identification of the response of melanoma patients to treatment with cisplatin may be an important biological marker in clinical oncology. The aim of this study was to assess, in peripheral blood lymphocytes from melanoma patients and controls, the DNA damage before and after the addition of cisplatin (10?M, 100?M and 250?M), in vitro, and estimate the capacity of DNA repair after drug removal (1h, 2.5h and 5h). The micronucleus test (MN - basal DNA damage) and the Comet assay (basal DNA damage, action of cisplatin and DNA repair) were used for the evaluation. Cytogenetic analysis was performed in 20 melanoma patients (10 men and 10 women, average age 50.6 ± 5.9 years old) and 19 controls (9 men and 10 women, average age 49.9 ± 5.5 years old) who also answered a questionnaire on habits and types of exposure to risk factors for melanoma. The frequency of basal DNA damage by the MN test and the Comet assay in lymphocytes from patients (MN = 1.2 ± 1.2 and Comet = 59.3 ± 62.5) was nearly twice the observed in controls (MN = 0, 6 ± 1.0 and Comet = 35.3 ± 18.6), although the difference between the groups in both tests was not considered statistically significant (p = 0.23 and p = 0.85, respectively). The in vitro treatment with cisplatin, compared with the basal DNA damage, increased the frequency of Comets in the three studied concentrations (10?M, 100?M and 250?M) for patients (65.50 ± 50.06, 72.74 ± 50.89 and 77.26 ± 44.16) and for the controls (66.53 ± 49.85, 66.53 ± 26.33 and 81.74 ± 43.12) and the difference was statistically significant only for the control group, for all cisplatin concentrations (p = 0.0175, p = 0.0002 and p = 0.0002, respectively). Considering the different repair times (1h, 2.5h and 5h), after removal of cisplatin at different concentrations, there was an increase in the mean frequency of Comets for both melanoma patients (93.88 ± 33.7, 101.75 ± 35.7 and 99.31 ± 32.30) and for the controls (92.45 ± 38.4, 100.82 ± 38.8 and 100.81 ± 31.7), and the difference was statistically significant when the repair Comet score was compared to the basal DNA damage observed in patients (p <0.001) and controls (p <0.001). Similar results were observed when the Comet scores of repair times were compared to the Comet scores obtained after treatment with cisplatin in patients (71.09 ± 48.2, p <= 0.005) and controls (71.59 ± 40.5, p <= 0.005). The results seem to indicate a similar pattern of response to cisplatin and DNA repair in both groups of subjects evaluated. The period of incubation of the cells after cisplatin removal and the number of individuals studied may have influenced the results. The lymphocytes\' response, in vitro, to cisplatin may not be representative of the in vivo effect of tumor cell. However, the identification of markers of response to treatment with chemotherapy from peripheral blood lymphocytes may be an important research strategy in clinical practice, including melanoma.

A miosina Va é uma proteína motora envolvida no transporte e posicionamento de vesículas, organelas e mRNA. Além disso, postulou-se que a miosina-Va atua no seqüestro do fator pró-apoptótico, Bmf, no citoesqueleto de actina. Pesquisas realizadas em nosso laboratório demonstraram que um fragmento da miosina Va (MVaf), que corresponde ao sítio ligante de DLC2-Bmf, é capaz de induzir intensa apoptose em células de melanoma e de carcinoma in vitro. O presente trabalho teve por objetivo principal avaliar o potencial do MVaf como agente antitumoral, através de abordagens de terapia gênica em modelo animal. Foram geradas linhagens estabilizadas e com expressão controlada pelo sistema Tet-ON onde a expressão de EGFP ou EGFP-MVaf é induzida com a adição de doxiciclina. Essas linhagens foram testadas quanto à porcentagem de morte por apoptose e ativação de caspases. Tumores foram induzidos em camundongos C57BL/6 por inoculação subcutânea de células tumorigênicas positivas ou não para a expressão de EGFP-MVaf. Também foram utilizadas linhagens de fibroblasto embrionário murino selvagem (MEFs WT) e nocautes para os fatores Bim/Bmf e Bax/Bak (MEFsBim-/-,Bmf-/-; MEFsBax-/-,Bak-/-) para estudos do mecanismo de ação do fragmento da miosina Va. Observou-se que a adição de butirato de sódio potencializa a expressão de EGFP-MVaf e, conseqüentemente, o efeito pró-apoptótico desse fragmento e que essas células são mais sensíveis aos quimioterápicos etoposídeo e taxol, apresentando maior susceptibilidade à apoptose. Verificou-se que a expressão de EGFP-MVaf em células de tumores de melanoma induzidos em camundongos C57BL/6J dificulta o crescimento desses tumores. Quanto ao estudo com MEFs, observou-se que células nocautes para os fatores pró-apoptóticos Bim/Bmf e Bax/Bak são menos susceptíveis à morte induzida pelo fragmento da miosina Va. Indução da expressão de MVaf desencadeia a liberação da proteína proapoptótica Smac (fusionada ao repórter fluorescente Cherry) do espaço intermembranas da mitocôndria para o citoplasma sugerindo que a morte apoptótica induzida por MVaf requer a permeabilização da membrana mitocondrial externa (MOMP). Concluindo, os dados apresentados aqui nos permitem propor o MVaf como uma molécula promissora para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas contra o câncer. / Myosin Va is a motor protein involved in the transport and positioning of vesicles, organelles and mRNA. Additionally, myosin-Va has been implicated in the sequestering of a proapoptotic factor, Bmf, to the actin cytoskeleton. Research in our laboratory demonstrated that a fragment of myosin Va (MVaf), which corresponds to the binding site of DLC2-Bmf, is capable to induce intense apoptosis in melanoma and carcinoma cells in vitro. Here, our goal was to assess the potential of MVaf as antitumor agent, through gene therapy approaches in animal models. We generated Tet-ON controlled B16-F10 melanoma cells whose expression of EGFP or EGFP-MVaf is induced with the addition of doxycycline. These cells were tested for apoptotic death and activation of caspases, and were used to induce tumors in C57BL/6J mice by subcutaneous inoculation. We also used cell lines of murine embryonic fibroblasts, wild-type (MEFs WT) and knockouts for the proapoptotic proteins Bim/Bmf or Bax/Bak (MEFsBim-/-,Bmf-/-, MEFsBax-/-,Bak-/-), to study the mechanism by which MVaf induces apoptosis. We observed that addition of sodium butyrate to the cultures enhances the EGFP-MVaf expression and, consequently, the pro-apoptotic effect of this fragment. Treated cells were more sensitive to the chemotherapeutic drugs etoposide and taxol, showing a higher susceptibility to apoptosis. Moreover, in vivo induction of EGFP-MVaf expression retards growth of B16-F10 melanoma tumors in mouse model. As for the study with MEFs, we observed that cells knockout for the proapoptotic factors Bim/Bmf or Bax/Bak are less susceptible to death induced by MVaf than wild-type MEFs. Accordingly, we showed that MVaf expression triggers release of the proapoptotic protein Smac (tagged with the fluorescent protein Cherry) supporting the involvement of the mitochondrial outer membrane permeabilization (MOMP) in the MVaf-induced apoptotic death response. In conclusion, these data lead us to propose MVaf as a promising molecule for the development of new therapeutic approaches against cancer.

A Braquiterapia oftálmica utiliza radionuclídeos, como o Rutênio-106 no tratamento de melanomas uveais e outras neoplasias oculares. Para realização desse procedimento é necessária uma interação da equipe multidisciplinar principalmente entre a Oftalmologia, Oncologia, Radioterapia, Física Médica e Enfermagem, envolvendo estrutura física e profissionais qualificados para garantir os processos e resultados do procedimento. Este estudo tem o objetivo de avaliar os primeiros tratamentos de braquiterapia oftálmica com Rutênio-106 e também estabelecer protocolos e processos para implementação da técnica em um Hospital Geral. Os resultados obtidos para os primeiros 11 casos tratados entre 2015 e 2017, sendo 10 melanomas e 1 hemangioma, evidenciaram baixa toxicidade aguda. Foram analisados 5 pacientes com seguimento de 5 a 13 meses. Houve regressão da lesão em todos os pacientes, com média de 28% no ápice e 12% na base no período de até 12 meses, sendo observado uma regressão progressiva durante o período de avaliação. Os protocolos foram utilizados e validados durante todas as etapas do tratamento. O uso do Ru-106 mostra-se alternativa viável no tratamento de lesões oculares, sendo primordial a capacitação e integração da equipe e seguimento de protocolos para o êxito do tratamento. / Ophthalmic Brachytherapy uses radionuclides, such as Ruthenium-106 in the treatment of uveal melanomas and other ocular tumors. For this procedure is necessary a multidisciplinary interaction between Ophthalmology, Oncology, Radiotherapy, Medical Physics and Nursing, involving physical structure and qualified professionals to guarantee the processes and results of the procedure. This study aims to evaluate the first ophthalmic brachytherapy treatments with ruthenium- 106 and also to establish protocols and processes for the implementation of this service in a General Hospital. The results obtained for the first 11 cases treated between 2015 and 2017, being 10 melanomas and 1 hemangioma, showed low acute toxicity. Five patients were followed up for 5 to 13 months. There was regression of the lesion in all of these patients, with a mean of 28% at the apex and 12% at the base in the period close to 1 year, with a progressive regression during the evaluation period. The protocols were used and validated during all stages of treatment. The use of 106-Ru is a viable alternative in the treatment of ocular tumors, being the team qualification and the correct follow-up of the protocols crucial for the treatment success.

A medida e o controle de elementos químicos, majoritários ou traço, em tecidos e fluídos biológicos, vem sendo utilizada há muito tempo para diagnósticos médicos, em avaliações de saúde, estado nutricional e para prevenção e acompanhamento de doenças. Em muitos casos tal relação já foi solidamente estabelecida, mas no estudo de neoplasias, ainda se busca relação entre teores químicos elementares e vários tipos (ou estágios) de câncer. Nesse tipo de estudo utilizam-se métodos espectroscópicos multi-elementares de altíssima sensibilidade ainda não disponíveis rotineiramente em laboratórios clínicos. Neste trabalho, buscaram-se alterações na concentração de elementos químicos majoritários e traço em soro sanguíneo de pacientes com melanoma, por meio de análises pelos métodos PIXE e HR-ICPMS como auxiliar de diagnóstico desta neoplasia, uma vez que sua detecção em estágios iniciais aumenta a probabilidade de recuperação. A técnica PIXE (Proton Induced X-ray Emission) de análise multi-elementar baseia-se na detecção de raios X característicos, enquanto o HR-ICPMS (High Resolution Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry) é um espectrômetro de massa de alta resolução. As amostras de sangue de 30 pacientes e 116 doadores sadios foram coletadas no Hospital São Paulo (protocolos CEP 1036/08 UNIFESP) em tubos de vidro sem aditivos, sendo o soro separado por meio de centrifugação a 4500 rpm durante 15 minutos. Foram identificados e quantificados um total de 10 elementos: 4 por HR-ICPMS (Mg, Se, Cu e Zn) e 8 por PIXE (P, S, Cl, K, Ca, Br, Cu e Zn). Os métodos analíticos foram aferidos com os materiais de referência QMEQAS06S-06, QMEQAS08S-06 e NIST 1577b. A precisão analítica variou de 3 % a 9 % para ambas as técnicas. As informações clínicas relevantes dos pacientes foram incluídas na análise (tipo histológico do tumor; nível de melanoma; escala de Breslow em profundidade; número de linfonodos; presença ou ausência de mitose e/ou ulceração). A avaliação do grupo controle mostrou diferentes concentrações de P e Mg para indivíduos com idade acima ou abaixo de 40 anos. Os teores de P, S, Ca, Cu e Zn em indivíduos saudáveis apresentaram diferenças com o gênero, evidenciando a necessidade de inserir estas variáveis na análise caso-controle. As concentrações de K, S, Ca e Se apresentaram diferença entre os grupos controle e melanoma, quando consideradas as variáveis clínicas dos pacientes (p<0,05). A necessidade de estratificação por idade, gênero e estágio da neoplasia, reduziu criticamente o já limitado espaço amostral, comprometendo a interpretação das pequenas diferenças nas concentrações elementares encontradas. Os resultados encontrados para a população sadia concordaram com os valores publicados na literatura e colaboraram para o fortalecimento do banco de dados de concentrações elementares em soro da população brasileira. / Recording chemical elements, either as major or trace quantities, in tissues and biological fluids is regularly being used for medical diagnosis, health assessments, nutritional status, and for the monitoring and prevention of diseases. In many cases, such relationship is firmly established, but for cancer, there is still a search for a relationship between chemical elements and various types (or stages) of cancer. In this kind of study, highly sensitive multielemental spectroscopic methods are used which are not yet routinely available in clinical laboratories. In this study, changes in the concentration of chemical elements in serum of melanoma patients were sought by means of PIXE and HR-ICPMS analysis as an aid to early diagnosis, and to help increasing the likelihood of pacients recovery. The multi-elemental PIXE method (Proton Induced X-ray Emission) relies on the detection of characteristic X-rays of the sample, while the HR-ICPMS (High Resolution Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry) is a high resolution mass spectrometer. Blood samples from 30 patients and 116 healthy donors were collected at the Hospital (protocols CEP 1036/08 UNIFESP) in glass tubes without additives, and the serum separated after centrifugation for 15 minutes at 4500 rpm. A total of 10 elements were measured: 4 by HR-ICPMS (Mg, Se, Cu and Zn), 8 by PIXE (P, S, Cl, K, Ca, Br, Cu and Zn). The analytical methods were assessed analyzing reference materials QMEQAS06S-06, QMEQAS08S-06 and NIST 1577b. The analytical precision ranged from 3 % to 9 %. Relevant clinical information of patients has also been included in the statistical analysis (histological type of tumor, level of melanoma, Breslow depth scale, number of lymph nodes, presence or absence of mitosis and/or ulceration). The evaluation of the control group showed different concentrations of P and Mg for individuals aged above and below 40 years. The P, S, Ca, Cu and Zn in healthy individuals differed according to the gender, highlighting the need of inserting the variables age and gender in the case-control analysis. The concentrations of K, S, Ca and Se showed differences between the control group and the melanoma, when considering the clinical variables of the patients (p <0.05). The need for stratification by age, gender and stage of cancer, critically reduced the already limited number of samples, compromising the interpretation of the small differences in elemental concentrations found. The results for the healthy population agreed with the values reported in the literature and contributed to strengthen the database of elemental concentrations in serum of the Brazilian population.

Melanoma é o câncer mais agressivo e a mutação BRAF V600E é a mais frequente entre os pacientes. O vemurafenibe foi o primeiro inibidor específico desta mutação aprovado pela Food and Drug Administration. Entretanto, após cerca de seis meses há recidiva e superar os mecanismos de resistência responsáveis por este fenômeno ainda é um desafio. A curcumina é um tumérico com características antitumorais e anti-inflamatórias, entretanto sua baixa biodisponibilidade e estabilidade limitam seu uso e por isso impulsionaram a busca por análogos capazes de serem eficientes e comercializados. O DM-1, é um análogo monocetônico que apresentou efeitos antiumorais in vitro e in vivo em estudos anteriores. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos citotóxicos do DM-1 em células de melanoma sensíveis (naive) e resistentes ao vemurafenibe, bem como na modulação de metaloproteinases. As células de melanoma foram tratadas com diferentes concentrações de DM-1, e este composto foi citotóxico para linhagens sensíveis e resistentes ao vemurafenibe, além de induzir parada de ciclo celular em G1/G0 e diminuir o número de colônias, entretanto ele não foi seletivo em ensaios de citotoxicidade realizados com melanócitos e fibroblastos. O tratamento dessas células em doses subtóxicas resultou na modulação de metaloproteinases importantes no processo de invasão celular. O DM-1 reduziu as concentrações das metaloproteinases -1, -2 e -9 (MMP-1, -2 e -9) em um ensaio de quantificação de MMPs e a atividade das MMP-2 e -9 em um ensaio de zimografia de maneira célula dependente. As modulações negativas do inibidor de MMP TIMP-2 e MMP-14 para SKMEL-28 naive foram associadas a diminuição das atividades de MMP-2 e -9, enquanto que as modulações positivas para SKMEL-19 naive foram relacionadas ao aumento de MMP-2. Este composto ainda inibiu a migração das células e a formação de tubos por células endoteliais. / Malignant melanoma is the most aggressive cancer and the BRAF V600E mutation is the most frequent among patients. Vemurafenib was the first specific inhibitor for this mutation approved by Food and Drug Administration. Therefore around six months later there is relapse and overcoming it is still a challenge. Curcumin is a turmeric and it has been deeply researched because of its anti-inflammatory and antitumoral effects. However the low stability limits its use, therefore, encouraged the investigation of analogues capable to be efficient and commercialized. DM-1 is a monoketone curcumin analog and it showed antitumoral effects in vitro and in vivo in previous studies The aim of this project was to evaluate the cytotoxical effects of DM-1 for vemurafenib responsive (naïve) and resistant melanoma cells, as well as metalloproteinases modulation. Melanoma cells were treated with different DM-1 concentrations, and this compound was cytotoxic for responsive and resistant cell lines, besides inducing G1/G0 cell cycle arrest and reducing the number of colonies, nonetheless it was not selective in assays performed with melanocytes and fibroblasts. Subtoxic treatment of those cells modulated important MMPs in the cell invasion process. DM-1 reduced metalloproteinases -1, -2 and -9 (MMP-1,-2 and -9) in a quantification assay, and MMP-2 and -9 activities by zymography in a cell-dependent way. Negative modulations of MMP inhibitor TIMP-2 and MMP-14 for SKMEL-28 naïve were associated with MMP-2 and -9 reduced activities, whereas positive modulations for SKMEL-19 naïve were correlated to MMP-2 increase. Furthermore, this compound reduced migration of those cells and endothelial cell tube formation.

Compostos de cobre(II) dinucleares, contendo ligantes nitrogenados, foram preparados, caracterizados por diversas técnicas espectroscópicas (UV/Vis, IV e EPR) e tiveram sua reatividade frente a células melanomas (B16F10 e TM1) verificada. Estes compostos são miméticos da tirosinase, enzima contendo em seu sítio ativo dois íons de cobre, presente em bactérias, plantas, animais e humanos, sendo responsável pela oxidação de fenóis a catecóis e destes às correspondentes quinonas. São enzimas relacionadas também à melanogênese, isto é, síntese de melanina, com formação de polímeros eumelanina e feomelanina, responsáveis pela pigmentação de nossa pele, olhos e cabelos. Os compostos mononucleares correspondentes foram também preparados e estudados, para efeito de comparação. Os resultados indicaram que os complexos dinucleares são mais ativos, tanto como miméticos da tirosinase, quanto em relação à citotoxicidade frente a melanomas, que os análogos mononucleares, mostrando que a estrutura é um fator determinante de ambas as atividades biológicas aqui estudadas. Ensaios de interação com as biomoléculas DNA e albumina humana (HSA) através de espectroscopia de UV/Vis e dicroísmo circular (CD) respectivamente, também foram realizados e complementaram os estudos. Atividade nuclease significativa foi observada para os complexos dinucleares, em presença de peróxido de hidrogênio, através de ensaios de clivagem em gel de agarose, buscando uma possível elucidação dos mecanismos de ação dos complexos em estudo. / Dinuclear copper(II) complexes with nitrogenated ligands were prepared, characterized by spectroscopic techniques (UV/Vis, IR and EPR) and had their reactivity verified towards melanoma cells (B16F10 and TM1). These compounds are tyrosinase mimics, an enzyme present in bacteria, fungi, animals and humans, capable of catalyzing the oxidation of phenols to catechols, and catechols to the corresponding quinines, and containing two copper ions in its active site. Tyrosinases are also enzymes related to melanogenesis, assisting the formation of eumelanin and pheomelanin polymers, responsible for the colour of our eyes, skin and hair. The corresponding mononuclear copper(II) complexes were also prepared and comparative studies were performed. The results indicated that the dinuclear species are more reactive than the mononuclear ones, both as tyrosinase mimics as in cytotoxicity damage to melanoma cells, showing that the structure of such species is a determining factor of both biological activities. Experiments at the interactions of these complexes with the biomolecule DNA and human serum albumim, were also conducted by UV/Vis and circular dichroism spectroscopies, respectively, and complemented the previous studies. Nuclease activity was also assessed, in the presence of hydrogen peroxide, monitored by cleavage assays in agarose gel, in order to contribute to the elucidation of the mechanisms of action of these complexes