PACHECO, Isabela Alves. Avaliação clinicopatológica de pacientes portadores de tumores malígnos de origem não epitelial em região de cabeça e pescoço no município de Fortaleza- Ce. 2010. 76 f. Dissertação (Mestrado em Odontologia) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-Ce, 2010. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2011-12-08T16:10:52Z No. of bitstreams: 1 2010_dis_iapacheco.pdf: 505123 bytes, checksum: 1efe750481410012869a3b0a9642ecd9 (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-02-01T14:06:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_dis_iapacheco.pdf: 505123 bytes, checksum: 1efe750481410012869a3b0a9642ecd9 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-02-01T14:06:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_dis_iapacheco.pdf: 505123 bytes, checksum: 1efe750481410012869a3b0a9642ecd9 (MD5) Previous issue date: 2010 / Malignant tumors of non-epithelial origin are considered rare in the head and neck region and they can show great morbidity and mortality. The aim of this study was to investigate the cases of sarcomas and melanomas in the head and neck region over the period from 1999 to 2008, in specialized centers located in the Municipality of Fortaleza. The data were collected from the register books of surgery of the head and neck and patient reports at the evaluated centers. Fifty-four cases were observed, being 36 sarcomas and 18 melanomas. As per the evaluation of the sarcomas, we have observed that the most assailed individuals were men with brown skin, ranging from 20 to 59 years old, with median age of 39.7. The relation man/woman was 1.7:1. The most prevailing histological type was the rhabdomyosarcoma, and the most attacked areas were the face and the cervical region. And as per the melanomas, adult men were also prevailing, ranging from 20 to 59 years old, with median age of 54.6. It has also been verified equal assailment in the brown and white races, with 33.3% in each one. The relation man/woman was 1.25:1. The most prevailing histological type was the superficial spreading melanoma, and the face skin was the most frequent location. In the evaluation of the origin, there was similarity in both diseases, being approximately half the patients in the capital city, and half in the state´s hinterland. As concerning the monitoring, the greatest part of the sample came from patients alive without evidence of the disease from the last consultation, corresponding to 41.6% in sarcomas and 44.5% in melanomas. The variation of therapy has also been observed in both groups, being the most common types of treatments, the association of surgery, radiotherapy and chemotherapy and surgery and radiotherapy for sarcomas and surgery, followed by surgery and radiotherapy for melanomas. Although malignant tumors of non-epithelial origin are rare in the head and neck region, they can show great morbidity and mortality and it is necessary the better understanding of their clinicalpatological aspects, in order to establish better treatment and life quality to these patients. / Tumores malignos de origem não epitelial são considerados raros na região de cabeça e pescoço e podem apresentar grande morbidade e mortalidade. Este estudo teve o objetivo de fazer um levantamento dos casos de sarcomas e melanomas em região de cabeça e pescoço no período de 1999 a 2008, em três centros especializados no Município de Fortaleza, Ceará. A coleta de dados foi feita com base nos livros de registros das cirurgias de cabeça e pescoço e dos prontuários dos centros avaliados. Foram observados 54 casos, sendo 36 sarcomas e 18 melanomas. Quanto à avaliação dos sarcomas, observamos que os indivíduos mais acometidos foram homens adultos, da raça parda, na faixa etária de 20 a 59 anos, com idade média de 39,7. A relação homem/mulher foi de 1,76:1. O tipo histológico mais prevalente foi o rabdomiossarcoma, e as localizações mais acometidas foram face e região cervical. Em relação aos melanomas, homens adultos também foram predominantes, na faixa etária de 20 a 59 anos, com idade média de 54,6. Verificou-se igual acometimento nas raças parda e branca, com 33,3%, cada uma. A relação homem/mulher foi de 1,25:1. O tipo histológico mais prevalente foi o melanoma de disseminação superficial, e a pele da face foi a localização mais frequente. Na avaliação da procedência, houve semelhança em ambas as doenças, sendo aproximadamente metade dos pacientes da capital e metade do interior do estado. Quanto ao acompanhamento, a maior parte da amostra foi de pacientes vivos sem evidência de doença na última consulta, correspondendo a 41,6% nos sarcomas e 44,5% entre os melanomas. A variação de terapia também foi observada em ambos os grupos, sendo os tipos mais comuns de tratamento a associação de cirurgia, radioterapia e quimioterapia e cirurgia e radioterapia para sarcomas, e cirurgia, seguida da associação de cirurgia e radioterapia para melanomas. Apesar de os tumores malignos de origem não epitelial em cabeça e pescoço serem lesões raras, eles apresentam grande morbidade e mortalidade e dessa forma, necessita-se de que seus aspectos clinicopatológicos sejam estudados e conhecidos, sempre com o objetivo de melhorar as formas de tratamento dessas lesões, garantindo assim maiores chances de cura e melhor qualidade de vida para os pacientes acometidos.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2017 / Made available in DSpace on 2017-09-19T04:12:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 347028.pdf: 2777968 bytes, checksum: e2e99a611a7b5f21296a003c94110659 (MD5) Previous issue date: 2017 / O melanoma é o mais grave tipo de câncer de pele pela possibilidade de metástase e desde 1975, a dacarbazina continua a ser o tratamento padrão, mesmo apresentando muitas reações adversas. O número de candidatos a agentes antitumorais vem crescendo a cada ano, porém a falta de modelos in vitro representativos de um microambiente tumoral não acompanha este crescimento. A cultura tridimensional (3D) se mostra um dos melhores modelos in vitro para mimetizar o microambiente tumoral. Neste trabalho, utilizando a estratégia de formação de esferoide, desenvolveu-se um modelo celular 3D de melanoma murino isolado ou associado a macrófagos e fibroblastos. Para o melanoma, um modelo assim ainda não foi descrito na literatura. Dentre as tentativas, o modelo foi padronizado utilizando gel de agarose 2% como base e uma densidade celular de 1,2×104/poço para a formação dos esferoides. Os esferoides formados apresentaram tamanho médio de 300 µm compatível com a literatura. Além disso, o heteroesferoide composto pelas três linhagens celulares (melanoma, macrófagos e fibroblastos) mostrou-se mais rígido e estável aparentemente, em comparação com as outras condições testadas, características estas provavelmente provenientes da alta produção de matriz extracelular. Os esferoides supostamente demonstraram a formação de duas zonas: uma periférica de células viáveis e outra interna de células necróticas, que foram confirmadas pela contagem de células, a qual diminuiu no sétimo dia em relação ao quarto dia de cultivo 3D e pela presença de grandes espaços vazios no interior dos esferoides, observados pela microscopia. O perfil inflamatório dos macrófagos presentes nos esferoides foi induzido usando lipolissacarídeo (LPS) para polarização M1 e dexametasona (DEX) para polarização M2. Após caracterização dos esferoides, estes foram incubados com o sal de isotiourônio MF03 e a dacarbazina. Os resultados revelaram que o sal de isotiourônio MF03 mostrou-se mais citotóxico que a dacarbazina no modelo 3D de melanoma. Adicionalmente, observou-se diferenças importantes em termos de citotoxicidade das moléculas, comparando-se o modelo bidimensional (2D) com o 3D. Diante dos resultados, conclui-se que foi desenvolvido um modelo 3D de melanoma adequado para a triagem de possíveis agentes antitumorais, sendo que o sal de isotiourônio MF03 mostrou-se promissor para o tratamento antitumoral de melanoma.<br> / Abstract: Melanomas is the most severe type of skin cancer, and since 1975, dacarbazine remains the standard treatment for most patients, even presenting many adverse reactions. The number of candidates to antitumor agents is increasing every year, although the lack of in vitro models to represent the tumor microenvironment disrupts the process. Three-dimensional (3D) culture is one the best in vitro models to mimic the tumor microenvironment. In this work, using spheroid strategies, a 3D murine melanoma cellular model isolated or associated with macrophages and fibroblasts was developed. Melanoma model has not been described previously. Among the attempts the model was standardized using agarose gel 2 % and a cell density of 1,2×104/well to spheroid formation. Spheroids size was around 300 µm, as described in the literature. In addition, heterospheroids composed of three cell lines (melanoma, macrophages and fibroblasts) showed more rigid and stable apparently when compared with other tried conditions, probably due to high extracellular matrix production. Spheroids supposedly showed two different regions: a peripheral zone containing viable cells and an internal zone containing necrotic cells which was demonstrated by the decrease in the number of cells on the seventh day when compared with the day four, and by presence of large empty spaces inside the spheroids, visualized by microscopy. The inflammatory profile associated with the macrophages-containing spheroids was induced using lipopolysaccharide (LPS) to M1 polarization and dexamethasone to M2 polarization. Following the characterization, spheroids were incubated with MF03 isothiouronium salt and dacarbazine. The results showed that MF03 was most cytotoxic than dacarbazine using the 3D melanoma model. Additionally, it was observed significant cytotoxic differences between bidimensional (2D) and 3D models. In conclusion, we developed a 3D melanoma model to improve the screening of new antitumor agents as well as the promising application of MF03 as a new anti-melanoma.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2017-10-17T03:19:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 347966.pdf: 2720589 bytes, checksum: 4de950d1ea96eee16d2f573fe9b0cfaa (MD5) Previous issue date: 2016 / O Melanoma é encontrado na camada basal da epiderme, e consiste em uma neoplasia maligna dos melanócitos. As mutações frequentemente encontradas em pacientes com câncer são do tipo B-RAF e N-RAS. Neste sentido, ter como alvo mutações que são super expressas em linhagens tumorais de melanoma é extremamente importante para melhorar a eficiência dos tratamentos. Anos atrás medicamentos foram aprovados para auxiliar o tratamento do melanoma, porém limitações foram mostradas por pacientes como efeitos colaterais e resistência aos medicamentos. Em 2014, a FDA (Food and Drug Administration) aprovou uma nova estratégia para tratamento de melanoma, o pembrolizumabe, o qual é baseado em um anticorpo monoclonal contra a proteína 1 (PD-1) relacionada a morte celular programada. Recentemente, em 2016 a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa) aprovou o uso do medicamento Tafinlar (dabrafenibe), um novo tratamento oral para pacientes com melanoma metastático ou irressecável, oriundo de mutação positiva dos genes BRAF V600E. Embora o tratamento de melanoma tenha tornado-se um grande desafio a superar, este trabalho tem como objetivo ampliar as possibilidades terapêuticas para o melanoma, prospectando novas moléculas ativas. Especificamente, avaliou-se o potencial antitumoral e antiangiogênico de um novo complexo mononuclear de Ga(III) com ligante não-simétrico em linhagens celulares de melanoma humano (SK-MEL-28 e SK-MEL-147) com diferentes mutações e linhagem imortalizada de células endoteliais de veia umbilical humana (HUVEC). O ligante não-simétrico H3LM3 e o complexo mononuclear de H3LM3 Ga apresentaram CC50 (concentração do composto que causa 50% de morte celular) entre 5 e 25 µM quando expostas as linhagens tumorais, similarmente ativos quando comparados ao vemurafenibe, um quimioterápico de referência. Quando as CC50 destes composos foram avaliadas em linhagens tumorais e não tumorais, não foi observada citotoxicidade para a linhagem celular não tumoral, em que 80% de células viáveis foram detectadas. Em relação a ação dos compostos sobre a atividade de caspases, os dados demonstram que não houve aumento da atividade de nenhuma das caspases, uma indicação de que a morte celular foi independente de caspases. De acordo com os resultados de um conjunto de ensaios específicos pode-se sugerir que o efeito citotóxico e antiproliferativo se dá através da indução de estresse oxidativo. Adicionalmente, foi mostrado que os compostos apresentaram atividade antimetastática, ao inibir a proliferação e invasão celular, bem como a propriedade de bloqueio da angiogênese. O complexo mononuclear de H3LM3 Ga sobre linhagem tumoral SK-MEL 28 apresentou a redução da expressão do gene VEGF em aproximadamente 20% em comparação ao controle. Concluindo, os compostos testados não somente apresentaram atividade citotóxica significativa, como também demonstraram efeitos anti-metastático e antiangiogênico in vitro/in vivo. De acordo com os dados obtidos, demonstra-se uma nova linha na exploração da atividade biológica de promissores agentes antitumorais.<br> / Abstract : Melanoma is found in the basal layer of the epidermis and consists in a malignant tumor of melanocytes. Mutations often found in patients with cancer are B-RAF and N-RAS type. Thus, targeting mutations which are super expressed in tumor melanoma strains are extremely important to improve the treatment efficacy. Years ago drugs were approved to help the melanoma treatment, however, some limitations were shown by patients such as side effects and drug resistance. In 2014 the FDA (Food and Drug Administration) approved a new strategy to treat melanoma, the pembrolizumab, which is based on a monoclonal antibody against protein 1 (PD-1) related to programmed cell death. Recently, in 2016 the National Agency of Sanitary Surveillance (ANVISA) approved the use of the drug Tafinlar (dabrafenib), a new oral treatment for patients with metastatic or unresectable melanoma, from a positive mutation of BRAF V600E genes. Although the melanoma treatment became a great challenge to overcome, this work aims to broaden the therapeutic possibilities for melanoma by prospecting new active molecules. Specifically, antitumor and antiangiogenic potential of a novel mononuclear Ga(III) complex with the non-symmetric ligand in human melanoma cell lines (SK-MEL-28 and SK-MEL-147) was assessed with different mutations and immortalized lineage of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). The non-symmetric linker H3LM3 and the mononuclear H3LM3 Ga complex showed CC50 (compound concentration causing 50% cell death) between 5 and 25 µM when exposed to tumor strains, similarly actives when compared to vemurafenib, a reference chemotherapeutic. When CC50 of these compounds were evaluated in tumoral and non-tumoral cell lines, they did not show cytotoxicity to the non-tumor cell line, in which 80% of viable cells were detected. Regarding the action of the compounds on the activity of caspases, the data demonstrated that there was no increase in the activity of any of the caspases, assuming that cell death was independent of caspases. According to the results of a specific set of tests the cytotoxic and antiproliferative effects occur by the induction of oxidative stress was suggested. In addition, the compounds exhibited anti-metastatic activity, inhibiting cell proliferation and invasion, as well as blocking angiogenesis. The mononuclear H3LM3 Ga complex on SK-MEL 28 tumor line showed a reduction of VEGF gene expression by approximately 20% compared to control. In conclusion, the compounds tested not only showed significant cytotoxic activity but also demonstrated in vitro/in vivo anti-metastatic and antiangiogenic effects. According to the data obtained, a new line in the exploration of biological activity as promising antitumor agents was evidenced.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2017-12-05T03:10:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 349061.pdf: 3005507 bytes, checksum: a29b38fab534d7f675c6c6b3e5dd0eb6 (MD5) Previous issue date: 2017 / O câncer representa um problema de saúde mundial. Apesar dos constantes esforços e significativos avanços na pesquisa e desenvolvimento de novos agentes quimioterápicos, a recidiva da doença devido à heterogeneidade do tumor e a resistência aos quimioterápicos permanece sendo um grande desafio na busca pela cura. Nesse contexto, os sais de isotiourônio vêm chamando atenção por diversas atividades biológicas, entre elas promissora atividade antitumoral. Em estudo anterior desenvolvido por nosso grupo de pesquisa foram testadas 28 moléculas com potencial atividade antitumoral, entre as quais se destacou o sal de isotiourônio brometo de (Z)-2-(isotioureidometil)-2-pentenoato de metila (SI-MF08) por apresentar significativa citotoxicidade em linhagem tumoral in vitro e um mecanismo de ação de morte celular que parece ativar diferentes sinalizações que levam à morte da célula tumoral. Esta ação multialvos pode vir a ser uma vantagem na busca por um futuro fármaco, possibilitando contornar a resistência ao tratamento desenvolvida por células tumorais. Assim, o objetivo deste trabalho foi caracterizar a citotoxicidade do SI-MF08 in vitro e realizar estudos pré-clínicos para avaliar a potencial atividade antitumoral. O primeiro capítulo deste trabalho mostra os estudos em linhagem celular de leucemia e mecanismo de ação envolvido na citotoxicidade do composto. Foi possível compreender que a molécula atua ativando a via extrínseca da apoptose via receptor de membrana Fas e ativação de caspases -8 e -3, além de causar bloqueio mitótico em fase G2/M do ciclo celular e geração de espécies reativas de oxigênio que leva ao estresse de retículo endoplasmático e perda do potencial de membrana mitocondrial. O estresse oxidativo gerado causa danos irreversíveis nas mitocôndrias levando à ativação de formação de vesículas ácidas para eliminação dessas organelas no intuito de reestabelecer a homeostasia da célula. O segundo capítulo do trabalho teve como objetivo avaliar a atividade citotóxica do composto em linhagem celular de melanoma para posterior aplicação em modelo de melanoma in vivo. Observou-se que o SI-MF08 também apresentou citotoxicidade para a linhagem celular de melanoma e o mecanismo de morte envolvido no processo foi semelhante ao encontrado nos resultados do primeiro modelo. O terceiro capítulo do trabalho refere-se aos estudos de citotoxicidade do composto em camundongos na busca pela dose máxima que não apresenta efeitos significativos. Dessa forma, observou-se no estudo de dose única que a dose limite para ser administrada é de 15 mg/kg do composto. Em seguida, no estudo de doses repetidas de 10 dias observou-se que a dose de 12 mg/kg de SI-MF08 representa a dose máxima de trabalho. O quarto capítulo deste trabalho teve como objetivo avaliar a atividade antitumoral do SI-MF08 em camundongos portadores de melanoma. Os animais administrados com a dose de 7,5 mg/kg do composto não apresentaram os efeitos deletérios da doença como perda de peso e anemia, contudo a dose não foi capaz de melhorar a sobrevida desses animais ou reduzir significativamente o crescimento tumoral. Entretanto a dose de 12 mg/kg não só inibiu os efeitos deletérios da doença como também aumentou a taxa de sobrevida desses animais e reduziu significativamente o crescimento tumoral, de acordo com padrões de institutos internacionais de pesquisa em câncer. / Abstract : Cancer is a global health problem. Despite the efforts and significant advances in the research and development for new chemotherapeutic agents, recurrence of the disease due to tumor heterogeneity and chemotherapy resistance remains a major challenge in the search for the cure. In this context, isothiouronium salts have been attracting attention due to its several biological activities, among those is the promisor antitumor activity. In a previous work performed by our research group, 28 molecules with potential antitumor activity were tested. Among those, the isothiouronium salt methyl (Z)-2-(isothioureidomethyl)-2-pentenoate hydrobromide (IS-MF08) displayed significant cytotoxicity in tumoral cell line and a mechanism that seems to triggers different signals that lead to tumoral cell death. This multi-targeting mechanism may be an advantage in the search for a future drug, making possible to circumvent the resistance to treatment developed by tumor cells. Thus, the objective of this work was to characterize the cytotoxicity of IS-MF08 in vitro and to perform preclinical studies to evaluate the potential antitumor activity. It made possible to understand that the molecule activates the extrinsic pathway of apoptosis via Fas membrane receptor and further activation of caspases -8 and -3, causing mitotic block in the G2 / M phase of the cell cycle and generation of reactive oxygen species that leads to endoplasmic reticulum stress and loss of mitochondrial membrane potential. The oxidative stress generated causes irreversible damage in the mitochondria, leading to the activation of acid vesicles formation in order to eliminate these organelles and reestablish the homeostasis of the cell. The second chapter of the study aimed to evaluate the cytotoxic activity of the compound in melanoma cell line to later application in in vivo melanoma model. IS-MF08 also showed to be cytotoxic to melanoma cell line and the mechanism of death involved in the process was similar to that founded in the results of the first model. The third chapter of the work refers to the cytotoxicity studies of the compound in mice in the search for the maximum dose that has no significant effects. Thus, it has been observed in the single dose study that the dose limit of the compound to be administered is 15 mg/kg. Following, in a 10-day repeated dose study, it was observed that 12 mg/kg of IS-MF08 represents the maximum working dose. The fourth chapter of this work aimed to evaluate the antitumor activity of IS-MF08 in melanoma bearing mice. Animals that were administered with the dose of 7.5 mg/kg of the compound did not exhibit the deleterious effects of the disease as weight loss and anemia, however the dose was not able to enhance the survival rate of these animals or even reduce tumor growth significantly. However, the dose of 12 mg/kg not only inhibited the deleterious effects of the disease but also increased the survival rate of these animals and significantly reduced tumor growth, according to the standards of international cancer research institutes.

Resumo: Importantes efeitos biológicos têm sido descritos para polissacarídeos isolados de diversas fontes, entre estes a ação antitumoral. A atividade biológica de polissacarídeos nativos pode ser potencializada através da sua complexação com metais, como o vanádio. O objetivo do presente estudo foi determinar os efeitos de uma xiloglucana extraída de Copaifera langsdorffii (XGC) e seu complexo com oxovanádio (XGC:VO2+/VO3+) em células de melanoma murino B16F10. Para este fim, foram avaliados a viabilidade e proliferação celular, a indução de morte, a morfologia celular e alguns parâmetros do metabolismo oxidativo destas células. A viabilidade celular, avaliada pelo método do MTT, foi reduzida após o tratamento com XGC (5 a 300 ?g/mL), atingindo uma redução máxima de cerca de 50% após o tratamento com a concentração de 25 ?g/mL, independente do tempo de tratamento (24/48 e 72 horas). Da mesma forma, XGC:VO2+/VO3+ reduziu a viabilidade nas concentrações avaliadas (2,5 a 300 ?g/mL), sendo na menor concentração de 2,5 ?g/mL uma redução de 23%. Semelhantemente, a proliferação celular avaliada pela exclusão do Azul de Trypan foi reduzida em cerca de 46% quando as células foram tratadas com XGC 25 ?g/mL por 24 horas e em 52% quando tratadas com XGC:VO2+/VO3+ 25 ?g/mL, no mesmo período de tempo. No entanto, não foram observadas alterações na progressão do ciclo celular. Ainda, o tratamento com XGC não foi capaz de induzir morte nas células B16F10, ao contrário do tratamento com XGC:VO2+/VO3+ na concentração de 200 ?g/mL, pelo período de 24 horas. No entanto, esta indução de morte não foi associada à liberação de citocromo c. XGC provocou um aumento na velocidade de consumo de oxigênio pelas células, especialmente na concentração de 10 ?g/mL, sendo este aumento de ~64% no estado leak e 132% no estado desacoplado. Além disso, provocou um aumento na produção de lactato, sendo 14% e 17% para as concentrações de 10 e 25 ?g/mL, respectivamente. Ao contrário, XGC:VO2+/VO3+ reduziu em cerca de 50% o consumo de oxigênio e diminuiu significativamente a produção de piruvato, em 34% e ~22% para as concentrações de 5 e 25 ?g/mL, respectivamente, sem aumentar a produção de lactato, indicando que ambos tratamentos interferem no metabolismo de células B16F10. Não foi observado alteração na razão ADP/ATP quando as células foram tratadas com XGC e XGC:VO2+/VO3+, bem como na atividade da enzima hexoquinase . Embora não significativo, observou-se uma tendência em diminuir a expressão da piruvato quinase M2, especialmente após o tratamento com XGC:VO2+/VO3+. Ainda, o complexo na concentração de 200 ?g/mL foi capaz de modular negativamente a expressão da subunidade ? da ATP sintase. Os resultados demonstram que tanto XGC quanto XGC:VO2+/VO3+ apresentam importante efeito antitumoral e sugerem que a adição do metal potencializa este efeito.

Resumo

Resumo não disponível.

The incidence and mortality rate of melanoma have increased greatly worldwide in the last thirty years. There is currently no effective treatment for malignant melanoma. Signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) signaling is constantly activated in human melanoma, which promotes melanoma development and progression. c-Met is a receptor tyrosine kinase (RTK), and hepatocyte growth factor (HGF) is the only known ligand of c-Met. Abnormal activation of HGF/c-Met has been implicated in melanoma metastasis. Both the STAT3 and HGF/c-Met signaling pathways are proposed as melanoma therapeutic targets. The dietary flavonoid quercetin is a bioactive compound that possesses low toxicity and exerts anti-melanoma activities. However, the anti-melanoma mechanisms of quercetin have not been fully understood. In this study, we evaluated the anti-melanoma activities of quercetin and explored the underlying molecular mechanisms. Our results showed that quercetin treatments induced apoptosis, inhibited proliferation, migration and invasion of the melanoma cells. Mechanistic study indicated that quercetin inhibited the activation of STAT3 signaling by interfering with the phosphorylation of STAT3, thus reduced its nuclear localization. Quercetin inhibited STAT3 transcriptional activity, and down-regulated the STAT3 targeted genes such as Mcl-1, MMP-2, MMP-9 and VEGF, which are involved in cell survival, migration and invasion. More importantly, overexpression of constitutively active STAT3 partially reversed the anti-proliferative effect of quercetin, which might be correlated with the impaired effect on quercetin-mediated Mcl-1 and MMP-2 inhibition. Furthermore, quercetin suppressed A375 tumor growth and STAT3 activities in a xenografted mouse model, and inhibited murine B16F10 cells lung metastasis in mice. These findings suggest that inhibition of the STAT3 signaling pathway contributes to the anti-melanoma activities of quercetin. Next we studied the involvement of HGF/c-Met pathway in the anti-metastasis effect of quercetin. Quercetin treatment dose-dependently suppressed HGF-induced migration and invasion of melanoma cells. Further study showed that quercetin down-regulated the mRNA expression level of HGF and suppressed c-Met homo-dimerization. Quercetin also decreased c-Met protein expression, which was associated with reduced expression of fatty acid synthase. In addition, quercetin suppressed the phosphorylation of c-Met and its downstream molecules including Gab1, FAK, PAK and STAT3. Furthermore, overexpression of FAK or PAK significantly reduced the inhibitory effect of quercetin on the migration of melanoma cells. These findings suggest that suppression of HGF/c-Met signaling contributes to the anti-metastatic action of quercetin. Besides c-Met, many other RTKs are activated in melanoma. We then further determined whether quercetin could affect the activity of other RTKs. The phospho-RTK array assay showed that quercetin treatment inhibited the activation of ROR2, Tie2, RYK, ALK, c-Ret, DDR1, DDR2, EphB4, EphA1, EphA2, EphA4 and EphA5 in A2058 cells, and EphA7, RYK, ALK and DDR1 in A375 cells. Further investigations are warranted to verify the array results, and to determine the potential roles of these RTKs in quercetin-mediated anti-melanoma properties. Overall, our results demonstrate that quercetin exerts anti-melanoma activities. The anti-melanoma action of quercetin is, at least in part, due to the inhibition of the STAT3 and HGF/c-Met signaling pathways. Our findings provide further insights into the anti-melanoma activities of quercetin and the underlying molecular mechanisms, suggesting a potential role of quercetin in the prevention and treatment of melanoma.

Orientadora : Sheila M. B. Winnischofer / Co-orientadora : Glaucia R. Martinez / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Defesa: Curitiba, 11/02/2010 / Bibliografia: 91-103 / Resumo: O melanoma e um tipo de tumor que se origina dos melanocitos, sendo altamente resistente as terapias convencionais, especialmente quando se encontra em condicoes de metastase, o que torna necessario a busca por novas alternativas de tratamento. O processo de metastase, em geral, e facilitado pela acao das metaloproteinases de matriz (MMPs), que degradam a matriz extracelular, favorecendo a invasao. Entre os elementos que podem regular a atividade de MMPs esta RECK, uma glicoproteina ancorada a membrana celular. Tendo em vista que as estatinas sao drogas que inibem a sintese de colesterol e isoprenoides podendo interferir na composicao da membrana das celulas, e tambem que varios trabalhos relatam a acao antitumoral destas drogas, inclusive em linhagens celulares de melanoma, este trabalho avaliou o efeito do tratamento de celulas de melanoma humano (SK-MEL 28) com doses variadas de uma estatina (sinvastatina) em relacao aos niveis de RNAm de RECK (e suas isoformas alternativas de splicing), MMPs e TIMPs e aos processos de proliferacao e viabilidade celular. As analises de viabilidade celular (realizadas pelo metodo de cristal violeta) demonstraram que o tratamento com sinvastatina e capaz de provocar reducao de viabilidade das celulas SK-MEL 28, e que esta reducao e dose e tempo dependente. A analise do ciclo celular (realizada por citometria de fluxo) demonstrou a parada das celulas SK-MEL 28 em G1 com a concomitante diminuicao da quantidade de celulas na fase G2-S e o aumento da porcentagem de celulas na fase Sub-G1, apos 72h de exposicao as diferentes doses de sinvastatina. A analise dos perfis de expressao dos genes de interesse foi investigado atraves de ensaios de PCR quantitativo em Tempo Real. Os resultados indicam que nao ocorre modulacao da expressao da forma canonica de RECK (RECK-A) (tanto de mRNA como de proteina), tampouco das isoformas RECK-D e RECK-I apos o tratamento com o agente antitumoral. Ocorre diminuicao dos niveis de RNAm da isoforma B de RECK, apos o tratamento com 1 e 5ƒÊM de sinvastatina por 72h. Nas mesmas doses de sinvastatina observa-se uma tendencia a diminuicao da expressao de MMP-2, MMP-9 e MT1-MMP, embora nao seja estatisticamente significativa. Tambem ocorre tendencia a reducao da quantidade de transcrito de TIMP-1, ao passo que ha reducao significativa da expressao de TIMP-2 apos tratamento com 5ƒÊM de sinvastatina. Foi ainda verificado que as razoes entre as expressoes relativas de RECK-A/MMP-2 e RECK-B/MMP-2 aumentam significativamente quando as celulas SK-MEL 28 sao tratadas com 1ƒÊM de sinvastatina por 72h, sugerindo que o deslocamento do balanco proteolitico a favor de RECK pode contribuir para as acoes antitumorais exercidas pela sinvastatina. Nossos dados sugerem, ainda, que RECK-A e RECK-B sejam regulados de maneira distinta nas celulas de melanoma (pelo menos apos o tratamento com sinvastatina) e talvez a maior ou menor atividade de MMPs nas celulas possa ser devido a uma acao conjunta destas duas isoformas de RECK. Estas observacoes corroboram com os dados obtidos nesse trabalho que mostram uma tendencia evidente de diminuicao de expressao de todas as MMPs avaliadas (MMP-2, MMP-9 e MT1-MMP) apos o tratamento com a droga. / Abstract: Melanoma is a cancer that arises from melanocytes. In its early stages malignant melanoma can be cured by surgical resection, but once it has progressed to the metastatic stage it is extremely difficult to treat and does not respond to current therapies, being necessary the study for new therapeutic approaches to this disease. Matrix metalloproteinases (MMPs) show multiple functions as extracellular/cell surface enzymes, and are broadly recognized for their matrix-degrading ability and involvement in cell motility and invasion. The activity of MMPs is regulated by tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs) and RECK (that’s encodes a membrane-anchored protein which suppresses invasion/metastasis by negatively regulating MMP-2, MMP-9 and MT1-MMP). Considering that statins (in addition to downregulating cholesterol levels) exert effects anti-inflammatory and anti-proliferative in several types of tumor cell lines, the main interest of this study was to correlate the action of a statin (specifically: simvastatin) with the modulation of mRNA levels of RECK, its alternative splicing isoforms, MMPs and TIMPs in the melanoma cell line (SK-MEL 28). The cell viability analysis (through crystal violet staining) shows that simvastatin treatment is able to reduction the cell viability in a dose and time dependent way. The effect of the simvastatin treatment in the cell cycle progression of SK-MEL 28 cells was evaluated by flow citometry. Our results show cell arrest in G1, reduction of percentage of cells in the G2-S phase and increased of percentage of cells in the Sub-G1 phase, after simvastatin treatment by 72h. In order to evaluate the molecular mechanism involved in the anti-proliferative effects of simvastatin in melanoma cells, we analyzed the mRNA expression profiles (through quantitative real time RT-PCR assays) of the RECK gene (canonical form and alternative isoforms, namely: RECK B, RECK D and RECK I), MMPs and TIMPs in SK-MEL 28 cells treated with simvastatin at 1ìM and 5ìM for 72h. The results show no modulation of the expression levels of RECK-A, RECK-D and RECK-I after simvastatin treatment. On the other hand, the RECK-B mRNA levels are significantly reduced upon treatment with 1 and 5ìM of simvastatin. The mRNA expression levels of MMP-2, MMP-9, MT1-MMP and TIMP-1 were not significantly altered. We also observed significantly reduced expression of TIMP-2 after treatment with 5ìM of simvastatin. In addition, the expression ratios RECK-A/MMP-2 and RECK-B/MMP-2 are significantly higher upon treatment with 1ìM of simvastatin by 72h. Our results suggest that RECK-B can be modulated in a distinct manner of the canonical form (RECK-A) after simvastatin treatment and, suggest that the control of MMPs activity could involved the synergistic action of both RECK isoforms (RECK-A and RECK-B) and TIMP-2.

Orientadora : Prof. Glaucia Regina Martinez / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Defesa: Curitiba, 12/02/2010 / Bibliografia: 65-74 / Área de concentração: Bioquímica / Resumo / Resumo: O melanoma e um tipo de cancer bastante relevante ja que as opcoes de tratamento eficazes sao limitadas. A presenca da melanina protege os individuos de pele escura contra os efeitos da radiacao solar, a principal causa de formacao do melanoma pela geracao de especies reativas de oxigenio (ROS). Porem, a melanina tambem pode ter um papel duplo, que e a de gerar especies reativas durante sua sintese que podem prejudicar a celula. Portanto, o objetivo deste trabalho foi a avaliacao das caracteristicas de morte celular causadas por uma ROS, o oxigenio singlete (1O2), nas celulas de melanoma murino B16-F10 com e sem estimulo para producao de melanina e nas celulas de melanocito murino Melan-a. O estimulo para a sintese de melanina foi obtido incubando-se as celulas por 48 horas com meio RPMI 1640 enriquecido com 400 ƒÊmol/L de L-tirosina e 10 mmol/L de cloreto de amonio. A concentracao de melanina aumentou em mais de nove vezes nas celulas B16-F10 e as celulas Melan-a tiveram aumento de menos de duas vezes. Foi utilizado o endoperoxido DHPNO2 10 mmol/L por 2 horas para a geracao de 1O2. Essa condicao causou queda na viabilidade avaliada pelo metodo do MTT para 78,0% nas celulas B16-F10, 70,2% nas B16-F10 estimuladas (B16-F10 Y) e 79,3% nas Melan-a. O ensaio foi feito apos 24 horas do inicio do tratamento com DHPNO2 e a viabilidade caiu para 49,7% nas B16-F10, 53,3% nas B16- F10 Y e 72,5% nas Melan-a. A avaliacao da morte celular utilizando laranja de acridina e brometo de etidio mostrou que apos o tratamento por 2 horas, somente as celulas B16- F10 tiveram aumento significativo na quantidade de celulas em apoptose, e as B16-F10 Y tiveram leve queda na quantidade de celulas viaveis, com tendencia ao aumento de celulas em apoptose. As celulas Melan-a nao tiveram diferenca entre os tratamentos. A liberacao do citocromo c foi determinada por HPLC e mostrou-se que apos 2 horas, as celulas B16-F10 tratadas com 1O2 tiveram mais citocromo c liberado para o citoplasma comparado com o controle. Nos demais grupos, nao houve alteracao com o tratamento. Porem, as celulas controle com mais melanina tiveram maior liberacao de citocromo comparado com o controle das celulas nao estimuladas, mostrando que as celulas estavam sofrendo algum dano inerente da sintese de melanina. A analise da fragmentacao do DNA apos 2 e 24 horas mostrou que nao houve aparecimento de quebras caracteristicas de apoptose pelo tratamento com 1O2 em nenhum dos grupos testados. As celulas B16-F10 Y controle apresentaram DNA fragmentado inespecificamente, representado como um arraste no gel de agarose, que nao foi alterado pelo tratamento. A razao entre ADP e ATP foi quantificada para avaliar o estado energetico da celula, que pode refletir algumas caracteristicas de morte. Nenhuma das celulas teve diferenca estatistica apos o tratamento de 2 horas com 1O2, mas foi observado que as razoes ADP/ATP das celulas controle B16-F10 com e sem estimulo apresentaram valores acima do valor considerado para celulas viaveis/proliferativas. Os resultados da celula Melan-a foram bem proximos dos valores ditos normais. O fluxo de calcio tambem foi avaliado e o 1O2 foi capaz de liberar calcio das reservas intracelulares para o citoplasma nas celulas B16-F10, sendo que nas celulas estimuladas, o aumento do calcio citoplasmatico foi menor, indicando a possivel recaptacao do calcio pela melanina. As celulas Melan-a nao sofreram grandes alteracoes na quantidade de calcio liberado para o citoplasma. Nao houve diferenca na liberacao de AIF em nenhuma das celulas. Em conjunto, os resultados mostram que a sintese da melanina estimulada pela suplementacao do meio foi deleteria as celulas, pois causou fragmentacao no DNA, liberacao de citocromo c e aumentou a razao ADP/ATP para valores considerados de celula em apoptose. Por outro lado, a presenca da melanina parece ter protegido as celulas da acao do 1O2, pois alguns resultados indicam uma tendencia de melhora dos parametros avaliados. / Abstract: Melanoma is a relevant type of cancer since the options for efficient treatment are limited. The presence of melanin protects the dark-skinned people against the effects of solar radiation, the main cause for melanoma development by the generation of reactive species of oxygen (ROS). However, melanin may also have a role on the generation of reactive species during its synthesis, which may harm the cell. So, the objective of this work was the evaluation of the characteristics of cell death caused by a ROS, the singlet oxygen (1O2) on murine melanoma cells B16-F10 with or without stimulation for synthesis of melanin and on murine melanocytes cells Melan-a. The stimulus for the synthesis of melanin was obtained treating the cells for 48 hours with medium RPMI 1640 supplemented with 400 ìmol/L of L-Tyrosine and 10 mmol/L of ammonium chloride. The concentration of melanin increased more than nine times in the B16-F10 cells and the Melan-a cells increase was almost twice the amount of the control. It was used the endoperoxide DHPNO2 10 mmol/L for 2 hours for the generation of 1O2. This condition caused the decrease in the viability determined by the method of MTT to 78% in B16-F10, 70,2% in B16-F10 that were stimulated (B16-F10 Y) and 79,3% in Melana cells. The test was performed after 24 hours from the beginning of the treatment with DHPNO2 and the viability decreased to 49,7% in B16-F10, 53,3% in B16-F10 Y and 72,5 % in Melan-a. The evaluation of cell death using acridine orange and ethidium bromide showed that after the two-hour treatment, only the B16-F10 cells had a significant increase of the number of apoptotic cells, and the B16-F10 Y cells had a slight decrease of the amount of viable cells, with the tendency of the increase of apoptotic cells. Melan-a cells did not show difference among the treatments. The release of cytochrome c was determined by HPLC and it showed that after two hours, B16-F10 cells had more cytochrome c released to the cytoplasm compared to the control. There was not any alteration for other groups of cells with the treatment. However, the control cells that had more melanin showed increased cytochrome c release compared to the control of the not-stimulated cells, demonstrating that the previous cells were suffering some kind of damage from the melanin synthesis. The analysis of DNA fragmentation revealed the absence of typical apoptosis fragmentation in any of the groups. B16-F10 Y control cells displayed unspecific DNA damage observed as a smear in the agarose gel, which was not altered by 1O2 treatment. The same result was observed after the treatment for 2 and 24 hours. The ratio between ADP and ATP was quantified to evaluate the energetic state of the cell, which may reflect some characteristics of cell death. None of the cells showed results statistically significant after the two-hour treatment 1O2, but it was shown that the values of ADP/ATP ratio of the B16-F10 control cells with and without stimulation were above of the threshold accepted for viable/proliferative cells. The results of Melan-a cells were very close to the values considered normal. The calcium flux was also evaluated and it was evidenced that 1O2 was capable of releasing calcium from the intracellular stores to the cytoplasm in B16- F10 cells, and the release of calcium was lower in B16-F10 Y, indicating the possibility of the binding of the metal to melanin. The Melan-a cells did not showed much increase in the quantities of calcium released to the cytoplasm. There was no difference in the release of AIF in any group. Over all, the results support that the synthesis of melanin that was stimulated by the supplementation of the medium was deleterious to the cells, since it caused DNA fragmentation, release of cytochrome c and increase of the ratio ADP/ATP to values of cells in apoptosis. On the other hand, the presence of melanin seemed to protect the cells against the action of 1O2, because some results indicate a tendency of improvement in the parameters evaluated.