Pouco se conhece acerca dos aspectos fisiológicos da reprodução de ranfastídeos, sendo estas informações importantes para sua conservação e criação em cativeiro. Métodos não-invasivos permitem análises a longo prazo e em espécies pequenas, além de facilitar estudos em vida livre e minimizar o estresse causado aos animais. Este trabalho teve por intuito a dosagem de metabólitos de testosterona (machos e fêmeas), progesterona e estradiol (somente fêmeas) nas excretas de 3 casais de tucano-toco (Ramphastos toco) e 3 casais de tucano-de-bico-verde (Ramphastos dicolorus), dentro e fora da estação reprodutiva. Dados de observações comportamentais mostraram que os animais foram mais ativos durante a estação reprodutiva, porém comportamentos sociais e proximidade entre o casal se mostraram raros nas duas fases durante as seções de observação. Concentrações de metabólitos de progesterona foram obtidos para as duas espécies na Fase Reprodutiva, mas não foram detectados nos ensaios para a Fase Não-reprodutiva. Metabólitos de testosterona puderam ser dosados em ambas as espécies, nas duas fases, tanto em machos quanto em fêmeas; sendo que os resultados mostraram para a maioria dos indivíduos concentrações maiores na Fase Reprodutiva. Aumentos acima de variações basais de metabólitos de testosterona foram associados à ocorrência de posturas, que ocorreram durante a Fase Reprodutiva numa das fêmeas de R. toco. Não foram obtidos resultados de metabólitos de estradiol em nenhuma das duas espécies, possivelmente pela falha do anticorpo utilizado em reconhecer os metabólitos. No entanto, este trabalho mostrou que a técnica utilizada foi eficaz para dosagem de metabólitos de testosterona e progesterona nas excretas destas espécies, evidenciando variações sazonais nas concentrações hormonais e indicando uma relação entre a concentração de metabólitos de testosterona e as posturas. / Little is known about reproductive physiology in Ranfastidae and this knowledge is needed for the development of conservation programs and for successful captive breeding. Non-invasive methods allow long-term analysis in small animals, facilitate studies with free-living animals and minimize the handling stress. The purpose of this work was to measure the testosterone (males and females), progesterone and oestrogen (females) metabolites concentrations in the droppings of Toco-toucan (Ramphastos toco) and Red-billed-toucan (Ramphastos dicolorus), inside and outside the reproductive season. Three captive couples of each species were studied. Collected behavioural data showed that the animals were more active during reproductive season, but social behaviours and the couple proximity were rare in the two phases during the observation sessions. Progesterone metabolites concentrations could be obtained in the Reproductive Phase for both species, but weren`t detected in the Nonreproductive Phase. Testosterone metabolites could be measured for both species in the two phases, in males and females; and the results showed higher concentrations in most of individuals in the Reproductive Phase. Concentrations of testosterone metabolites above basal levels were associated to egg laying, which occurred during Reproductive Phase in one of the R. toco females. Results of oestrogen metabolites concentrations could not be obtained in both species, probably because the fail of the antibody in detecting these metabolites. However, this work showed that the utilized technique was efficient to measure testosterone and progesterone metabolites in those species droppings, evidencing seasonal variations in hormonal concentrations and indicating a relationship between testosterone concentrations and oviposition.

Orientador: Ricardo da Fonseca / Resumo: Em fêmeas bovinas a liberação de prostaglandina F2α (PGF2α) endometrial pode ser induzida in vivo pelo estradiol (E2), entretanto, seu papel ainda não foi esclarecido. Em estudos prévios realizados pelo grupo, o tratamento com E2 in vivo duas horas antes das vacas serem abatidas no 17º dia do ciclo estral, associado à adição de cálcio ionóforo (CI) in vitro em explantes endometriais, exacerbou a síntese de PGF2α quando comparado ao grupo de vacas não tratadas com E2 e CI. O mesmo foi observado em células endometriais bovinas (BEND) expostas ao E2 e CI simultaneamente. Considerando que as concentrações plasmáticas de PGF2α aumentam a partir de 3,5 horas após da aplicação do E2 in vivo, possivelmente tais ações envolvam a síntese de proteínas. Hipotetizou-se que o E2 estimule a expressão e/ou a atividade das enzimas dependentes de cálcio, especificamente a proteína quinase C (PKC) e fosfolipase A2 citosólica (cPLA2). Assim, objetivou-se analisar o efeito dos inibidores de Proteína G, PKC e PLA2 na síntese de PGF2α induzida pelo 17β-estradiol e CI em células endometriais bovinas BEND (Experimento 1), e avaliar as proteínas PKC e PLA2 e ERK 1/2, pela técnica de Western Blotting, em explantes endometriais obtidos de fêmeas bovinas abatidas 2 horas após a administração de 17β-estradiol no 17o dia do ciclo estral (Experimento 2). No Experimento 1, células endometriais bovinas (BEND) foram submetidas a ausência ou presença de um inibidor de proteína G - 10µM de Guanosine 5’- {B-thio}... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

Orientador: Claudia Maria Bertan Membrive / Banca: Flávia Simone Munin / Banca: Fábio Ermínio Mingatto / Resumo: Em fêmeas bovinas, a liberação de prostaglandina F2a (PGF2a) pode ser induzida in vivo pelo estradiol (E2), entretanto, o papel do E2 na síntese de PGF2a ainda não foi esclarecido. Considerando que as concentrações plasmáticas de PGF2a aumentam 3,5 horas após a aplicação de E2 in vivo, acredita-se que o E2 ative não somente enzimas, mas também estimule a síntese de proteínas essenciais para a produção de PGF2a, como a PKC e PLA2. O presente estudo objetivou avaliar o efeito do E2 no incremento da concentração das proteínas totais no endométrio e na modificação da composição protéica de explantes endometriais de fêmeas bovinas tratadas com E2 no 17º dia do ciclo estral. A hipótese é que a administração de E2 em fêmeas bovinas no 17º dia do ciclo estral incrementa a concentração de proteínas no endométrio e modifica a composição protéica nos explantes endometriais. Para tanto, fêmeas bovinas mestiças (Bos taurus taurus vs Bos taurus indicus) foram tratadas no 17° dia do ciclo estral, via intravenosa, com 0mg (Grupo Controle; n=6) ou 3mg de E2 (Grupo E2; n=6) e abatidas duas horas após o tratamento. Explantes endometriais foram isolados e submetidos à extração de proteínas totais. As amostras de proteínas, referentes aos explantes de cada animal, foram avaliadas por eletroforese unidimensional em gel de poliacrilamida 10% SDS-PAGE e coradas com Coomasie Blue ou Nitrato de Prata. A concentração de proteínas totais não diferiu entre os grupos (p=0,1158) e foi de 6296,10 + 439,90μg/mL para o Grupo Controle e de 8426,56 + 1156,00μg/mL para o Grupo E2. Nos géis corados com Coomasie Blue foram identificadas 18 bandas protéicas e não foi observada diferença significativa (p>0,05) no perfil protéico dos explantes endometriais. Na coloração com Nitrato de Prata, foram identificadas 12 bandas protéicas... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In cows the release of prostaglandin F2a (PGF2a) can be induced in vivo by estradiol (E2), however, the role of E2 in the synthesis of PGF2a has not yet been clarified. Considering that plasma concentrations of PGF2a increased 3.5 hours after application of E2 in vivo, it is believed that E2 not only active enzymes, but also stimulates the synthesis of essential proteins for the production of PGF2a, as PKC and PLA2 . This study aimed to evaluate the effect of E2 in increasing the concentration of total protein in the endometrium and changes in protein composition of endometrial explants from cows treated with E2 at the 17th day of estrous cycle. The hypothesis is that the administration of E2 in cows on the 17th day of the estrous cycle increases the concentration of protein in the endometrium and changes the composition of protein in endometrial explants. Therefore, days of the estrous cycle, crossbred cows were treated at 17th day of estrous cycle intravenously with 0 mg (Control Group; n = 6) or 3 mg of E2 (E2 Group; n = 6) and killed two hours after treatment. Endometrial explants were isolated and subjected to extraction of total protein. Samples of proteins related to the explants from each animal were analyzed by one-dimensional electrophoresis on polyacrylamide gel 10% SDSPAGE and stained with Coomasie Blue or silver nitrate. The concentration of total protein did not differ between groups (p = 0.1158) and was 6296.10 + 439.90μg/mL for the Control Group and of 8426.56 + 1156.00μg/mL for E2 Group. In gels stained with Coomasie Blue were identified 18 protein bands and there was no significant difference (p>0.05) in the protein profile of endometrial explants. Staining with Silver Nitrate, was identified 12 protein bands and was found in E2 Group greater relative percentage of the bands for the molecular weight of... (Complete abstract, click electronic access below) / Mestre

Orientador: Anthony César de Souza Castilho / Resumo: A superestimulação ovariana é uma biotecnologia amplamente empregada na espécie bovina para a obtenção de múltiplas ovulações. Com este objetivo diversos protocolos superestimulatórios surgiram, dentre eles o protocolo P-36 e sua variação, o protocolo P-36/eCG. Ambos os tratamentos utilizam o hormônio folículo estimulante (FSH) na indução do crescimento folicular. Como é acreditado que no último dia do tratamento, as células da granulosa folicular possuam receptores do hormônio luteinizante (LH; LHR), duas últimas doses de FSH foram substituídas pela administração de gonadotrifina coriónica equina (eCG; P-36/eCG). A molécula de eCG possui atividade tanto LH quanto FSH por se ligar a ambos receptores, aumentando a resposta ovulatória. Os dois tratamentos têm demonstrado eficácia quanto ao desenvolvimento de oócitos competentes para a produção embrionária, no entanto pouco se sabe sobre seus efeitos na diferenciação celular no folículo ovariano. Por isso, o presente estudo investigou os efeitos da superestimulação ovariana com FSH (P-36) ou FSH combinado com eCG (P-36/eCG) sobre aspectos bioquímicos e a produção de hormônios esteroides. Adicionalmente, quantificou-se a abundância de miRNAs reguladores da expressão do mRNA do LHR e outros miRNAs relacionados com o desenvolvimento folicular ovariano. Os resultados obtidos mostram que os tratamentos superestimulatórios alteram o perfil bioquímico intrafolicular e a concentração de estradiol no plasma. Aliado a isso, também alteram... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Ovarian overstimulation is a biotechnology widely used in the bovine species to obtain multiple ovulations. With this objective, several protocols were introduced, including the P-36 protocol and its variation, the P-36/eCG protocol. Both treatments use follicle stimulating hormone (FSH) to induce the follicular growth. As it is believed that on the last day of treatment, follicular granulosa cells have luteinizing hormone (LHR) receptors, two last doses of FSH have been replaced by administration of equine chorionic gonadotrifine (eCG; P-36/eCG). The eCG molecule has LH and FSH activity by binding to both receptors, increasing the ovulatory response. Both treatments has demonstrated efficacy in the development of oocytes competent for embryo production, however little is known about their effects on cell differentiation in the ovarian follicle. Therefore, the present study investigated the effects of ovarian superstimulation using FSH (P-36) or FSH combined with eCG (P-36/eCG) on biochemical aspects and production of steroid hormones. In addition, the abundance of miRNAs regulating the expression of LHR mRNA and other miRNAs related to ovarian follicular development. Results demonstrated that superstimulatory treatments alter the intrafollicular biochemical profile and the plasma estradiol concentration. In addition, they also alter the expression of LHR and miRNAs regulating LHR mRNA expression, possibly modulating ovulatory capacity in superstimulated ovarian follicles. / Mestre

Every year, in the United States alone, there are 1.7 million incidences of traumatic brain injury (TBI). Unfortunately, despite the tremendous societal and economic cost and decades of research, current pharmacological treatments for TBI are lacking. The specific aims of this thesis are: (1) to determine the efficacy of 17β-estradiol (E2) monotherapy treatment post-TBI, (2) determine if a combination treatment of E2 and memantine provides statistically significant benefits over monotherapy treatments post-TBI, and (3) to investigate the utility of an in vitro model to recapitulate the pathobiology of an in vivo model of TBI and to assess its potential to discover novel and clinically relevant therapeutic targets for future studies. The neuroprotective properties of E2 have been investigated for several decades in several different models including excitotoxicity, ischemia, and TBI. Organotypic hippocampal slice cultures (OHSCs) were mechanically injured at specified strain and strain rates which are relevant to TBI, and the efficacy of E2 post-TBI was investigated. Physiological concentrations of E2 were more effective at preventing cell death than supraphysiological concentrations. Further, GPR30, a novel G protein-coupled receptor, was not activated at physiological concentrations. These results suggest that the classical estrogen receptors (ERs) were primarily responsible for E2-mediated neuroprotection following TBI, and that GPR30 is neither necessary nor sufficient. While monotherapy treatments have shown preclinical success post-TBI, none have been successful in clinical trials. Combination therapies are a promising area of research that focuses on synergistic effects between compounds for significant increases in neuroprotection, potentially resulting in a clinically relevant treatment. A combination treatment of E2 and memantine was statistically more neuroprotective than either monotherapy post-TBI. Using micro-electrode arrays (MEAs), we recorded and quantified increased evoked responses in OHSCs after physiological concentrations of E2 and showed that memantine significantly reduces these effects. Our results suggest a potential combination treatment for TBI and a possible mechanism for its synergistic effects. TBI is a complex injury which initiates a multitude of secondary injuries causing delayed cell death for days or beyond. The utility of in vitro models depends on their ability to recapitulate the in vivo injury cascade after TBI. We used a genome wide approach to study changes in gene expression after injury in both an in vitro model and an in vivo model of TBI to compare the post-TBI pathobiology. There was a strong correlation in gene expression changes between the two models providing confidence that the in vitro model represented the in vivo injury cascade. From these data, we searched for genes with significant changes in expression over time and identified Sorla. Sorla directs amyloid precursor protein (APP) to the recycling pathway by direct binding and away from amyloid beta (Aβ) producing enzymes. Mutations of Sorla have been linked to Alzheimer's disease (AD). We confirmed the down regulation of SORLA expression in OHSCs by immunohistochemistry (IHC) and western blotting. Together, these data suggests that the in vitro model of TBI that was tested strongly recapitulates the in vivo TBI pathobiology and is well-suited for future mechanistic or therapeutic studies. The data also suggest a novel target, Sorla, which may play a role in AD caused by TBI. In conclusion, we discovered a potentially clinically relevant combination treatment of E2 and memantine for post-TBI therapy. We also confirmed that our in vitro model of TBI is well representative of in vivo models, and that relevant, novel targets for future TBI studies can be elucidated with this model. A potential link between AD and TBI was suggested and warrants future study. Together, these studies address the growing public health concern of TBI.

O trabalho teve como objetivo avaliar a concentração sérica de estrógeno e progesterona em cadelas durante o ciclo estral por imunoensaio multianalito (Luminex® xMAP®), visando avaliar a aplicabilidade fisiológica e comparar os resultados obtidos com os valores já estabelecidos na literatura pelo método de radioimunoensaio (RIE). Foram utilizadas 7 cadelas da raça Border Collie, residentes do Canil Espaço Ducão (Valinhos/SP) de diferentes idades e ao primeiro sinal de sangramento vulvar (proestro/estro) foram coletadas amostras a cada 48 hs e ao seu termino (diestro), foi realizado coletas semanalmente (intervalo de 7 dias) durante aproximadamente 3 semanas. Houve correlação positiva apenas entre os valores de progesterona na fase de proestro/estro (p=0,001). Apesar de não ter ocorrido correlação entre as outras fases, as medias dos valores séricos de estradiol e progesterona foram estatisticamente significantes, em ambas as fases, sendo os valores obtidos pelo Luminex® maiores que os obtidos pelo RIE. Os valores de progesterona confirmaram os dados fisiológicos esperados em ambas as metodologias, porém os valores de estradiol não foram compatíveis com o esperado fisiologicamente, exceto quando analisados a partir das medias globais em ambas as fases. Novos estudos de validação laboratorial serão necessários para confirmar a validação fisiológica, principalmente no perfil da progesterona. Podemos concluir ainda que os valores de referência para o Luminex® devem ser diferentes dos valores já estabelecidos pelo RIE para ambos os hormônios testados / The study aimed to evaluate the serum concentration of estrogen and progesterone in female dogs during the estrous cycle by multiplex immunoassay (Luminex® xMAP®), to evaluate the physiological applicability and compare the results with the values established in the literature by radioimmunoassay (RIA). We used seven Border Collie bitches, residents in Kennel Espaço Ducão (Valinhos/SP), of different ages and for the first sign of vulvar bleeding (proestrus/estrus) samples were collected every 48 hours and its end (diestrus) were collected weekly (every 7 days) for about three weeks. There was a positive correlation only between progesterone values in the proestrus/estrus phase (p = 0.001). Despite having not occurred correlation between the other phases, the median of serum estradiol and progesterone values were statistically significant in both phases, the values obtained by Luminex® is higher than by RIA. Progesterone values confirmed the expected physiological data in both methods, however estradiol values were not physiologically compatible with the expected, except when analyzed from the global mean in both phases. A laboratory validation studies will be needed to confirm the physiological validation, especially in progesterone profile, and we can conclude that the reference values for the Luminex® should be different from the values established by RIE for both hormones tested

Resumo não disponível

Orientador: Renata Guimarães Moreira Whitton / Banca: Elizabeth Romagosa / Banca: Rosicleire Veríssimo Silveira / Banca: Taís da Silva Lopes / Banca: Gisele Cristiane de Melo Dias / Resumo: O lambari-do-rabo-amarelo (Astyanax altiparanae) na natureza, reproduz durante a primavera-verão, mas as fêmeas permanecem vitelogênicas ao longo de todo ano, incluindo o período de inverno, quando a desova não ocorre. O presente estudo investigou a influência da modulação da temperatura no eixo hipotálamo-hipófise-gônadas do lambari, fora da estação reprodutiva, bem como os efeitos de diferentes terapias com análogo do hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRHa). Foram conduzidos dois experimentos, um com múltiplas injeções de GnRHa e outro com implantes de GnRHa, em duas doses e duas temperaturas da água, sendo uma correspondente ao inverno e outra ao verão. No final do período experimental, as fêmeas das condições experimentais diferentes foram induzidas a desovar utilizando gonadotrofina coriônica humana (hCG). A análise dos dois experimentos em conjunto, demonstra que independente da forma de administração, a suplementação de fêmeas de A. altiparanae com GnRHa fora do período reprodutivo desencadeia alterações no eixo hipófise-gônadas, dependentes da temperatura de exposição, que aumenta a viabilidade na produção de larvas desta espécie. As injeções repetidas desencadearam uma resposta mais evidente na hipófise de animais em baixas temperaturas. Os dados dos índices de desempenho na reprodução induzida mostraram que a administração de GnRHa na forma de injeções também foi mais eficiente na produção de larvas, quando mantidos em temperaturas mais elevadas, enquanto o GnR... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The lambari-do-rabo-amarelo (Astyanax altiparanae) in the wild reproduce during spring and summer, but females remain vitellogenic throughout the year, including the winter period, when spawning does not occur. The present study investigated the influence of temperature modulation on the hypothalamic-pituitary-gonad axis of the lambari in non-breeding season, as well as the effects of different therapies with gonadotropin releasing hormone analog (GnRHa). Two experiments were conducted, one with multiple injections of GnRHa and the other with GnRHa implants, in two doses and two water temperatures, one corresponding to winter and another of summer. At the end of the experimental period, females from different experimental conditions were induced to spawn using human chorionic gonadotrophin (hCG). The analysis of the two experiments shows that regardless of the administration form, the supplementation of GnRHa in A. altiparanae females, in non-breeding period, triggers alterations in the pituitary-gonadal axis, depending on the exposure temperature, increasing the viability in the production of larvae of this species. Repeated injections elicited a more evident response in the pituitary gland at low temperatures. The performance data on induced reproduction showed that the administration of GnRHa in the form of injections was more efficient in larvae production, when kept at higher temperatures, while GnRHa implants resulted in higher estimated larval production at lower tempe... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Rafael Henrique Nóbrega / Resumo: A decisão sobre se uma gônada bipotencial se desenvolverá em um testículo ou em um ovário é considerado um estágio crítico na diferenciação sexual dos vertebrados. A administração de esteróides exógenos durante este período pode afetar essa plasticidade, promovendo a diferenciação sexual na direção feminina ou masculina. Dessa forma, o objetivo desta tese foi avaliar os efeitos do tratamento de 17β-estradiol no desenvolvimento de Astyanax altiparanae (lambari), através de análises histológicas e de análises de expressão genica de possíveis genes envolvidos em vias masculinas e femininas. Para isso, larvas com gônadas indiferenciadas foram alimentadas com Artemia contendo diferentes concentrações de estradiol durante 28 dias, desde o 1 dia pós-eclosão (dpe) até o período que precede a diferenciação gonadal. Nossos resultados mostraram que o E2 modificou o fenotípo e a relação sexual histológica e, surpreendentemente, induziu intersexo com com a presença de óvulos nos testículos nas concentrações de 2 e 6 mg de E2/kg de alimento. Esses dados são uma evidência clara de que o tratamento utilizado não foi suficiente para induzir a reversão completa do sexo em A. altiparanae. Em termos de expressão gênica, o tratamento com E2 (6 mg/kg de alimento) produziu uma notável plasticidade gonadal entre machos e fêmeas aos 90 dias após a eclosão (dph). Os machos, denominados “machos resistentes ao estradiol”, superexpressaram os genes masculinos, como dmrt1, sox9 e amh. Dessa forma, nó... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The decision whether a bipotential gonad will become a testis or ovary is considered a critical stage in vertebrate sex determination. Administration of exogenous steroids can affect this plasticity by skewing the sex gonadal differentiation towards a male or female. The aim of this study is to evaluate the effects of 17β-estradiol (E2) diet on Astyanax altiparanae (lambari) development, focusing on the gonadal development and gene expression analysis of possible candidate genes involved in either male or female pathways. Larvae with undifferentiated gonads were fed with steroid diet containing different concentrations of E2 during 28 days, from the mouth opening until a period that precedes the gonadal differentiation. Animals were sampled at 90 days post-hatching (dhp) for histology and gene expression analysis. Our results showed that E2 disrupted both phenotypic and histological sex ratios, and surprisingly, induced intersex with testis-ova in the concentrations of 2 and 6 mg E2/Kg food. This data is a clear evidence that the treatment used was not enough to induce complete sex reversal in A. altiparanae. However, in terms of gene expression, E2 (6mg/Kg food) induced a remarkable gonadal plasticity between males and females at 90 dph. The males, named as E2 resistant males, overexpressed the male-biased genes, such as dmrt1, sox9 and amh. We suggested that these males were able to resist the E2-induced feminization by the expression of genes related to testis differentiat... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

The ability of insulin-like growth factor-I (IGF-I) to impact the hippocampus and associated behaviors may vary depending upon estrogenic status. Previous work from our lab demonstrated that chronic antagonism of brain IGF-I receptors (IGF-IR) resulted in increased levels of hippocampal synaptic proteins in control-treated ovariectomized (OVX) rats. In contrast, antagonism of brain IGF-IR decreased levels of synaptic proteins in estradiol-treated OVX rats. The goal of the current experiment was to test the hypothesis that effects of chronic agonism of IGF-IR, via peripheral treatment with IGF-I, on hippocampal-dependent memory would also vary with estrogenic status. Furthermore, we assessed the influence of estrogenic status on the ability of IGF-I to impact levels of hippocampal synaptic proteins. OVX rats received chronic peripheral treatment with estradiol or cholesterol control via silastic implants, as well as IGF-I or vehicle via osmotic minipumps. One week after surgeries, place learning and memory on the Morris water maze was assessed via eight place-training trials on the first day and four place-training trials on the second day of testing. Place learning and memory was measured using mean swim path length. Following place training, a probe trial was conducted to assess memory for the location of the hidden platform. Memory on the probe trial was measured via percent time in the target quadrant. Animals were euthanized 24 hours following behavioral testing, and hippocampi were processed for western blotting to determine levels of hippocampal synaptic proteins PSD-95, spinophilin, and synaptophysin. Results revealed no effects of treatment on behavioral measures or on levels of hippocampal synaptic proteins. These data indicate that chronic peripheral administration of IGF-I does not affect hippocampal-dependent memory in a Morris water maze task and does not impact hippocampal synaptic protein levels in the presence or absence of peripheral estradiol. / acase@tulane.edu