Orientador: Domingos da Silva Leite / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T00:21:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Domingos_DanielaFerreira_M.pdf: 1627311 bytes, checksum: ba7a6545a75d72a741bfe8d1cda234f4 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: O número de animais de companhia tem crescido substancialmente na sociedade atual, com estimativas de 48 milhões de cães e gatos no Brasil. A relação entre animais de companhia e os humanos mudou radicalmente nos últimos anos, esses estão em contato mais próximo com humanos. Como consequência dessas mudanças, agentes antimicrobianos, incluindo antibióticos usados no tratamento de infecções humanas, tem sido utilizados em cães. O objetivo deste trabalho foi investigar fenotipicamente a ocorrência de ß-lactamase de espectro estendido (ESBL) em amostras de Escherichia coli isoladas de cães e identificar os genes de resistência nestas amostras. A presença e variedade de integrons nas amostras de E. coli foi analisada. A classificação das amostras nos grupos filogenéticos A, B1, B2 e D também foram investigadas. Dentre 158 amostras de E. coli isoladas de cães sendo 51 de ITU (infecção do trato urinário), 52 de piometra e 55 de fezes de cães sadios, foram selecionadas 67 amostras que apresentavam pelo menos uma marca de resistência aos ß-lactâmicos. As amostras selecionadas: 41 isoladas de ITU, 20 isoladas de piometra e seis isoladas de fezes de animais sadios, foram submetidas a testes de sensibilidade microbiana pelo método de difusão de disco. A produção de ESBL foi verificada pelo método de aproximação de disco. A identificação dos genes das ß-lactamases foi realizada em ensaios de PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) com primers específicos para os genes blaTEM, blaSHV, blaCTX-M, blaGES-1, blaOXA-10, ampC e cmy. A classificação filogenética (chuA, yjaA, TspE4.C2), bem como a detecção de integrons das classes 1 e 2 (intI1 e intI2) também foram realizadas por PCR. Os resultados dos antibiogramas mostraram elevada resistência aos ß-lactâmicos de 1ª geração, ampicilina (82,0%) e cefalexina (62,7%) entre as amostras selecionadas. Resistência aos antimicrobianos ß-lactâmicos de 3ª e 4ª geração e ao monobactam foi observada em 7,5% das amostras. As amostras também apresentaram resistência aos antimicrobianos tetraciclina (82,0%), trimetoprim-sulfametoxazol (62,7%), enrofloxacina (35,8%), florfenicol (34,3%) e ciprofloxacina (32,3%). A expressão fenotípica de ESBL foi observada em duas amostras (3,3%), ambas isoladas de animais sadios. Na análise genotípica, foram identificados os genes blaTEM, (98,5%), ampC (95,5%), blaCTX-M (35,8%), blaSHV (6%) e cmy (2,9%) destacando que os genes blaCTX-M, blaSHV e cmy apresentaram-se associados ao blaTEM e ao ampC. Pelo sequenciamento foi possível identificar as ß-lactamases do tipo TEM-1 e CTX-M-2. Na classificação filogenética as amostras foram agrupadas nos grupos B2 (59,7%), B1 (25,4%) e A (14,9%). Dentre as 67 amostras com marcas de resistência aos ß-lactâmicos, o gene int foi detectado em 26,9% , das quais 71,4% da classe 1 e 28,6% da classe 2. Por outro lado, dentre as 91 amostras sem marcas de resistência a à ß-lactâmicos, somente 3,3% apresentaram integrons, sendo todos da classe 1. As amostras com integrons foram mais comumente alocadas nos grupos filogenéticos A e B1. A presença de ESBL, de genes de resistência e integrons em E. coli isoladas de cães é um achado importante, uma vez que o contato íntimo entre humanos e cães oferece condições para a transmissão das amostras e ainda, que estes animais podem servir de reservatórios de genes de resistência. Esses resultados reforçam a necessidade de controle no uso de antimicrobianos em animais de companhia e bem como o papel dos animais domésticos como reservatório de genes de resistência bacteriana, precisa ser melhor investigado / Abstract: The number of cats and dogs has substantially increased in modern society, with an estimated population of above 48 million in Brazil. The relationship between companion animals and humans has radically changed throughout the years, and animals have become in closer contact with humans. As a consequence of these changes, antimicrobial agents, including antimicrobial preparations licensed for human use, are frequently used in dogs. The aim of this study was to investigate, in Escherichia coli strains isolated from dogs, the occurrence of ß-extended-spectrum ß-lactamase (ESBL) phenotype and to identify resistance genes in these samples. The presence and diversity of integrons in strains of E. coli was analyzed. The classification of microorganisms in the phylogenetic groups A, B1, B2 and D was also determined. Among 158 E.coli strains isolated from dogs (51 from UTI [urinary tract infection], 52 from piometra and 55 from faeces of healthy dogs) 67 strains were selected that had at least one sign of resistance to ß-lactams. The strains selected: 41 isolated from UTI, 20 isolated from piometra and six isolated from the faeces of healthy dogs, were tested for antibiotic sensitivity by the disk diffusion method. ESBL production was screened by the double-disk synergy method. The identification of ß-lactamases was performed by PCR (Polymerase Chain Reaction) using specific primers for blaTEM, blaSHV, blaCTX-M, blaGES-1, blaOXA-10, ampC and cmy and, subsequently, sequencing of the PCR product of strains showing the ESBL phenotype was performed. The phylogenetic classification (chuA, yjaA, TspE4.C2), as well as the detection of class 1 and class 2 integrons, were also determined by PCR. The results of susceptibility tests showed high resistance to 1st generation ß lactams, ampicillin (82.0%) and cephalexin (62.7%), among the selected strains. Resistance to 3rd and 4th generation ß-lactam antibiotics and monobactam was observed in 7.5% of isolates. The strains also showed resistance to antimicrobial tetracycline (82%), trimethoprim-sulfamethoxazole (62.7%), enrofloxacin (35.8%), florfenicol (34.3%) and ciprofloxacin (32.3%). Phenotypic expression of ESBL was observed in 2 samples (3.3%), both isolated from healthy animals. In the genotypic analysis, were identified the genes, blaTEM, (98.5%), ampC (95.5%), blaCTX-M (35.8%), blaSHV (6%) and cmy (2.9%); the genes blaCTX-M, blaSHV and cmy were shown to be associated with blaTEM and ampC. By sequencing, it was possible to identify the TEM-1 and CTX-M-2 ß-lactamases. In the phylogenetic classification, strains were classified B2 (59.7%), B1 (25.4%) and A (14.9%) groups. Among the 67 strains with resistance markers to ß-lactams, the int gene was detected in 26.9% of the strains (71.4% of class 1 and 28.6% of Class 2). Moreover, among the 91 samples without a trace of resistance to ß-lactams, only 3.3% had integrons, all of class 1. Strains with integrons were more commonly housed in the phylogenetic groups A and B1. The presence of ESBL, resistance genes and integrons in E. coli isolated from dogs is an important finding, due to close contact between humans and dogs provides conditions for the transmission of microorganisms and these animals may also serve as reservoirs of isolates harboring resistance genes. These results emphasize the need to control the use of antimicrobials in companion animals and the role of livestock as a reservoir for genes of resistance should be further investigated / Mestrado / Microbiologia / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:22:21Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2005-08-15Bitstream added on 2014-06-13T18:48:56Z : No. of bitstreams: 1 rodrigues_lo_me_arafcf.pdf: 364674 bytes, checksum: 25ad80987f7d2eb4d8bf537154a09922 (MD5) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / A produção de beta-lactamase de espectro estendido (ESBL) em membros da família Enterobacteriaceae pode conferir resistência a cefalosporinas de amploespectro, aztreonam e penicilinas. Devido a esse fenômeno, a detecção exata dos produtores de ESBL é essencial para a seleção apropriada da antibioticoterapia. Para detectar a produção de beta-lactamase de espectro estendido (ESBL) em bacilos Gram-negativos, foi usado um teste de triagem com os discos de aztreonam (ATM), ceftazidima (CAZ), cefotaxima (CTX) e ceftriaxona (CRO) sobre 300 cepas, das quais trinta e cinco eram suspeitas da presença de ESBL. A produção de ESBL foi demonstrada por três métodos fenotípicos confirmatórios de fácil utilização. Os três testes fenotípicos para confirmar a produção de ESBL incluíram o teste do sinergismo (double disk), E-test? ESBL e disco combinado. Os discos utilizados no teste do sinergismo e do disco combinado foram: aztreonam (30?g-ATM), cefotaxima (30?g-CTX), ceftazidima (30?g-CAZ), cefpodoxima (10?g-CPD) ceftriaxone (30?g-CRO) e amoxicilina+ácido clavulânico(30?g-AMC), cefotaxima+ácido clavulânico (30?g-10?g), ceftazidima+ácido clavulânico (30?g- 10?g), cefpodoxima+ácido clavulânico (10?g-1? g). Para E-test foram utilizadas fitas contendo as cefalosporinas: ceftazidima versus ceftazidima/ácido clavulânico; cefotaxima versus cefotaxima/ácido clavulânico. Os testes fenotípicos confirmaram a presença de ESBL em cinco cepas de enterobactérias (1,66%). Todos os métodos são de fácil execução, contudo o método do Etest requer experiência para interpretar os resultados. Os três testes oferecem uma solução viável para confirmar a produção de ESBL no laboratório clínico. / The production of extended spectrum beta-lactamase (ESBL) in the members of the family Enterobacteriaceae can check resistance to cephalosporins of extended-spectrum, aztreonam and penicilins. Due to this phenomenon, the exact detection of the producers of ESBL are essential for the appropriate selection of antimicrobial therapy. To detect the production of extended spectrum beta-lactamase (ESBL) in Gram-negative bacilli, a test of screening was used with the discs of aztreonam (ATM), ceftazidime (CAZ), cefotaxime (CTX) e ceftriaxone (CRO) in 300 strains, of which thirty-five were suspicious of the presence of ESBL. The production of ESBL was demonstrated by three phenotypic methods confirmed of easy utilization. The three phenotypic tests to confirm the production of ESBL included the test of sinergy (double disk), E-test? ESBL and combination disk. The disks used on the test sinergy and the combination disk were: aztreonam (30?g-ATM), cefotaxime (30?g-CTX), ceftazidime (30?g-CAZ), cefpodoxime (10?g-CPD) ceftriaxone (30?g- CRO) e amoxicillin+clavulanic acid (30?g-AMC), cefotaxime+clavulanic acid (30?g- 10? g), ceftazidime+clavulanic acid (30?g-10? g), cefpodoxime+clavulanic acid (10?g- 1? g). For E-test, were utilized strips containing the cephalosporins: ceftazidime and ceftazidime/clavulanic acid; cefotaxime and cefotaxime/clavulanic acid. The phenotypic tests confirmed the presence of ESBL in five strains Enterobacteriaceae (1,66%). All of the methods are of easy execution; however, the method of Etest requires experiment to interpret the results. The three tests offer a viable solution to confirm the production of ESBL on a clinic laboratory.

As infecções associadas aos cuidados de saúde constituem um problema grave nas unidades hospitalares bem como nos serviços de atendimento extra-hospitalares. Diferentemente de outros países, no Brasil, existe uma incidência alta dessas infecções causadas por microorganismos Gram-negativos produtores de β-lactamase de espectroestendido (ESBL). Estas enzimas hidrolisam compostos β-lactâmicos e são consideradas mundialmente como de importância clínica, pois a localização de seus genes emelementos móveis facilitam a transmissão cruzada. Este estudo foi realizado com amostras bacterianas isoladas de material clínico e de fezes de pacientes internados em um hospital da rede pública no Rio de Janeiro, Brasil. Estes pacientes estavam internados em duas unidades de terapia intensiva cardiológica, no período de janeiro a dezembro de 2007. O estudo teve por objetivo realizar a caracterização fenotípica e genotípica desses isolados associados à colonização ou infecção dos pacientes. Os testes fenotípicos e genotípicos foram realizados na Universidade do Estado do Rio de Janeiro e incluíram provas bioquímicas, teste de susceptibilidade, teste confirmatório para a expressão da produção da enzima ESBL e Reação de Polimerase em Cadeia (PCR) com iniciadores específicos para cinco genes: blaTEM, blaSHV, CTX-M1, Toho1 e AmpC. As espécies bactérianas mais frequentemente isoladas foram Escherichia coli (25%) e Klebsiella pneumoniae (30,56%), e os genes mais prevalentes foram blaTEM (41,6%), AMPC (41,6%) blaSHV (33,3%), CTX-M1 (25%), e Toho1 (19,44%). Identificamos em 25% das amostras enterobactérias que não eram E. coli, K. pneumoniae ou Proteus sp, com fenótipo para ESBL e a expressão dos mesmos genes, confirmando a necessidade de investigação nestes grupos microbianos. O substrato mais sensível para a expressão da área de sinergismo no Teste de Aproximação foi o ceftriaxone (80%). Identificamos também que 17% das amostras positivas para ESBL apresentaram co-produção para AmpC e 50% apresentaram mais de um gene para os iniciadores testados. A presença da carbapenemase foi avaliada em amostras bacterianas com susceptibilidade intermediária para ertapenem, através do Teste de Hodge modificado. Os achados do presente estudo caracterizaram a co-produção de AmpC e ESBL, bem como sugerem a necessidade da revisão e a ampliação dos métodos para a detecção de outros padrões de resistência na nossa Instituição. / Healthcare-associated infections are a major problem in hospital units as well as in units outside hospital, where procedures are performed. In Brazil, differently from other countries, a large proportion of these infections are caused by extended spectrum beta-lactamase (ESBL) producing Gram-negative microorganisms. These enzymes, which hydrolyse β-lactams, are considered of clinical importance worldwide. Their localization in genes that are located in móbile structures facilitate cross infection. This study was performed with bacterial isolates found in clinical specimens and faeces of patients hospitalized in a public hospital in the city of Rio de Janeiro, Brazil. These patients were in two different cardiological intensive care units from January till December 2007. The goal of the study was the phenotypic and genotypic characterization of the bacterial isolates which were associated with colonization or infection. Phenotypic and genotypic tests were performed in Universidade do Estado do Rio de Janeiro (Rio de Janeiro State University) and included biochemical tests, susceptibility tests, a comfirmatory test for the expression of ESBL, and polymerase chain reaction (PCR) with specific primers for five gentes : blaTEM, blaSHV, CTX-M1, Toho1 and AmpC. The most frequently isolated bactéria were Escherichia coli (25%) and Klebsiella pneumoniae (30,56%), and the most prevalent genes were blaTEM (41,6%), AMPC (41,6%) blaSHV (33,3%), CTX-M1 (25%), and Toho1 (19,44%). In 25% of samples we identified enterobacteria that were not E. coli, K. pneumoniae oor Proteus spp, but with the ESBL phenotype and the expression of the same genes, suggesting these microbes needed investigating. The most sensitive substrate for expressing synergism in the double-disk diffusion test was ceftriaxone (80%). We also identified that 17% of ESBL positive isolates showed co-production of AmpC and 50% showed more than one gene tested by PCR. The presence of carbapenemase was studied in bacterial isolates with intermediate susceptibility to ertapenem, by a modified Hodge test. The findings in the present study characterize the co-production of AmpC and ESBL, and suggest the need for reviewing detection methods used and possibly using other methods for the detection of other resistance patterns in our Institution.

As infecções associadas aos cuidados de saúde constituem um problema grave nas unidades hospitalares bem como nos serviços de atendimento extra-hospitalares. Diferentemente de outros países, no Brasil, existe uma incidência alta dessas infecções causadas por microorganismos Gram-negativos produtores de β-lactamase de espectroestendido (ESBL). Estas enzimas hidrolisam compostos β-lactâmicos e são consideradas mundialmente como de importância clínica, pois a localização de seus genes emelementos móveis facilitam a transmissão cruzada. Este estudo foi realizado com amostras bacterianas isoladas de material clínico e de fezes de pacientes internados em um hospital da rede pública no Rio de Janeiro, Brasil. Estes pacientes estavam internados em duas unidades de terapia intensiva cardiológica, no período de janeiro a dezembro de 2007. O estudo teve por objetivo realizar a caracterização fenotípica e genotípica desses isolados associados à colonização ou infecção dos pacientes. Os testes fenotípicos e genotípicos foram realizados na Universidade do Estado do Rio de Janeiro e incluíram provas bioquímicas, teste de susceptibilidade, teste confirmatório para a expressão da produção da enzima ESBL e Reação de Polimerase em Cadeia (PCR) com iniciadores específicos para cinco genes: blaTEM, blaSHV, CTX-M1, Toho1 e AmpC. As espécies bactérianas mais frequentemente isoladas foram Escherichia coli (25%) e Klebsiella pneumoniae (30,56%), e os genes mais prevalentes foram blaTEM (41,6%), AMPC (41,6%) blaSHV (33,3%), CTX-M1 (25%), e Toho1 (19,44%). Identificamos em 25% das amostras enterobactérias que não eram E. coli, K. pneumoniae ou Proteus sp, com fenótipo para ESBL e a expressão dos mesmos genes, confirmando a necessidade de investigação nestes grupos microbianos. O substrato mais sensível para a expressão da área de sinergismo no Teste de Aproximação foi o ceftriaxone (80%). Identificamos também que 17% das amostras positivas para ESBL apresentaram co-produção para AmpC e 50% apresentaram mais de um gene para os iniciadores testados. A presença da carbapenemase foi avaliada em amostras bacterianas com susceptibilidade intermediária para ertapenem, através do Teste de Hodge modificado. Os achados do presente estudo caracterizaram a co-produção de AmpC e ESBL, bem como sugerem a necessidade da revisão e a ampliação dos métodos para a detecção de outros padrões de resistência na nossa Instituição. / Healthcare-associated infections are a major problem in hospital units as well as in units outside hospital, where procedures are performed. In Brazil, differently from other countries, a large proportion of these infections are caused by extended spectrum beta-lactamase (ESBL) producing Gram-negative microorganisms. These enzymes, which hydrolyse β-lactams, are considered of clinical importance worldwide. Their localization in genes that are located in móbile structures facilitate cross infection. This study was performed with bacterial isolates found in clinical specimens and faeces of patients hospitalized in a public hospital in the city of Rio de Janeiro, Brazil. These patients were in two different cardiological intensive care units from January till December 2007. The goal of the study was the phenotypic and genotypic characterization of the bacterial isolates which were associated with colonization or infection. Phenotypic and genotypic tests were performed in Universidade do Estado do Rio de Janeiro (Rio de Janeiro State University) and included biochemical tests, susceptibility tests, a comfirmatory test for the expression of ESBL, and polymerase chain reaction (PCR) with specific primers for five gentes : blaTEM, blaSHV, CTX-M1, Toho1 and AmpC. The most frequently isolated bactéria were Escherichia coli (25%) and Klebsiella pneumoniae (30,56%), and the most prevalent genes were blaTEM (41,6%), AMPC (41,6%) blaSHV (33,3%), CTX-M1 (25%), and Toho1 (19,44%). In 25% of samples we identified enterobacteria that were not E. coli, K. pneumoniae oor Proteus spp, but with the ESBL phenotype and the expression of the same genes, suggesting these microbes needed investigating. The most sensitive substrate for expressing synergism in the double-disk diffusion test was ceftriaxone (80%). We also identified that 17% of ESBL positive isolates showed co-production of AmpC and 50% showed more than one gene tested by PCR. The presence of carbapenemase was studied in bacterial isolates with intermediate susceptibility to ertapenem, by a modified Hodge test. The findings in the present study characterize the co-production of AmpC and ESBL, and suggest the need for reviewing detection methods used and possibly using other methods for the detection of other resistance patterns in our Institution.