Dentre os vários microrganismos que fazem parte de microecossistemas de solos, as bactérias do gênero Burkholderia apresentam-se de interesse por possuírem amplo potencial agrícola e biotecnológico. São portadores de uma infinidade de características, como por exemplo: promotoras de crescimento em plantas com a fixação biológica do nitrogênio e produção de fitormônios, supressores de algumas doenças, biorremediadores, agentes de biocontrole e produtores de biopolímeros. Descrito por Yabuuchi et. al. (1992), o gênero ainda precisa ser melhor caracterizado, pois sua taxonomia vem sendo modificada de tal forma que novos componentes estão sendo frequentemente propostos, especialmente pela identificação de novos nichos ecológicos e sua ação no ambiente. No Parque Nacional de Caxiuanã - Pará, Amazônia Oriental, os solos de origem antropogênica denominados Terra Preta Arqueológica (TPA) são caracterizados pelos elevados materiais orgânicos, que se auto-sustentam. Neste estudo, a diversidade do gênero Burkholderia foi avaliada por meio de técnicas microbiológicas (cultivo) e moleculares, como a Eletroforese em Gel com Gradiente Desnaturante (DGGE) com sequências iniciadoras específicas para o gênero, usando o gene 16S rRNA. Os fragmentos amplificados foram analisados pelo sequenciador automático ABI 3100, com o intuito de gerar informações sobre as principais espécies de Burkholderia presentes em sítios de TPA e comparados com as espécies encontradas em solo de floresta nativa natural, adjacente à TPA. Apesar da maior estabilidade e presença de matéria orgânica em sítio TPA, os resultados revelam que as espécies do gênero Burkholderia são numericamente superiores em solo de floresta nativa natural, vindo a confirmar que aspectos físico-químicos (ex. pH) e a vegetação predominante nas áreas de estudo afetam diretamente na composição das comunidades microbianas. Algumas estirpes encontradas destacam-se pelo seu papel funcional no solo, muitas delas comumente associadas à fixação biológica de nitrogênio. Foram encontradas as espécies Burkholderia silvatlantica, Burkholderia vietnamiensis, Burkholderia nodosa, Burkholderia terrae, Burkholderia hospita / Amongst the various microorganisms from soil microecossystems, the genus Burkholderia has been studied since several properties have been discovered more recently, with high potential for agricultural and biotechnological exploitation. Species from this genus have infinite features, e.g. plant growth promoter with biological nitrogen fixation and production of phytohormones, capability for suppression of some diseases, bioremediation, biological control and production of biopolymers. Described by Yabuuchi et al. (1992), the genus still needs to be better characterized, since its taxonomy is frequently modified and several new species have been proposed, especially after recent identification of new ecological niches and their action in the environment. In the National Park of Caxiuanã at the Eastern Amazon region are found anthrosols with past anthropogenic activity, constructed by the pre-historic Amerindians. These anthrosols are known as Archaeological Dark Earth (ADE) which has high and stable concentration of organic matter, thus keep their self-sustainability due to this high soil fertility. In this study, the diversity of genus Burkholderia was evaluated by means of microbiological (bacterial cultivation) and the molecular technique Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) using short and specific sequences designed for this genus, using the gene 16S rRNA. The amplified fragments from TPA were automated sequenced (ABI 3100) and the ADE diversity was compared with a pristine forest soil, located adjacent to TPA. Although the high stability and organic matter content in the ADE, the results showed a greater number of species from the genus Burkholderia in the pristine forest soil, located at the surrounding of the TPA soil. These data indicate that physical-chemical parameters (e.g. pH) and the prevalent vegetation in the studied areas can affect directly the structure of the microbial communities. Some strains could be distinguished by their functional role in soil, such as those associated with the ability for biological nitrogen fixation. The main species were Burkholderia silvatlantica, Burkholderia vietnamiensis, Burkholderia nodosa, Burkholderia terrae, Burkholderia hospita

Considerando a dieta como um fator modulador do microbioma ruminal, neste trabalho objetivou-se investigar o impacto do bagaço da cana-de-açúcar sobre a composição e funcionalidade das espécies microbianas residentes no rúmen de carneiros (Ovis aries). Foram utilizados seis animais machos fistulados de O. aries, dos quais três foram alimentados com uma dieta composta por 70% de volumoso e 30% de concentrado (tratamento controle) e outros três animais alimentados com uma dieta similar a anterior, mas com 14% do volumoso substituído por bagaço de cana-de-açúcar (tratamento bagaço). O conteúdo ruminal (líquido e fibra) foram amostrados quinzenalmente durante 60 dias. A partir dessas amostras foram acessadas a estrutura e a composição da comunidade microbiana pela extração de DNA total e amplificação das regiões V3 e V6-V7 do gene 16S rRNA bacteriano e a região intergênica fúngica (ITS2). Além disso, foram feitas análises metagenômicas e metatranscriptômicas de comunidade microbianas enriquecidas em fibra ruminal para identificar enzimas lignocelulolíticas expressas. As frações líquida e fibrosa do conteúdo ruminal de O. aries revelaram uma comunidade bacteriana dominada principalmente por Bacteroidetes e Firmicutes ao longo de todo período experimental. Dois gêneros, Prevotella e Ruminococcus representaram 20% e 4% da comunidade bacteriana ruminal, respectivamente. Para a comunidade fúngica o filo Neocallimastigomycota representou 91% das sequências e os principais gêneros deste filo foram Piromyces, Neocallimastix, Orpinomyces, Anaeromyces, Caecomyces e Cyllamyces aderidos a fibra ruminal. O gênero Caecomyces, foi significativamente mais abundante na fibra ruminal de animais que se alimentaram de bagaço de cana-de açúcar. Além disso, foi observado um aumento significativo na frequência de enzimas como, por exemplo, 1,4-α-glucano, α-galactosidase, endo 1,4-β-xilanase, β- xilosidase, xilose isomerase, celobiose fosforilase e α-N-arabinofuranosidase no tratamento com bagaço de cana-de-açúcar. Considerando que a recuperação de enzimas a partir de comunidades microbianas naturalmente selecionadas para a degradação de biomassa é uma estratégia promissora para superar a atual ineficiência da ação enzimática na produção industrial de biocombustíveis, os resultados deste trabalho representam a possibilidade de aumentar a capacidade de recuperação ou descoberta de enzimas a partir de ruminantes, ou ainda, a possibilidade de manipular a estrutura do microbioma do rúmen para usá-lo como fonte de inóculo enriquecido em processos industriais de degradação de biomassa. / Considering the diet as a modulator of ruminal microbiome, this work aimed to investigate the impact of sugarcane bagasse on the composition and function of microbial species residents in the sheep (Ovis aries) rumen. Six cannulated male animals were used in the experiment, where three individuals were fed on a diet consisting of 70% forage and 30% concentrate (control treatment), and three were fed on a similar diet, but with sugarcane bagasse replacing 14% of the forage portion (bagasse treatment). The ruminal content (i.e., liquid and fiber) were sampled every two weeks during 60 days. From these samples, the structure and composition of the microbial community were assessed by total DNA extraction and amplification of V3 and V6-V7 regions of 16S rRNA gene from bacteria and the fungal intergenic region (ITS2). Furthermore, metagenomics and metatranscriptomics approaches were used to evaluate the enrichment of specific members of the microbial community in the ruminal fiber and genes related to lignocellulolytic enzymes. The liquid and fiber fractions of the O. aries rumen revealed a microbial community dominated mainly by Firmicutes and Bacteroidetes throughout the experimental period. The genera Prevotella and Ruminococcus accounted for 20% and 4% of the bacterial community of rumen, respectively. In the fungal community, the phylum Neocallimastigomycota accounted for 91% of sequences and its main genera adhered on the ruminal fiber were Piromyces, Neocallimastix, Orpinomyces, Anaeromyces, Caecomyces and Cyllamyces. The genus Caecomyces was significantly more abundant in the ruminal fiber in animals fed on sugarcane bagasse. Furthermore, there was a significant increase in the frequency of enzymes, such as α-1,4-glucan, α-galactosidase, endo- 1,4-β-xylanase, β-xylosidase, xylose isomerase, cellobiose phosphorylase and α- Narabinofuranosidase in the bagasse treatment. Considering that the recovery of enzymes from ecosystems naturally evolved for degradation of biomass is a promising strategy to overcome the current inefficient enzymatic action in industrial production of biofuels, the results of this study bring great possibilities to increase the discovery and or recovery of enzymes from ruminants, as well as the possibility of the ruminal microbiome structure manipulation to be used as source of an enriched inoculum for biomass degradation in industrial processes.

Micoplasmas e ureaplasmas têm sido isolados de pequenos ruminantes, mas existem poucos estudos. O Mycoplasma ovine/caprine sorotipo 11, conhecido como cepa 2D, ainda não classificado como espécie, vem sendo relacionado a casos de vulvovaginite e problemas reprodutivos em ovinos e caprinos. Os ureaplasmas apresentam a habilidade em induzirem doenças no trato genital, confirmada por inoculações experimentais de isolados obtidos de animais doentes em animais saudáveis, resultando em moderada granularidade e hiperemia na vulva. Estes ureaplasmas não receberam ainda a designação de espécie, sendo apenas conhecidas suas características sorológicas, nas quais é fundamentada a classificação em nove sorotipos, sendo o IX relacionado a infertilidade e aborto em ovelhas. Este trabalho teve como objetivo o isolamento de micoplasmas e ureaplasmas do trato reprodutivo de fêmeas e machos das espécies caprina e ovina e tipificação genotípica dos isolados por meio de PFGE e sequenciamento do gene 16S rRNA. Foram obtidos 20 isolamentos de ureaplasma no trato reprodutivo de fêmeas e machos da espécie ovina, um isolamento de micoplasma e sete com crescimento misto de micoplasma e ureaplasma. Nas fêmeas da espécie caprina foram obtidos cinco isolamentos, sendo quatro de ureaplasma e um de micoplasma. Dos isolados submetidos a PFGE , 11 de origem ovina resultaram em oito diferentes perfis confirmando a capacidade da técnica em tipificar ureaplasma de origem ovina. O sequenciamento do gene 16S rRNA, analisado pelo UPGMA, permitiu agrupar seis isolados ao Ureaplasma diversum ATCC 49782, e quatro não foram agrupados com nenhuma outra espécies de ureaplasma, quando utilizado o ponto de corte 97%. Em nosso estudo, os isolados de ovino e caprino agrupados às referências de U. diversum não permite concluir que sejam da mesma espécie. A utilização do gene 16S rRNA gera grande quantidade de informações úteis para inferências filogenéticas e pode ser a primeira escolha na investigação de novas espécies. Técnicas filogenéticas como sequenciamento do espaço intergênico 16S-23S rRNA, e gene da urease podem auxiliaram futuramente na classificação dos isolados obtidos de ovino e caprino. / Mycoplasmas and or ureaplasmas have been isolated from small ruminants but are few studied. Mycoplasma ovine/caprine serotype 11, known as 2D strain, has not been classified yet as specie. However, it has been associated to vulvovaginitis and reproductive disorder in caprine and ovine. Ureaplasmas may cause genital tract diseases. Experimental infections with isolates recovered from sick animals resulted in granularity and hyperemia of the vulva. These have not been designated as specie but are divide in nine serological characteristics types. The serotype IX is associated to infertility and abortion in sheep. The present study aims the isolation of mycoplasmas and ureaplasmas from reproductive tract of ovine and caprine, genotyping of isolates by PFGE, and sequencing of their 16S rRNA. Ureaplasma isolates were recovered from the reproductive tract of 20 ovine, being them, male and female. Mycoplasma was isolated alone in one sample. A mixture of mycoplasma and ureaplasma was obtained in seven samples. On the material obtained from female caprine, five isolations were performed. Four of them were ureaplasma and one was a mycoplasma. Eleven isolates from ovine showed eight distinct profiles at PFGE, confirm that the method can typify ovine origin ureaplasmas. Six isolates were grouped to the Ureaplasma diversum ATCC 49782, through the sequencing of their 16S rRNA using the UPGMA. However, when using a 97% cutoff, four isolates could not be grouped to none of the ureaplasma specie. The isolates from ovine and caprine grouped to U. diversum, do not allow conclude that they are all the same specie. The use of 16S rRNA sequencing showed many useful information to phylogenetic inference, and can be the first choice for when investigating new species. Phylogenetic techniques, as sequencing of the intergenic space 16S-23S rRNA and urease gene, can be used to help the classification of new ureaplasma isolates from ovine and caprine.

Submitted by Angela Maria de Oliveira (amolivei@uepg.br) on 2018-07-24T16:47:17Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Silvia Ap F Albuquerque.pdf: 2057064 bytes, checksum: ca90a9ed638cc415e9baf99ff0b848ab (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-24T16:47:17Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Silvia Ap F Albuquerque.pdf: 2057064 bytes, checksum: ca90a9ed638cc415e9baf99ff0b848ab (MD5) Previous issue date: 2016-02-25 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Rizobactérias promotoras do crescimento vegetal (PGPR) estimulam o desenvolvimento das plantas hospedeiras, e a planta, por sua vez, em conjunto com as condições de cultivo, têm um significativo efeito sobre a estrutura da comunidade bacteriana da rizosfera. Nesse estudo, foi analisada a diversidade de rizobactérias isoladas de milho inoculado com diferentes biofertilizantes e cultivado na presença de diferentes doses de nitrogênio. Além disso, foi avaliado o perfil dos isolados por espectrometria de massa e o potencial de tais isolados na produção de sideróforos, protease, compostos indólicos, cianeto e celulase e na solubilização de fosfato; atividades relacionadas à promoção do crescimento vegetal. Os setenta e sete isolados bacterianos obtidos a partir do uso de cinco diferentes meios de cultivo (JMV, JNFb, NFb, LGI e LGI-P) livres de amônia, foram identificados pelo sequênciamento parcial do gene 16S rRNA. O biofertilizante e as dosagens de nitrogênio não interferiram significativamente na composição da comunidade de bactérias diazotróficas isoladas da rizosfera de milho. O meio JNFb permitiu o isolamento de um número maior de indivíduos, e esses apresentaram maior riqueza e diversidade. Dentre os isolados, houve a predominância das classes β e γProteobacteria, sendo Burkholderia o gênero mais abundante. A análise por espectrometria de massa mostrou potencial para separar gêneros bem representados em nível de estirpe. Mais da metade dos isolados produziram sideróforos (58%) e protease (50,7%); solubilização de fosfatos (36,2%) e aproximadamente um quarto deles (23,1%) foram capaz de produzir celulase. A produção de cianeto de hidrogênio se mostrou bastante rara, sendo detectada em apenas 4,3% dos isolados, todos pertencentes ao gênero Pseudomonas sp. Todas as bactérias analisadas apresentaram ao menos uma atividade e 55% apresentam três ou mais. Análises de componentes principais indicaram que (1) os gêneros Burkholderia sp. e Luteibacter sp., tem correlação significativa (p <0,05 ou p<0,001) com a produção de protease, sideróforos e solubilização de fosfato, (2) Bacillus sp. e Luteibacter sp., com produção de compostos indólicos e celulase e (3) Pseudomonas sp., com produção de protease, cianeto e sideróforos, compostos indólicos e celulase. Diante da demanda de biofertilizantes de gramíneas capazes de substituir parcialmente ou integralmente o uso de fertilizantes químicos, os isolados que apresentaram diversas atividades promotoras do crescimento vegetal se mostram promissores para aplicação como biofertilizante. / Plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) stimulate the development of their host plant, and the plant, in turn, together with the culture conditions has a significant effect on rhizospheric bacterial community structure. In this study, the diversity of cultivable bacteria associated with the rizosphere of maize inoculated with different biofertilizers and growth in different nitrogen doses was analyzed. It was also evaluated the mass spectrometry profile of the isolates and their potential to produce siderophores, protease, indole compounds, cyanide and cellulose, and to solubilize phosphate, all activities related to plant growth promotion. The seventy seven bacterial isolates obtained by the use of five different nitrogen-free media (JMV, JNFb, NFb, LGI e LGI-P) were identified by partial sequencing of the 16S rRNA gene. The biofertilizers and the nitrogen doses did not interfere in the composition of the isolated diazotrophs from maize rhizosphere. JNFb medium permitted the isolation of a greater number of individuals, and they presented the highest richness and diversity. Among the isolates, there was a predominance of β e γ-Proteobacteria classes, being Burkholderia the most abundant genus. Mass spectrometry analysis showed potential to separate well represented genus into strain, evidencing new species of the Burkholderia genus. More than half of the isolates produced siderophores (58%) and protease (50.7%); solubilize phosphate (36.2%) and approximately a quarter of them (23.1%) were able to produce cellulase. The hydrogen cyanide production showed to be rare, being detected in only 4.3% of isolates, all belonging to the genus Pseudomonas sp.. All analyzed bacteria showed at least one activity and 55% showed three or more. Principal component analysis indicated that (1) Burkholderia sp. e Luteibacter sp. genus have significant correlation (p <0,05 or p<0,001) with protease and siderophores production and phosphate solubilization, (2) Bacillus sp. and Luteibacter sp. have significant correlation with indole compounds and cellulase production and (3) Pseudomonas sp. has significant correlation with protease, cyanide, siderophores, indole compounds and cellulase production. Based on the demand for grass biofertilizers able to partially or completely replace chemical fertilizers, the isolates which have several activities that promote plant growth are promising to be used as biofertilizer. Some genus clearly they share at least three equal activities featuring redundant function among them.

Neste trabalho desenvolvemos métodos analíticos e moleculares para a detecção, isolamento e classificação filogenética de Alicyclobacillus spp. a partir de sucos de laranja e frutos ácidos, pelas técnicas: RT-PCR, nested RT-PCR, RAPD, seqüenciamento do 16S rRNA e análise por métodos eletroforéticos. A sensibilidade na detecção dos A. acidoterrestris foi melhorada por meio de reações de nested RT-PCR, utilizando primers internos (amplicon de 191 bp) que foram desenhados a partir do primeiro amplicom de 294 bp. O limite de detecção foi estudado com as reações RT-PCR e nested RT-PCR, sendo capazes de detectar concentrações de 0,1 UFC mL-1 para culturas puras e 2 UFC mL-1 em sucos de laranja artificialmente inoculados. A inibição de esporos de A. acidoterrestris também foi estudada para monitorar a diminuição da viabilidade com tratamento térmico e Sapindus saponaria (200 mg L-1), utilizando RT-PCR e nested RT-PCR. Com o tratamento térmico de 99 oC por 1 h o grau de inibição dos esporos foi de 96,3%. Enquanto que, com a fração purificada de S. saponaria (200 mg L-1) incubada à 45 oC por 2 dias foi de 93,6%, mas com incubação de 99 oC por 1 h foi de 98,7%, na mesma concentração de saponina. Todas as análises de quantificação de produtos de RT-PCR e nested RT-PCR foram analisadas por meio de eletroforese em gel de agarose e eletroforese capilar em microchip no Bioanalyzer 2100 (Agilent), com os kits DNA 500 e DNA 1000 LabChip®, obtendo-se maior sensibilidade nos microchips. A classificação molecular de dezenove cepas, isoladas a partir de diferentes sucos e frutos ácidos, foram estudadas utilizando RAPD-PCR e eletroforese capilar em microchips. Utilizando cinco primers aleatórios nas reações de RAPD, foi possível estudar os polimorfismos analisados nos microchips. Segundo as análises eletroforéticas, as cepas de suco concentrado e diluído de laranja (1, 2, 6) suco concentrado de limão (lim) e suco de laranja in natura (T2, T3), apresentaram similaridades genéticas com a A. acidoterrestris. O estudo de análise filogenética baseada na comparação de seqüências de DNA da região variável do gene 16S rRNA de Alicyclobacillus acidoterrestris, foi utilizado para identificar e agrupar onze cepas isoladas de superfícies e sucos de frutos ácidos. Na árvore filogenética gerada pelo método neighbor joining e bootstrap 1000x, as cepas analisadas mostraram similaridades de 99% entre todas elas, observando-se uma maior similaridade do controle A. acidoterretris (C2) com a cepa isolada de suco concentrado de limão (lim), e uma boa discriminação entre controles das espécies A. acidocaldarius, A. cicloheptanicus, A. sendaiensis e Sulfobacillus acidophilus. / In this work, we developed analytical and molecular methods for detection, isolation and phylogenetic classification of Alicyclobacillus spp. from orange juice and acid fruits using RT-PCR, nested RT-PCR, RAPD and sequencing of 16S rRNA techniques and electrophoretic methods of analysis. The sensitivity on the detection of A. acidoterrestris in orange juice was improved by nested RT-PCR, using internal primers (amplicon of 191 bp) that were designed after sequencing the first amplicon (294 bp). The detection limit was studied with RT-PCR and nested RT-PCR assay, it was able to detect concentrations of 0.1 UFC mL-1 for media culture and 2 UFC mL-1 in inoculated orange juice. The inhibition in spores from A. acidoterrestris was also studied to monitoring the diminution of viability with heat treatment and Sapindus saponaria (200 mg mL-1), using RT-PCR and nested RT-PCR assays. The inhibition by heat treatment at 99 oC for 1 h was 96.3%. However, incubation with S. saponaria at 45 oC for 2 days inhibited 93,6%, however, with incubation of 99 oC for 1 h was 98,7%, in the same concentration of saponin. The quantification of the RT-PCR and nested RT-PCR amplification product were accomplished by capillary electrophoresis in microchips using the Bioanalyzer 2100 in conjunction with the LabChip (TM) DNA 500 and DNA 1000. The molecular classification of nineteen strains isolated from different juice and acidic fruit, were studied using RAPD-PCR and capillary electrophoresis in microchips. Using five random primers in the RAPD assay, it was possible to study the polymorphisms analyzed in microchips. According to electrophoresis analyses, the strains from concentrated and diluted orange juices (1, 2, 6), lemon concentrated juice (lim) and natural orange juice (T2, T3), showed genetic similarities with the A. acidoterrestris. The study of the phylogenetic analyses based on DNA comparison sequences of the variable region of 16S rRNA gene from Alicyclobacillus acidoterrestris, was utilized for the identification and grouping of eleven strains isolated from surface and juice of acid fruits. In the phylogenetic tree produced by neighbor joining and bootstrap 1000, the strains showed similarities of 99% among all strains, showing a high similarity of A. acidoterrestris with a strain isolated from lemon concentrate juice (lim), and a good discrimination between the species A. acidocaldarius, A. cycloheptanicus, A. sendaiensis and Sulfobacillus acidophilus.

Made available in DSpace on 2015-04-01T12:09:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 4073387 bytes, checksum: 8309cf98c379c11892e9d5cd2fae29dd (MD5) Previous issue date: 2011-12-01 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Soil samples of native pasture (site A) and of soil cultivated with grass Paspalum conjugatum, Bergius (site B) collected from Caatinga vegetation in the semi-arid region in Paraíba state (07°23‟27 S 36°31‟58 W) were utilized for constructing four metagenomic libraries, aiming the evaluation of microbial diversity through amplification of gene 16S rRNA of domains Bacteria and Archaea. The metagenomic DNAs were extracted by utilizing FastDNA® SPIN Kit for Soil (BIO 101), which were amplified by PCR, by using universal primers 27F / 1525R (Bacteria) and 20F / 958R (Archaea). The purified fragments were linked to vector pGEM Teasy and transformed by thermal shock in chemically competent Escherichia coli DH10B. Transformants were cultivated in LB/Ampicillin medium (100 μM/ml), IPTG (800 μg/mL) and XGal (80 μg/mL) at 37ºC/18-20 h. A selection of 250 clones of each library was performed, sequenced and after discarding the low quality sequences and chimerics, 64 and 68 sequences were obtained (Bacteria) and 89 and 141 sequences (Archaea) from soils of sites A and B, respectively, which were compared to public bank of data RDB and NCBI (similarity >95%). In site A the phylum Acidobacteria (48.4%) was the most abundant, followed by phyla Bacteroidetes (10.9%), Proteobacteria (10.9%), and Firmicutes (6.3%). In site B Proteobacteria (45.6%) was the most abundant, followed by Firmicutes (10.3%), Acidobacteria (8.8%), Bacterioidetes (7.3%); and also Cyanobacteria (1.5%) and Planctomycetes (1.5%) which were not found in site A. Among the sequences obtained, 23.4% (site A) and 25.0% (site B) were not classified (similarity <95%). In the domain Archaea the phyla found were Euryarchaeota (3.4 and 45.4%) and Crenarchaeota (2.2 and 3.5%), in sites A and B, respectively; it should be observed that 94.4% and 51.1% of the sequences were not classified (similarity <95%), between sites A and B, respectively. Larger diversity (Shannon‟s índex), richness (Chao 1), and distribution (equity index) of communities were observed at species level, in the phyla Bacteria and Archaea, in both sites. The metagenomic libraries 16S rRNA of Bacteria and Archaea, when compared by using the LIBSHUFF program, differed significantly (p<0.0001). The results of the present study showed the occurrence of a great diversity of bacteria and archaea in that semi-arid environment, with peculiar features of elevated temperature and hydric limitations, emphasizing the possibility of investigations on search of new genes and/or microbial isolates with biotechnological potential. / Amostras do solo da pastagem nativa (sítio A) e sob cultivo do capim marrequinho (Paspalum conjugatum, Bergius) (sítio B), coletadas na região semi-árida do bioma Caatinga, Paraíba, (07°23‟27 S 36°31‟58 O), foram utilizadas para construção de quatro bibliotecas de clones metagenômicos, para avaliação da diversidade microbiana pela amplificação do gene 16S rRNA dos domínios Bacteria e Archaea. Os DNA metagenômicos foram extraídos utilizando FastDNA® SPIN Kit for Soil (BIO 101), os quais foram amplificados por PCR utilizando primers universais, 27F / 1525R (Bacteria) e 20F / 958R (Archaea). Os fragmentos purificados foram ligados ao vetor pGEM Teasy e transformados por choque térmico em Escherichia coli DH10B quimicamente competente. Os transformantes foram cultivados em meio Agar LB/Ampicilina (100 μ/mL), IPTG (800 μg/μL) e XGal (80 μg/μL), a 37ºC/18-20 h. Foram selecionados 250 clones de cada biblioteca os quais foram sequenciados e após descarte das sequências de baixa qualidade e quiméricas, foram obtidas 64 e 68, 89 e 141 sequências para Bacteria e Archaea, nos solos dos sítios A e B, respectivamente, as quais foram comparadas em banco de dados públicos RDB e NCBI (≥95% de similaridade). No sítio A o filo Acidobacteria (48,4%) foi o mais abundante, seguido dos filos Bacteroidetes (10,9%), Proteobacteria (10,9%), e Firmicutes (6,3%). No sítio B Proteobacteria (45,6%) foi o de maior destaque, seguido de Firmicutes (10,3%), Acidobacteria (8,8%), Bacterioidetes (7,3%); e ainda Cyanobacteria (1,5%) e Planctomycetes (1,5%), que não foram encontrados no sítio A. Entre as sequências geradas, 23,4% (sítio A) e 25,0% (sítio B) não foram classificadas (similaridade <95%). No domínio Archaea foram encontrados os filos Euryarchaeota (3,4 e 45,4%) e Crenarchaeota (2,2 e 3,5%), nos sítios A e B, respectivamente; destacando-se que 94,4% e 51,1% das sequências não foram classificadas (similaridade <95%), entre os sítios A e B, respectivamente. Uma maior diversidade (índice de Shannon), riqueza (índice Chao 1) e distribuição (índice de equidade) das comunidades foram observadas no nível de espécies, tanto para Bacteria como para Archaea, nos dois sítios. As bibliotecas de clones metagenômicos 16S rRNA de Bacteria e Archaea, quando comparadas, utilizando-se o programa LIBSHUFF, diferiram significativamente (p<0,0001). Os resultados desse estudo mostraram a ocorrência de uma grande diversidade de bactérias e arqueas, nesse tipo de ambiente pouco estudado e com características peculiares de temperatura elevada e limitações hídricas, com possibilidade de busca de novos genes e/ou isolados microbianos, com potencial biotecnológico.

Made available in DSpace on 2015-04-01T14:16:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1357815 bytes, checksum: a8f6776ded44373a63e29cc1331535eb (MD5) Previous issue date: 2013-04-19 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Reproductive disorders in bovines can be caused by various pathogens, which might already be present in the reproductive tract. The microbial community of the reproductive apparatus, when known, can provide information about the health of the host. The metagenomics has been used to characterize and obtain genetics information about microbial communities in various environments and can relate certain diseases with changes in community composition. In this study, samples were collected from the secretion of mucosa of vaginal surface of 05 healthy cows and 05 cows that showed symptoms of reproductive disorders. Metagenomics DNA samples were extracted of secretion samples and amplified with primers for the V5-V6 regions of the 16S rRNA and sequenced on the platform "Ion Torrent Personal Genome Machine - PGM". The data were processed to remove low quality sequences and chimeras, with the Mothur program, then the data were released in the Ribosomal Database Project for classification of OTU's. Local blastn was performed and this results was loaded in MEGAN program, for viewing profiles and taxonomic microbial attributes. The control profile showed a total of 15 taxa, being the taxa Bacteroides, Enterobacteriaceae and Victivallis, with the highest representation of OTU's; the positive profile showed 68 taxa, and Bacteroides, Enterobacteriaceae, Histophilus, Victivallis, Alistipes and Coriobacteriaceae, the taxa with more OTU's representation. The genus Histophilus have pathogenics species in reproductive tract of cattle. There was a change in the community composition, well as in microbial attributes of profiles there may be a relationship between the pathogen and of other representatives taxa, in production of metabolites to disease progression. / Distúrbios reprodutivos em bovinos podem ser causados por diversos patógenos, que poderiam já estar presentes no trato reprodutivos. A comunidade microbiana dos aparelhos reprodutivos, quando conhecida, pode fornecer informações a respeito da saúde do hospedeiro. A metagenômica tem sido utilizada para caracterizar e obter informações genéticas a respeito de comunidades microbianas de diversos ambientes, podendo relacionar determinadas doenças com alterações na composição das comunidades. Nesse trabalho, foram coletadas amostras de secreção de mucosa da superfície vaginal de 05 vacas sadias e 05 vacas que apresentaram sintomas de distúrbios reprodutivos. Amostras de DNA metagenômico foram extraídas das amostras de secreção e amplificadas com primers para as regiões V5-V6 do gene 16S rRNA e sequenciadas na plataforma Ion Torrent Personal Genome Machine PGM . Os dados foram tratados para retirada de sequencias de baixa qualidade e quimeras, com o programa Mothur; em seguida, os dados foram lançados no Ribosomal Database Project para classificação das OTU´s. Blastn local foi efetuado e seus resultados foram carregados no programa MEGAN, para visualização de perfis taxonômicos e atributos microbianos. O perfil controle apresentou um total de 15 taxa, sendo os taxa Bacteroides, Enterobacteriaceae e Victivallis, os de maior representação de OTU´s; o perfil com distúrbios apresentou 68 taxa, sendo Bacteroides, Enterobacteriaceae, Histophilus, Victivallis, Alistipes, e Coriobacteriaceae, os taxa com maior representação de OTU´s. O gênero Histophilus possui espécies patogênicas em trato reprodutivo de bovinos. Observou-se uma alteração na composição das comunidades estudadas, bem como nos atributos microbianos dos perfis podendo haver uma relação entre patógenos e representantes de outros taxa, na produção de metabólitos para progressão da doença.

Micoplasmas e ureaplasmas têm sido isolados de pequenos ruminantes, mas existem poucos estudos. O Mycoplasma ovine/caprine sorotipo 11, conhecido como cepa 2D, ainda não classificado como espécie, vem sendo relacionado a casos de vulvovaginite e problemas reprodutivos em ovinos e caprinos. Os ureaplasmas apresentam a habilidade em induzirem doenças no trato genital, confirmada por inoculações experimentais de isolados obtidos de animais doentes em animais saudáveis, resultando em moderada granularidade e hiperemia na vulva. Estes ureaplasmas não receberam ainda a designação de espécie, sendo apenas conhecidas suas características sorológicas, nas quais é fundamentada a classificação em nove sorotipos, sendo o IX relacionado a infertilidade e aborto em ovelhas. Este trabalho teve como objetivo o isolamento de micoplasmas e ureaplasmas do trato reprodutivo de fêmeas e machos das espécies caprina e ovina e tipificação genotípica dos isolados por meio de PFGE e sequenciamento do gene 16S rRNA. Foram obtidos 20 isolamentos de ureaplasma no trato reprodutivo de fêmeas e machos da espécie ovina, um isolamento de micoplasma e sete com crescimento misto de micoplasma e ureaplasma. Nas fêmeas da espécie caprina foram obtidos cinco isolamentos, sendo quatro de ureaplasma e um de micoplasma. Dos isolados submetidos a PFGE , 11 de origem ovina resultaram em oito diferentes perfis confirmando a capacidade da técnica em tipificar ureaplasma de origem ovina. O sequenciamento do gene 16S rRNA, analisado pelo UPGMA, permitiu agrupar seis isolados ao Ureaplasma diversum ATCC 49782, e quatro não foram agrupados com nenhuma outra espécies de ureaplasma, quando utilizado o ponto de corte 97%. Em nosso estudo, os isolados de ovino e caprino agrupados às referências de U. diversum não permite concluir que sejam da mesma espécie. A utilização do gene 16S rRNA gera grande quantidade de informações úteis para inferências filogenéticas e pode ser a primeira escolha na investigação de novas espécies. Técnicas filogenéticas como sequenciamento do espaço intergênico 16S-23S rRNA, e gene da urease podem auxiliaram futuramente na classificação dos isolados obtidos de ovino e caprino. / Mycoplasmas and or ureaplasmas have been isolated from small ruminants but are few studied. Mycoplasma ovine/caprine serotype 11, known as 2D strain, has not been classified yet as specie. However, it has been associated to vulvovaginitis and reproductive disorder in caprine and ovine. Ureaplasmas may cause genital tract diseases. Experimental infections with isolates recovered from sick animals resulted in granularity and hyperemia of the vulva. These have not been designated as specie but are divide in nine serological characteristics types. The serotype IX is associated to infertility and abortion in sheep. The present study aims the isolation of mycoplasmas and ureaplasmas from reproductive tract of ovine and caprine, genotyping of isolates by PFGE, and sequencing of their 16S rRNA. Ureaplasma isolates were recovered from the reproductive tract of 20 ovine, being them, male and female. Mycoplasma was isolated alone in one sample. A mixture of mycoplasma and ureaplasma was obtained in seven samples. On the material obtained from female caprine, five isolations were performed. Four of them were ureaplasma and one was a mycoplasma. Eleven isolates from ovine showed eight distinct profiles at PFGE, confirm that the method can typify ovine origin ureaplasmas. Six isolates were grouped to the Ureaplasma diversum ATCC 49782, through the sequencing of their 16S rRNA using the UPGMA. However, when using a 97% cutoff, four isolates could not be grouped to none of the ureaplasma specie. The isolates from ovine and caprine grouped to U. diversum, do not allow conclude that they are all the same specie. The use of 16S rRNA sequencing showed many useful information to phylogenetic inference, and can be the first choice for when investigating new species. Phylogenetic techniques, as sequencing of the intergenic space 16S-23S rRNA and urease gene, can be used to help the classification of new ureaplasma isolates from ovine and caprine.

Dentre os vários microrganismos que fazem parte de microecossistemas de solos, as bactérias do gênero Burkholderia apresentam-se de interesse por possuírem amplo potencial agrícola e biotecnológico. São portadores de uma infinidade de características, como por exemplo: promotoras de crescimento em plantas com a fixação biológica do nitrogênio e produção de fitormônios, supressores de algumas doenças, biorremediadores, agentes de biocontrole e produtores de biopolímeros. Descrito por Yabuuchi et. al. (1992), o gênero ainda precisa ser melhor caracterizado, pois sua taxonomia vem sendo modificada de tal forma que novos componentes estão sendo frequentemente propostos, especialmente pela identificação de novos nichos ecológicos e sua ação no ambiente. No Parque Nacional de Caxiuanã - Pará, Amazônia Oriental, os solos de origem antropogênica denominados Terra Preta Arqueológica (TPA) são caracterizados pelos elevados materiais orgânicos, que se auto-sustentam. Neste estudo, a diversidade do gênero Burkholderia foi avaliada por meio de técnicas microbiológicas (cultivo) e moleculares, como a Eletroforese em Gel com Gradiente Desnaturante (DGGE) com sequências iniciadoras específicas para o gênero, usando o gene 16S rRNA. Os fragmentos amplificados foram analisados pelo sequenciador automático ABI 3100, com o intuito de gerar informações sobre as principais espécies de Burkholderia presentes em sítios de TPA e comparados com as espécies encontradas em solo de floresta nativa natural, adjacente à TPA. Apesar da maior estabilidade e presença de matéria orgânica em sítio TPA, os resultados revelam que as espécies do gênero Burkholderia são numericamente superiores em solo de floresta nativa natural, vindo a confirmar que aspectos físico-químicos (ex. pH) e a vegetação predominante nas áreas de estudo afetam diretamente na composição das comunidades microbianas. Algumas estirpes encontradas destacam-se pelo seu papel funcional no solo, muitas delas comumente associadas à fixação biológica de nitrogênio. Foram encontradas as espécies Burkholderia silvatlantica, Burkholderia vietnamiensis, Burkholderia nodosa, Burkholderia terrae, Burkholderia hospita / Amongst the various microorganisms from soil microecossystems, the genus Burkholderia has been studied since several properties have been discovered more recently, with high potential for agricultural and biotechnological exploitation. Species from this genus have infinite features, e.g. plant growth promoter with biological nitrogen fixation and production of phytohormones, capability for suppression of some diseases, bioremediation, biological control and production of biopolymers. Described by Yabuuchi et al. (1992), the genus still needs to be better characterized, since its taxonomy is frequently modified and several new species have been proposed, especially after recent identification of new ecological niches and their action in the environment. In the National Park of Caxiuanã at the Eastern Amazon region are found anthrosols with past anthropogenic activity, constructed by the pre-historic Amerindians. These anthrosols are known as Archaeological Dark Earth (ADE) which has high and stable concentration of organic matter, thus keep their self-sustainability due to this high soil fertility. In this study, the diversity of genus Burkholderia was evaluated by means of microbiological (bacterial cultivation) and the molecular technique Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) using short and specific sequences designed for this genus, using the gene 16S rRNA. The amplified fragments from TPA were automated sequenced (ABI 3100) and the ADE diversity was compared with a pristine forest soil, located adjacent to TPA. Although the high stability and organic matter content in the ADE, the results showed a greater number of species from the genus Burkholderia in the pristine forest soil, located at the surrounding of the TPA soil. These data indicate that physical-chemical parameters (e.g. pH) and the prevalent vegetation in the studied areas can affect directly the structure of the microbial communities. Some strains could be distinguished by their functional role in soil, such as those associated with the ability for biological nitrogen fixation. The main species were Burkholderia silvatlantica, Burkholderia vietnamiensis, Burkholderia nodosa, Burkholderia terrae, Burkholderia hospita

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-07-22T12:40:38Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação - Nataliane Marques de Vasconcelos.pdf: 1186432 bytes, checksum: 7aaaefe15061c83ecc86656db0d731f1 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-22T12:40:38Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação - Nataliane Marques de Vasconcelos.pdf: 1186432 bytes, checksum: 7aaaefe15061c83ecc86656db0d731f1 (MD5) Previous issue date: 2016-02-26 / CNPq / A resistência microbiológica aos antibióticos constitui uma série problemas de saúde pública por dificultar o tratamento das infecções. As actinobactérias são fontes importantes para a descobertas de novas moléculas com atividades biológicas. A este grupo, o gênero Streptomyces possuem dentre outros, dois grupos de enzimas multimoduladoras conhecidas como policetídeo sintase (PKS) e peptídeo sintase não ribossomal (NRPS), genes relacionados com a produção de metabólitos secundários. O presente trabalho teve como objetivo investigar o potencial in vitro de metabólitos bioativos produzidos por Actinobactérias isoladas do bioma Caatinga com atividade contra diferentes isolados clínicos de Candida spp. Após ensaio primário das 45 actinobactérias apenas a linhagem PR- 32 apresentou atividade contra Candida spp, com halos de até 20 mm no meio ISP2. Posteriormente, essa linhagem foi cultivada em seis diferentes meios de cultura sendo observada melhor produção do metabólito secundário no meio 400 em 48 horas (h) de fermentação. A determinação da concentração mínima inibitória (CMI) foi determinada a partir do extrato etanólico da biomassa de PR- 32 em pH 7.0 e foi evidenciada uma CMI entre 31,25 μg/mL a 3,9 μg/mL para as leveduras testadas. A cinética de morte reforçou o resultado da CMI e mostrou que no período de 4-8 h o extrato inibiu as cepas de Candida spp. A caracterização da actinobactéria foi identificada por metodologias clássicas e pela pesquisa do gene 16S rRNA como Streptomyces sp. PR- 32. Os resultados desta caracterização sugerem uma possível espécie nova, contudo outras análises ainda precisam ser realizadas. Foi evidenciada a presença do gene nrps com aproximadamente 750 kb. Diante destes resultados podemos concluir que Streptomyces sp. PR- 32 é um isolado promissor para produção de compostos antifúngicos, sendo possível sugerir que a atividade biológica deste metabólito secundário é regulado por peptídeo sintase não ribossomal (NRPS). / The microbial resistance to antibiotics is a series of public health problems for hindering the treatment of infections. The actinomycetes are important sources for new molecules with biological activities discovered. In this group, the genus Streptomyces have among others, multimoduladoras two groups of enzymes known as polyketide synthase (PKS) and non-ribosomal peptide synthase (NRPS), genes involved in production of secondary metabolites. This study aimed to investigate the potential in vitro bioactive metabolites produced by isolated Actinobacteria biome Caatinga with activity against different clinical isolates of Candida spp. After screening of actinomycetes in 45 primary test only the PR- 32 strain showed activity against Candida spp, with halos of up to 20 mm in the middle ISP2. Subsequently, this strain was grown in six different culture media is best seen in secondary metabolite production means 400 at 48 h of fermentation. The determination of the minimum inhibitory concentration (MIC) was determined from the ethanolic extract of the biomass of PR- 32 at pH 7.0 and one MIC was observed between 31.25 mg / mL 3.9 mg / mL for yeast tested. The kinetics of death reinforced the result of CMI and showed that in the 4-8 hour period the extract inhibited the strains of Candida spp. The characterization of actinobacteria was identified by classical methods and research 16S rRNA gene as Streptomyces sp. PR- 32. The results of this characterization suggests a possible new species, but other tests that must be performed. the presence of the NRPS gene of approximately 750 kb was observed. From these results we conclude that Streptomyces sp. PR- 32 is a promising isolated to produce antifungal compounds, it is possible to suggest that the biological activity of this secondary metabolite is regulated by peptide synthase not ribosomal (NRPS).