ABSTRACT PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF CYTOPLASMIC AND PROTEASOME ASSOCIATED CHYMOTRYPSIN-LIKE PROTEASES FROM THERMOPLASMA VOLCANIUM &Ouml / zdemir, F.inci Ph.D., Department of Biology Supervisor: Prof. Dr. Semra Kocabiyik September, 147 pages In this study, two novel cytoplasmic serine proteases were isolated and characterized from thermophilic archaea Thermoplasma volcanium. The first protease was purified by ion exchange and affinity chromatographies and identified as a chymotrypsin-like serine protease mainly based on its substrate profile and inhibition pattern. The presence of protease activity was analyzed by gelatin zymography which was detected as a single band (35 kDa). Optimum temperature was found to be 60oC for azocasein hydrolysis and 50oC for N-Suc-Phe-pNA hydrolysis. Optimum activity was observed in the pH range of 6.0-8.0 with a maximum value at pH 7.0. The Km and Vmax values for the purified protease were calculated to be 2.2 mM and 40 &micro / moles of p-nitroanilide released min-1.ml-1, respectively, for N-Suc-Phe-PNA as substrate. Ca2+ and Mg2+ at 4 mM concentrations were the most effective divalent cations in activating the enzyme. In the second stage of this study, 20S proteasome of Tp. volcanium with substantial chymotrypsin-like activity was purified and characterized. This enzyme complex was purified with 19.1 U/mg specific activities from cell free extract by a four-step procedure. SDS-PAGE analysis revealed two strong bands with relative molecular masses of 26 kDa (&amp / #945 / -subunit) and 21.9 kDa (&amp / #946 / -subunit). Tp. volcanium 20S proteasome predominantly catalyzed cleavage of peptide bonds carboxyl to the acidic residue Glu (postglutamyl activity) and the hydrophobic residue Phe (chymotrypsin-like activity) in short chromogenic peptides. Low-level hydrolyzing activity was also detected carboxyl to basic residue Arg (trypsin-like activity). Chymotrypsin-like activity of Tp. volcanium 20S proteasome was significantly inhibited by chymotrypsin specific serine protease inhibitor chymostatin. When N-CBZ-Arg was used which is a substrate for trypsin, 20S proteasome was strongly inhibited by TLCK. The optimum temperature for Ala-Ala-Phe-pNA hydrolysis by the Tp. volcanium 20S proteasome was 55oC and the optimum pH was 7.5. The chymotryptic activity was significantly enhanced by divalent cations such as Ca+2 and Mg2+ at high concentrations, i.e. 125-250 mM. Keywords:Serine protease, 20S proteasome, archaea, thermophilic protease, Thermoplasma volcanium, chymotrypsin-like serine protease.

Das Ubiquitin-Proteasom-System sorgt in eukaryontischen Zellen für einen kontrollierten Abbau von Proteinen. Das 20S Proteasom ist als Multikatalytischer Protease Komplex der zentrale Bestandteil dieses Systems. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass sich gereinigtes 20S Proteasom aus HeLa-Zellen chromatographisch in Subtypen auftrennen lässt, die sich strukturell und in ihrer proteolytischen Aktivität unterscheiden. Nach Induktion der Zellen mit gamma-Interferon (gamma-IFN) werden Immuno-Proteasomen gebildet und es kommt zu einer Veränderung des Subtypen-Musters und der Aktivitäten. Unter dem Einfluss von gamma-IFN bilden sich hauptsächlich Mischkomplexe mit sowohl konstitutiven als auch Immuno-Untereinheiten. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass in den Zellkompartimenten Cytoplasma, Zellkern und Microsomen von HeLaS3-Zellen unterschiedliche 20S Proteasom-Subtypen vorkommen. Dies war unter anderem auf eine unterschiedliche Glykosylierung einzelner proteasomaler Untereinheiten zurückzuführen. Die genaue Kenntnis von Struktur und Funktion der 20S Proteasom-Subtypen ist im Hinblick auf neue diagnostische und therapeutische Ansätze in der Humanmedizin von großem Interesse. / The Ubiquitin-proteasome system is responsible for the regulated protein degradation in eucaryotic cells. The 20S proteasome is as a multicatalytic protease the central complex of these system. This study has shown that it is possible to separate 20S proteasome subtypes from HeLa cells by chromatography. 20s proteasome subtypes differ in structure and proteolytic activity. The subtype-pattern and the activity are significantly changed after an induction of the cells with gamma-Interferon (gamma-IFN) under formation of immuno proteasomes. After gamma-IFN induction mainly mixed complexes have been formed with both constitutive and immuno subunits. Further it has been shown that in cell compartements cytoplasm, microsomes and nucleus of HeLaS3 cells different 20S proteasome subtypes are located. Among other things glycosylation of some subunits is responsible for that phenomenon. With regard to new strategies in diagnostic and therapy of human diseases the exactly knowledge of structure and function of the proteasome subtypes is a case of interest.

Der Großteil MHC Klasse I restringierter Epitope wird bei der Proteindegradation durch das Ubiquitin Proteasom System (UPS) generiert. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle des UPS in der Antigenpräsenation in einer Coxsackievirus B3 (CVB3) induzierten akuten und chronischen Myokarditis untersucht. Für in vitro Degradationsexperimente mit isolierten 20S Proteasomen wurden CVB3 Polypeptide synthetisiert und die Degradationsprodukte massenspektrometrisch analysiert. Eine erhöhte Substratumsatzrate und eine Verschiebung von Schnittpräferenzen durch Immunoproteasomen oder unter dem Einfluss von PA28 führten zu einer verbesserten Generierung immunrelevanter CVB3 Fragmente. Inflammatorische Kardiomyopathien können in Mäusen durch eine CVB3 Infektion ausgelöst werden. Resistente Stämme (C57BL/6) eliminieren das Virus vollständig, in anfälligen Mäusen (A.BY/SnJ) erfolgt keine vollständige Elimination. In Herzen gesunder Mäuse werden vorwiegend konstitutive 20S Proteasomen exprimiert. Eine myokardiale Entzündung, ausgelöst durch eine CVB3 Infektion, führte in den Herzen beider Mausstämme zu der Bildung von Immunoproteasomen, was zu einer gesteigerten Generierung immunrelevanter CVB3 Fragmente führte. Die größte Menge immunrelevanter Fragmente wurden durch Proteasomen gebildet, die am Tag vier aus den Herzen akut erkrankender C57BL/6 Mäuse und am Tag acht aus chronisch erkrankenden A.BY/SnJ Mäusen isoliert wurden. Dies korrelierte mit der Inkorporation von Immunountereinheiten in de novo assemblierende Proteasomen und einer unterschiedlichen Interferon (IFN) Typ I Kinetik. In Geweben lymphatischen Ursprungs hingegen waren Zusammensetzung und proteolytische Aktivität der Proteasomen im Verlauf der Infektion in beiden Mausstämmen unverändert. Die vorliegende Arbeit unterstreicht die Bedeutung einer zeitlich optimalen IFN Sekretion an der Infektionsstelle, die zu der Anpassung des UPS an die inflammatorischen Bedingungen führt. / The recognition of viral antigens bound to major histocompatibility complex (MHC) class I molecules by CD8+ T cells is crucial for virus elimination. Most MHC class I restricted antigenic peptides are produced by the Ubiquitin Proteasome System (UPS). In the present study, the impact of the UPS in antigen presentation during Coxsackievirus B3 (CVB3) induced acute and chronic myocarditis has been investigated. To examine whether the proteasome is involved in the generation of MHC class I ligands derived from the CVB3 polyprotein, polypeptides were synthesized for in vitro processing by 20S proteasomes. Mass spectrometry analysis demonstrated an enhanced generation of immunorelevant CVB3 fragments due to an increased substrate degradation rate and altered cleavage site preferences by immunoproteasomes or in the presence of PA28. Murine models of CVB3 induced myocarditis mimic human disease pattern with diverse outcomes. Permissive mice (A.BY/SnJ) develop chronic myocarditis with cardiac CVB3 persistence whereas resistant mice (C57BL/6) recover and eliminate the virus after acute infection. Constitutive 20S proteasomes are mainly expressed in hearts of healthy mice. Myocardial inflammation, caused by a CVB3 infection, resulted in immunoproteasome formation in hearts of both, resistant C57BL/6 and susceptible A.BY/SnJ mice, and was correlated with enhanced generation of immunorelevant CVB3 peptides. In concurrence with distinctive type I interferon kinetics, immunoproteasome formation and improved epitope generation peaked on day 4 post infection in resistant mice, and was delayed in susceptible mice. No alterations were observed in assembly and proteolytic activity of 20S proteasomes in lymphatic tissues during CVB3 infection, independent from mouse strain. The results emphasise the impact of a rapid adjustment of the UPS to viral infection due to early secretion of type I interferon at site of infection.

20S Proteasomen der Leber gehören ausschließlich zur Population der Intermediär-Proteasomen. Chromatographisch sind drei proteasomale Subpopulationen aufgrund unterschiedlicher Oberflächenhydrophobizität trennbar. Diese beinhalten unterschiedliche Mengen der Standard- und Immunountereinheiten und zeigen unterschiedliche spezifische Aktivitäten gegenüber kurzen fluorigenen Peptidsubstraten. Außerdem lassen sie sich deutlich anhand der Schnittfrequenzen bei Hydrolyse von Polypeptidsubstraten unterscheiden. Jede dieser Subpopulationen konnte aufgrund unterschiedlicher Oberflächenladung in bis zu 5 verschiedene 20S Proteasom-Subtypen unterteilt werden, die wiederum unterschiedliche Mengen an Standard- und Immununtereinheiten enthielten. Jeder dieser Subtypen zeigte unterschiedliche Eigenschaften bezüglich der spezifischen Aktivitäten und Hydrolysegeschwindigkeiten von Polypeptidsubstraten. Unterschiede wurden auch bezüglich ihrer Peptid-Spleiß-Aktivitäten nachgewiesen. In der vorliegenden Arbeit wurden darüber hinaus Veränderungen der Spektren proteasomaler Subtypen- und ihrer Eigenschaften im Lebergewebe von 2, 8 und 23 Monate alten Ratten nachgewiesen. Während die Gesamtmenge der Leber-Proteasomen mit steigendem Alter abnahm, nahm die Menge der Subtypen mit integrierten Immununtereinheiten zu. Gleichzeitig kam es zu einer altersabhängigen Zunahme der Hydrolysegeschwindigkeit gegenüber Polypeptide-Substraten sowie veränderten Schnitthäufigkeiten. Die altersabhängigen intramolekularen Umgestaltungen von Leberproteasomen könnten eine funktionelle Anpassung an die altersbedingten zellulären Veränderungen in Verbindung mit Veränderungen der MHC Klasse I Antigen-Präsentation darstellen. / 20S proteasomes isolated from rat liver belong to the population of intermediate type proteasomes. Three subpopulations were separated by chromatography due to their differences in surface hydrophobicity. These subpopulations contain different types of intermediate type proteasomes with standard- and immunosubunits exhibiting distinct specific activities towards short fluorogenic substrates. However, depending on the substrate their hydrolyzing activity of long polypeptide substrates was significantly different. Additional separation of the three 20S proteasome subpopulations due to their different surface charges allowed further resolution of each subpopulation to at least five 20S proteasome subtypes. The subunit composition of these subtypes varied with regard to the content of exchangeable subunits. The pattern of proteolytic activities measured with short fluorogenic peptides differed between the various subtypes as well as the ability to hydrolyze polypeptide substrate. Above all, each subtype displayed a specific pattern regarding the peptide-splice-activity. Furthermore, the present work showed age-dependent alterations in the subtype patterns, which were analyzed in livers of 2, 8 and 23 month old rats. While the total amount of proteasome declines with age, in all subtypes from aged animals standard subunits were widely replaced by immunosubunits. This resulted in a relative increase of immunosubunit-containing proteasomes, paralleled by age-dependent changes regarding the hydrolyzing activity of long polypeptide substrates. Such modifications could have implications on protein homeostasis as well as on MHC class I antigen presentation as part of the immunosenescence process.

Le protéasome est responsable de la dégradation régulée d'une majeure partie des protéines intracellulaires. Cette machinerie multimoléculaire est composée d'un cœur catalytique, le protéasome 20S, qui peut être activé par plusieurs types de protéines régulatrices, en particulier la particule régulatrice 19S ou PA700, les complexes heptamériques formés par les membres de la famille 11S (ou PA28) et PA200. Au cours de ce travail, nous nous sommes focalisés sur PA28gamma, un régulateur nucléaire du protéasome, qui active la dégradation de plusieurs substrats par le protéasome 20S de façon indépendante de l'ubiquitine et de l'ATP. Malgré de multiples études montrant l'implication de PA28gamma dans de nombreux processus cellulaires essentiels tels que le cycle cellulaire, la prolifération, l'apoptose, l'architecture nucléaire, la dynamique de la chromatine, les infections virales et la réponse au stress, ses fonctions exactes ne sont pas encore comprises. De plus, les mécanismes impliqués dans la régulation de l'activité de PA28gamma et de son association avec le protéasome 20S restent mystérieux. Une analyse SILAC des partenaires d'interaction de PA28gamma endogène a révélé l'existence d'un nouveau facteur, non caractérisé, que nous avons appelé PIP30 (PA28gamma Interacting Protein 30 kDa). Le gène PIP30 contient un domaine très conservé chez les Eucaryotes. Nous avons produit et purifié la protéine PIP30 recombinante et montré qu'elle est faiblement structurée, malgré le fait qu'elle puisse se dimériser. Nous avons confirmé, aussi bien in vitro qu'in cellulo, que PIP30 interagit directement et spécifiquement avec PA28gamma. En analysant la co-immunoprécipitation de PA28gamma avec différents mutants tronqués de GFP-PIP30, nous avons pu identifier la séquence de PIP30 responsable de l'interaction avec PA28gamma dans sa partie C-terminale. Nous essayons maintenant d'identifier la séquence de PA28gamma impliquée dans la liaison de PIP30 et de cristalliser le complexe PA28gamma/PIP30. L'élaboration d'un anticorps anti-PIP30 « maison » nous a permis de montrer que PIP30 est une protéine nucléaire stable. Son niveau d'expression diminue en réponse à la déplétion de PA28gamma, ce qui suggère que PIP30 est stabilisée par son interaction avec PA28gamma in cellulo. Nous avons démontré in vitro que PIP30 inhibe partiellement l'activation médiée par PA28gamma des activités de type chymotrypsine et caspase, mais pas trypsine, du protéasome. Cependant, nous avons montré, par une approche ELISA, que PIP30 n'affecte pas la liaison de PA28gamma au protéasome 20S. Par ailleurs, nous avons testé l'effet de PIP30 sur la dégradation de p21 par le complexe PA28gamma/protéasome 20S et observé que PIP30 augmente la vitesse de dégradation de p21 dans ce test. Nos tentatives pour élucider la fonction exacte de PIP30 in cellulo n'ont jusqu'ici pas abouti à une conclusion convaincante. L'ensemble de ces résultats suggère que PIP30 pourrait être impliqué dans le recrutement sélectif des substrats de PA28gamma et/ou dans la modulation de l'activation du protéasome par PA28gamma. / The proteasome is responsible for the regulated degradation of most intracellular proteins. This multi-subunit machinery is composed of a common catalytic core, the 20S proteasome, which can be activated by various types of regulators, notably the 19S regulatory particle or PA700, the heptameric complexes formed by the members of the 11S (or PA28) family and PA200. This work has been focused on PA28gamma, a nuclear regulator of the proteasome, which has been shown to activate degradation of several proteasomal substrates in an ATP- and ubiquitin- independent manner. Despite many evidences revealing the involvement of PA28gamma in many essential cellular processes, such as cell cycle progression, proliferation, apoptosis, nuclear architecture, chromatin dynamics, viral infection and stress response, its exact function(s) remain to be understood. In addition, how PA28gamma activity and association to the 20S proteasome are regulated is completely unclear. A SILAC-based analysis of endogenous PA28gamma interaction partners revealed the existence of a novel, completely uncharacterized protein, which we called PIP30 (PA28gamma Interacting Protein 30 kDa). Evolutionary analysis indicates that PIP30 gene contains a domain highly conserved in Eukaryotes, without any alternative splicing or gene duplication evidences. We produced and purified the recombinant PIP30 protein and showed that it is poorly structured, although it is able to make dimers. We confirmed both in vitro and in cellulo that PIP30 directly and specifically interacts with PA28gamma. By analyzing the co-immunoprecipitation of PA28gamma with various GFP-PIP30 truncation mutants, we identified the sequence of PIP30 responsible for PA28gamma binding in its C-terminal part. Ongoing analyses now focus on the identification of PIP30 binding motif on PA28gamma sequence and the crystallization of the PA28gamma-PIP30 complex. Using homemade anti-PIP30 antibodies, we showed that PIP30 is a stable nuclear protein. Its expression level is decreased in response to PA28gamma depletion, suggesting that it is stabilized by its interaction with PA28gamma in cellulo. We demonstrated in vitro that PIP30 partially inhibits PA28gamma-mediated activation of the chymotrypsin- and caspase-, but not the trypsin-like, activities of the proteasome. However, we showed by an ELISA-based approach that PIP30 does not affect PA28gamma binding to 20S. Considering the limitations of probing proteasome activity with small fluorogenic substrates, we tested the effect of PIP30 on the PA28gamma-dependent proteasomal degradation of in vitro translated p21, a known protein substrate of PA28gamma. We unexpectedly found that PIP30 enhanced the rate of p21 degradation. Our attempts to elucidate the exact functions of PIP30 in cellulo were unsuccessful so far. Altogether, our results suggest that PIP30 could be involved in the selective recruitment of PA28gamma protein substrates and/or modulate PA28gamma-mediated proteasome activation.

Protein misfolding and aggregation underlie several neurodegenerative proteinopathies including amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Superoxide dismutase 1 (SOD1) was the first gene found to be associated with familial ALS. Overexpression of human mutant or wild type SOD1 in transgenic mouse models induces motor neuron (MN) degeneration and an ALS-like phenotype. SOD1 mutations, leading to the destabilization of the SOD1 protein is associated with ALS pathogenesis. However, how misfolded SOD1 toxicity specifically affects human MNs is not clear. The aim of this thesis was to develop patient-derived, cellular models of ALS to help understand the pathogenic mechanisms underlying SOD1. To understand which cellular pathways impact on the level of misfolded SOD1 in human cells, we established a model using patient-derived fibroblasts and quantified misfolded SOD1 in relation to disturbances in several ALS-related cellular pathways. Misfolded SOD1 levels did not change following reduction in autophagy, inhibition of the mitochondrial respiratory chain, or induction of endoplasmic reticulum (ER)-stress. However, inhibition of the ubiquitin-proteasome system (UPS) lead to a dramatic increase in misfolded SOD1 levels. Hence, an age-related decline in proteasome activity might underlie the late-life onset that is typically seen in SOD1 ALS. To address whether or not SOD1 misfolding is enhanced in human MNs, we used mixed MN/astrocyte cultures (MNCs) generated in vitro from patient-specific induced pluripotent stem cells (iPSCs). Levels of soluble misfolded SOD1 were increased in MNCs as well as in pure iPSC-derived astrocytes compared to other cell types, including sensory neuron cultures. Interestingly, this was the case for both mutant and wild type human SOD1, although the increase was enhanced in SOD1 FALS MNCs. Misfolded SOD1 was also found to exist in the same form as in mouse SOD1 overexpression models and was identified as a substrate for 20S proteasome degradation. Hence, the vulnerability of motor areas to ALS could be explained by increased SOD1 misfolding, specifically in MNs and astrocytes. To investigate factors that might promote SOD1 misfolding, we focussed on the stability of SOD1 mediated by a crucial, stabilizing C57-C146 disulphide bond and its redox status. Formation of disulphide bond is dependent on oxidation by O2 and catalysed by CCS. To investigate whether low O2 tension affects the stability of SOD1 in vitro we cultured fibroblasts and iPSC-derived MNCs under different oxygen tensions. Low oxygen tension promoted disulphide-reduction, SOD1 misfolding and aggregation. This response was much greater in MNCs compared to fibroblasts, suggesting that MNs may be especially sensitive to low oxygen tension and areas with low oxygen supply could serve as foci for ALS initiation. SOD1 truncation mutations often lack C146, and cannot adopt a native fold and are rapidly degraded. We characterized soluble misfolded and aggregated SOD1 in patient-derived cells carrying a novel SOD1 D96Mfs*8 mutation as well as in cells fom an unaffected mutation carrier. The truncated protein has a C-terminal fusion of seven non-native amino acids and was found to be extremely prone to aggregation in vitro. Since not all mutation carriers develop ALS, our results suggested this novel mutation is associated with reduced penetrance. In summary, patient derived cells are useful models to study factors affecting SOD1 misfolded and aggregation. We show for the first time that misfolding of a disordered and disease associated protein is enhanced in disease-related cell types. Showing that misfolded SOD1 exists in human cells in the same form as in transgenic mouse models strengthens the translatability of results obtained in the two species. Our results demonstrate disulphide-reduction and misfolding/aggregation of SOD1 and suggest that 20S proteasome could be an important therapeutic target for early stages of disease. This model provides a great opportunity to study pathogenic mechanisms of both familial and sporadic ALS in patient-derived models of ALS. / Varje år insjuknar omkring 5300 personer i världen i motorneuronsjukdomen Amyotrofisk lateralskleros (ALS). Sjukdomen kännetecknas av degeneration av motorneuron i hjärnan och ryggmärgen, de nervceller som styr kroppens muskler, vilket leder till musklerförtvining och gradvis förlamning. ALS-patienter avlider oftast till följd av andningssvikt när sjukdomen når andningsmuskulaturen. I de allra flesta fall uppkommer ALS sporadiskt (SALS), det vill säga utan känd genetisk orsak, medan ärftliga fall (FALS) drabbar omkring 10 % och beror på mutationer i ett antal kända gener. Upp till 6 % av alla ALS fall kan härledas till mutationer i genen superoxid dismutas 1 (SOD1). SOD1 är ett enzym som ansvarar för att omvandla och oskadliggöra fria syreradikaler som bildas vid normal ämnesomsättning. 206 olika SOD1 mutationer har identifierats, alla orsakar inte ALS men många leder till att den tredimensionella proteinstrukturen förändras, vilket ökar proteinets benägenhet att felveckas. Initialt trodde man att SOD1 mutationer förhindrade proteinets normalfunktion och följaktligen orsakade ALS. Studier har emellertid visat att den enzymatiska funktionen ofta bevaras, även hos muterade proteiner. Däremot kan små mängder felveckat SOD1 störa andra viktiga cellulära funktioner. Felveckat SOD1 har en benägenhet att klumpa ihop sig och bilda aggregat i det centrala nervsystemet (CNS). Dessa aggregat återfinns hos patienter med såväl FALS som SALS vilket tyder på att även vildtyps-SOD1 kan felveckas och vara involverat i sjukdomsutvecklingen. De flesta studier är baserade på transgena musmodeller som uttrycker extremt stora mängder av muterat humant SOD1. Det är dock oklart hur väl studier i möss överensstämmer med sjukdomsutvecklingen hos ALS-patienter, där mängden SOD1 är betydligt lägre. En central fråga som fortfarande står obesvarad är varför just motorneuron degenererar i ALS, trots att SOD1 uttrycks i alla kroppens celler. Det övergripande syftet med den här avhandlingen har varit att karakterisera felveckat SOD1 i patientceller för att studera dess roll i ALSrelaterade sjukdomsmekanismer med fysiologiskt relevanta nivåer av SOD1. Samtliga studier är gjorda in vitro med celler från friska donatorer med vildtyps-SOD1, celler från patienter med SOD1-FALS, FALS som bär andra ALS-associerade gener, samt SALS. I de allra flesta fallen har vi analyserat både lösligt felveckat SOD1 samt aggregerade former av SOD1 proteinet.

Das HIV-1 Tat-Protein hemmt die Peptidase-Aktivität des 20S Proteasoms durch Konkurrenz mit dem 11S Regulator/PA28 um die Bindungsstelle am Proteasom. Aus den kinetischen Daten und durch Strukturvergleiche geht hervor, dass die Aminosäuren Lys51, Arg52 und Asp67 des Tat-Proteins für den Effekt auf das 20S Proteasom verantwortlich sind und die REG/Tat-Proteasom-Bindungsstelle bilden. Eine in der 11S Regulator alpha-Untereinheit (REG alpha) identifizierte vergleichbare Struktur wird von den Aminosäuren Glu235, Lys236 und Lys239 gebildet. Durch eine Mutation der REG alpha Aminosäuren Glu235 und Lys236 zu Ala geht die Fähigkeit des REG alpha die Peptidase-Aktivität des 20S Proteasoms zu stimulieren verloren, während die Bindungsfähigkeit an den 20S Komplex erhalten bleibt. Die Bindungsstelle in REG alpha ist für die verstärkte Präsentation eines Epitops des Cytomegalovirus pp89 durch MHC Klasse I essentiell. Das Tat-Protein und das Tat-Peptid 37-72 unterdrücken die 11S-Regulator vermittelte Antigenpräsentation des pp89 Epitops. Im Gegensatz dazu weist das Tat-Peptid mit Mutation der Aminosäuren Lys51, Arg52 und Asp67 zu Ala keine Reduktion der Antigenpräsentation auf. / The HIV-1 Tat protein inhibits the peptidase activity of the 20S proteasome and competes with the 11S regulator/PA28. Kinetic assays and structural comparison found amino acids Lys51, Arg52 and Asp67 of Tat to be responsible for the effects on proteasomes, forming the REG/Tat-proteasome-binding site. A similar site identified in the 11S regulator alpha subunit (REG alpha) consists of the residues Glu235, Lys236 and Lys239. Mutation of the REG alpha amino acids Glu235 and Lys236 to Ala resulted in a REG alpha mutant that lost the ability to activate the 20S proteasome even though it still binds to the 20S complex. The site in REG alpha is needed to enhance the presentation of a cytomegalovirus pp89 protein-derived epitope by MHC class I molecules. Full-length Tat and the Tat peptide 37-72 suppressed 11S regulator-mediated presentation of the pp89 epitope. In contrast, a Tat peptide with mutation of amino acids Lys51, Arg52 and Asp67 to Ala was not able to reduce antigen presentation.

Das Ubiquitin-Proteasom-System ist an der Degradation cytosolischer Proteine und der Generierung von Antigenen beteiligt, die über MHC Klasse I Moleküle CD8+ T Zellen präsentiert werden. Die Antigenprozessierung wird durch Typ I und II Interferone beeinflusst, welche die Formierung des Immunoproteasoms und des Proteasomen-Aktivators PA28 induzieren und so die katalytische Aktivität des Ubiquitin-Proteasom-Systems qualitativ verändern. In der vorliegenden Arbeit wurde im Zellkulturmodell unter dem Einfluss von IFN gamma die zunehmende Inkorporation der Immunountereinheiten in de novo assemblierende 20S Proteasomen und die daraus resultierende Veränderung der proteolytische Aktivität untersucht. Die Inkorporation der Immunountereinheiten wurde mittels 2D Gelelektrophorese und Western Blots von 20S Proteasomen untersucht, die nach unterschiedlicher Stimulationsdauer mit IFN gamma aus HeLa Zellen isoliert wurden. Es konnte gezeigt werden, dass innerhalb der ersten 24h einer IFN gamma Stimulation die strukturelle Heterogenität des zellulären Proteasomenpools zunimmt, indem sowohl intermediäre als auch Immunoproteasomen assemblieren. In der Nativ-PAGE von Lysaten IFN gamma stimulierter Zellen wurde eine Zunahme des 20S Proteasoms als freier Komplex und in Assoziation mit PA28 beobachtet, während die Menge des zum ATP-abhängigen Abbau von polyubiquitinierten Proteinen notwendigen 26S Proteasoms unverändert blieb. Die Stimulation mit IFN gamma hatte eine Steigerung der gesamtproteasomalen Aktivität zur Folge, die unter Inhibition der Interaktion zwischen 20S Proteasom und PA28 verzögert erfolgte. Die katalytischen Eigenschaften isolierter Proteasomen wurden anhand der Generierung eines immunrelevanten Hepatitis C CTL Epitops des viralen Core Proteins in vitro untersucht. Im Verlauf der IFN gamma Stimulation de novo assemblierte Proteasomen wiesen jeweils unterschiedliche Präferenzen für die Generierung des untersuchten CTL Epitops auf. Eine weitere, proteasomen-spezifische Änderung der katalytischen Aktivität bewirkte die Assoziation des Proteasomen-Aktivators. Innerhalb der ersten zwölf Stunden einer IFN gamma Stimulation wurde das Epitop vermehrt mit der Unterstützung des Proteasomen-Aktivators generiert, nach 24 Stunden zunehmend durch freies 20S Proteasom. Die Ergebnisse der vorgestellten Arbeit zeigen, dass Strukturvarianten des Proteasoms zusammen mit PA28 redundant funktionieren und eine hohe proteolytische Plastizität des UPS gewährleisten. / The ubiquitin proteasome system is responsible for the degradation of cytosolic proteins and the processing of MHC class I restricted antigens. The generation of these antigens is influenced by type I and II interferons which induce the expression of immunoproteasomes and the proteasome activator PA28; and thereby impact the quality of peptides processed by the proteasome system. The adoption of the proteasome system to a proinflammatory environment has been investigated in a cell culture model by isolating proteasomes after different stages of IFN gamma stimulation. The composition of isolated proteasomes was analysed by 2D PAGE and western blot approach. The presented work shows that within 24h of IFN gamma stimulation an increasing heterogeneity of the cellular proteasome pool is observed, resulting from the assembly of both intermediate type proteasomes and immunoproteasomes at the early stage of IFN gamma stimulation. It could be shown by native PAGE of HeLa cell lysates that IFN gamma induces increasing amounts of 20S proteasomes and PA28 associated proteasomes without decreasing the amount of 26S proteasomes that are necessary for the ATP dependent degradation of ubiquitinated proteins; and resulting in an enhanced total proteasomal activity in vitro. This increase in activity was delayed when the interaction of 20S proteasomes and PA28 was inhibited. A comparative analysis of the ability of isolated 20S proteasomes to generate a known hepatitis C virus derived CTL epitope in vitro proved that during early IFN gamma stimulation de novo assembled proteasomes exhibited a structure specific preference to generate the HCV CTL epitope either alone or in combination with the proteasome activator PA28. Within the first 12h of IFN gamma stimulation the epitope was generated with higher efficiency by 20S proteasomes in association with PA28, whereas after 24h the impact of PA28 on the proteasome pool was less pronounced. The presented work shows that IFN gamma induces a heterogeneity of 20S proteasomes in the early stage of stimulation, acting in combination with the proteasome activator in a redundant manner; and provides a high proteolytic placticity of the proteasome system.

Das Proteasomensystem der Zelle ist für die Degradation von Proteinen verantwortlich und spielt eine zentrale Rolle bei der Generierung von Epitopen, die auf MHC-Klasse-I Molekülen den cytotoxischen T-Lymphozyten (CTLs) präsentiert werden. Die Stimulation von Zellen mit Interferon-gamma (IFNgamma) führt zu der Bildung von Immunoproteasomen, die im Vergleich zu den konstitutiven Proteasomen eine verbesserte Generierung vieler MHC-Klasse-I Epitope aufweisen. In gesunden Mäusen werden Immunoproteasomen vorwiegend in den lymphatischen Geweben exprimiert, wohingegen nicht-lymphatische Gewebe hauptsächlich konstitutive Proteasomen enthalten. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss der Listeria monocytogenes Infektion auf die aus der Leber, der Milz, dem Dünndarm und dem Colon stammenden murinen 20S Proteasomen untersucht. Die Struktur der isolierten 20S Proteasomen wurde mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese und Westernblot ermittelt, während die Funktion durch in vitro Prozessierung von drei oligomeren Peptidsubstraten analysiert wurde. Die Prozessierungsprodukte wurden mittels HPLC-ESI-Ionenfalle massenspektrometrisch identifiziert sowie quantifiziert. Die vorliegende Arbeit zeigt zum ersten Mal, dass nach einer Infektion die aus den nicht-lymphatischen Organen und Zellen isolierten 20S Proteasomen eine strukturelle und funktionelle Plastizität aufweisen: Nach der Infektion wurde die Bildung von Immunoproteasomen induziert, was mit der gesteigerten Generierung der immunrelevanten Fragmente korreliert werden konnte. Dies verlief unabhängig von der direkten Präsenz von Listeria monocytogenes in den Organen und wurde ausschließlich durch das Cytokin IFNgamma reguliert. Es konnte außerdem eine Zunahme der posttranslationalen Modifikation von Leberproteasomen mit dem Monosaccharid N-Acetylglucosamin nach der Infektion nachgewiesen werden. Des Weiteren wurde eine detaillierte Analyse der massenspektrometrischen Daten hinsichtlich des Schnittverhaltens der konstitutiven und Immunoproteasomen etabliert. Die Auswertung ergab, dass die Immunoproteasomen nach der Infektion durch schnellere und veränderte Nutzung bestehender Spaltstellen an der verbesserten Epitoppräsentation beteiligt sind. / The proteasome system of the cell is responsible for the degradation of proteins and plays a central role in the generation of epitopes which are presented to cytotoxic T-lymphocytes (CTLs) on MHC-class-I molecules. The stimulation of cells by interferon-gamma (IFNgamma) leads to the formation of immunoproteasomes that show an improved generation of many MHC-class-I epitopes compared to constitutive proteasomes. In healthy mice, immunoproteasomes are mainly expressed in the lymphatic tissues, whereas the non-lymphatic organs predominantly contain constitutive proteasomes. In this project the effect of Listeria monocytogenes infection on murine 20S proteasomes derived from the liver, spleen, small intestine and colon were investigated. The structure of the isolated proteasomes was analyzed by two-dimensional gel electrophoresis and western blots while the function was studied by in vitro processing of three oligomeric peptide substrates. Identification and quantification of the processing products was performed by HPLC-ESI-ion trap mass spectrometry. The project showed for the first time, that after infection 20S proteasomes isolated from non-lymphatic organs as well as from non-lymphatic cells displayed structural and functional plasticity: immunoproteasomes were induced post infection which could be correlated with the enhanced generation of immuno-relevant fragments. This was independent of the direct presence of Listeria monocytogenes in the organs and solely controlled by the cytokine IFNgamma. In addition, an increased posttranslational modification with the monosaccharide N-acetylglucosamine could be detected in liver-derived proteasomes after infection. Furthermore, a detailed analysis of the mass spectrometry data was established according to the cleavage site usage of constitutive and immunoproteasomes. The result was that immunoproteasomes are involved in improved generation of the immuno-relevant fragments by the faster cleavage and the changed usage of existing cleavage sites after infection.