Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2005. / Härtill 5 uppsatser.

Das Ziel der Arbeit war es, mittels biochemischer und molekulargenetischer Untersuchungen die Rolle des partiellen 21-Hydroxylase-Mangels in der Pathogenese des Polyzystischen Ovar Syndroms (PCOS) und des Ovariellen Überstimulationssyndroms (OHSS) zu beleuchten sowie ein charakteristisches biochemisches Profil für Patientinnen mit erhöhtem Risiko zur Ausbildung eines OHSS aufzudecken. In die Studie wurden 62 Patientinnen eingeschlossen, 23 Kontrollpersonen und 39 PCOS-Patientinnen, von denen 17 Patientinnen anamnestisch mindestens eine Episode eines OHSS aufwiesen. Umfangreiche biochemische Analysen dienten zur Bestimmung der partiellen 21-Hydroxylase-Insuffizienz, zur Untersuchung des Ursprungs des Androgenüberschusses (ACTH und LHRH-Test) und zur Charakterisierung des metabolischen Profils (Leptin, Insulin, SHBG, IGF-1). Zur Darstellung des Gentotyps führten wir die lückenlose Untersuchung des CYP21A2-Gens auf Mutationen und Polymorphismen durch. Die androgenen Steroide wiesen ein bei den PCOS-Patientinnen im Vergleich zu den Kontrollpatientinnen erhöhtes Niveau auf, ohne dass sich ein klare Unterscheidung zwischen adrenalem und ovariellem Ursprung abzeichnete. Bei den OHSS-Patientinnen dominierten die ovariellen Androgene. Die Leptinwerte waren in der PCOS-Gruppe erhöht, besonders bei den Patientinnen mit OHSS. Die Frequenz heterozygoter Punktmutationen lag in unserer PCOS-Gruppe mit 23% deutlich höher als in der Kontrollgruppe mit 8%. Es ergab sich kein signifikanter Unterschied zwischen PCOS-Patientinnen mit und ohne OHSS. Die Allelfrequenz der detektierten Polymorphismen unterschied sich nicht zwischen PCOS-Patientinnen und Kontrollen. Von insgesamt 17 Patientinnen mit biochemischen Auffälligkeiten waren 8 Trägerinnen einer heterozygoten Mutation. Im Gegensatz dazu wiesen nur 8 der 11 Patientinnen mit Punktmutation biochemische Abweichungen auf. Es ergab sich also nicht für jeden Fall eine eindeutige Genotyp-Phänotyp-Korrelation. / This study was designed to evaluate the possible role of partial 21-Hydroxylase Deficiency in the pathogenesis of the Polycystic Ovary Syndrome (PCOS) and the Ovarian Hyperstimulation Syndrome (OHSS) by means of biochemical and molecular genetic investigations, as well as to identify the biochemical profile typical of patients with an elevated risk of developing an OHSS. 62 female patients were included in the study, 23 controls and 39 PCOS patients. 17 of these had at least one anamnestic episode of OHSS. Extensive biochemical investigations were used to determine partial 21-OHase Deficiency as well as the source of the androgen excess (ACTH and LHRH tests) and to describe the metabolic profile (leptin, insulin, SHBG and IGF-1). For genotypic characterization, we screened the CYP21A2 gene for any mutation or polymorphism. Androgens were elevated in the PCOS group without a clear differentiation into adrenal or ovarian origin. Amongst patients with OHSS, the ovarian androgens were dominant. Higher leptin levels were measured in the PCOS group, especially in patients with OHSS. The frequency of heterozygous point mutations was 23% in our PCOS group, compared to 8% amongst control patients. There was no relevant difference between PCOS patients with or without an OHSS. The frequency of polymorphisms did not differ between the groups. We found relevant heterozygous point mutations in 8 of the 17 patients with biochemical deviations. In contrast to this only 8 of the 11 patients with point mutations showed biochemical derangements indicating no clear Genotype-Phenotyp-correlation.

Orientador: Maricilda Palandi de Mello / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Insituto de Campinas / Made available in DSpace on 2018-08-13T00:56:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Coeli_FernandaBorchers_D.pdf: 7777269 bytes, checksum: 053a66d2bc3df6ad0d5de7c2038f3246 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A hiperplasia congênita da adrenal é causada pela deficiência de uma das cinco enzimas responsáveis pela síntese do cortisol na esteroidogênese, sendo que mais de 90% dos casos ocorrem devido à deficiência de 21-hidroxilase (21-OH). O genoma haplóide humano possui duas cópias em tandem do gene que codifica para a 21-OH, denominados CYP21A2 e o CYP21A1P. Embora as duas cópias, CYP21A1P e CYP21A2, tenham aproximadamente 98% de homologia, CYP21A1P é classificado como um pseudogene, devido a algumas alterações deletérias em sua seqüência. Foram mapeados no braço curto do cromossomo 6, assim como os genes RP, C4 e TNX também duplicados em tandem. Este loco é denominado modulo RCCX, onde cada letra representa um gene. Uma conseqüência esperada deste tipo de organização é que esta favorece eventos de crossingover desigual, produzindo cromátides irmãs assimétricas e pares de gametas com um número variável de unidades completas. O crossover desigual não gera somente um tipo definido de deleção (alelos monomodulares), de duplicação (alelo trimodular) ou de conversão (alelo bimodular), mas pode, dependendo da sua exata localização, produzir um grande número de alelos diferentes, com significados funcionais variáveis. O objetivo deste trabalho foi investigar a variabilidade dos genes híbridos CYP21A21P/CYP21A2 quanto à região de recombinação nos alelos monomodulares, bimodulares e trimodulares de indivíduos com deficiência de 21- hidroxilase. Foram incluídos 55 pacientes com deficiência de 21 - hidroxilase, que foram avaliados por Southern blot, Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA), PCR - Alelo especifico (ASO-PCR) e seqüenciamento. Na triagem por Southern blot foram identificados 26 alelos mono-, 26 bi- e 5 trimodulares com prováveis genes híbridos. Foi identificado um alelo monomodular novo portador da variante C4A [6,4 kb] que se mostrou único inclusive quanto à formação híbrida CYP21A21P/CYP21A2. Com a técnica de MLPA foi possível mapear três regiões principais de recombinação dos genes híbridos CYP21A21P/CYP21A2 nas três configurações alélicas. Além disso, foram identificados possíveis híbridos dos genes C4A e B, tanto nas configurações mono quanto nas bimodulares. Assim, ficaram definidos 5 haplótipos monomodulares, 7 bimodulares e 3 trimodulares. As técnicas de ASO-PCR e sequenciamento para análise dos híbridos CYP21A21P/CYP21A2 e dos CYP21A21P nos alelos bi e trimodulares refinaram a caracterização subdividindo estes haplótipos em 10 mono, 15 bi e 5 trimodulares. Dado o alto grau de variabilidade encontrado não foi possível se identificar efeito fundador de nenhum haplótipo específico para a deficiência de 21-hidroxilase. Por outro lado, um haplótipo novo correspondendo a cerca de 15% dos monomodulares foi caracterizado como portador das mutações p.P34L e p.H62L e um haplótipo igualmente não descrito portador da p.H62L foi encontrado entre os bimodulares. SNPs no terminal 5'UTR, no íntron 2 e no éxon 7 responderam pela diferenciação principal entre os híbridos tanto nos haplótipos de mesmo grupo como na comparação entre os de grupos diferentes. Este trabalho indica que a combinação de quatro técnicas e o estudo de segregação nas famílias foram fundamentais para o esclarecimento dos genótipos dos pacientes. Os genes híbridos podem estar relacionados às formas clínicas perdedora de sal, não perdedora de sal e não clássica dependendo da região onde ocorre a recombinação para sua formação. / Abstract: Congenital adrenal hyperplasia is caused by deficiency of one of the five enzymes responsible for cortisol synthesis in the steroidogenesis. More than 90% of the cases occur due to deficiency of 21-hidroxilase (21-OH). The haploid human genome bears two copies in tandem of 21-OH coding gene, CYP21A2 and CYP21A1P. Although the two copies are approximately 98% homologous, CYP21A1P is a pseudogene, due to some deleterious mutations. They map to the short arm of chromosome 6, as well as RP, C4 and TNX genes which are also duplicated in tandem. This locus is called RCCX module, each letter representing one gene. An expected consequence of such organization is that it favors events of unequal crossing-overs, producing pairs of gametes with different number of complete units. The aim of this investigation was to estimate the variability of CYP21A21P/CYP21A2 chimeric genes based on the region of recombination in the monomodular, bimodular and trimodular alleles in patients with 21-hydroxylase deficiency. Fifty-five patients were included for Southern blot, Multiplex ligationdependent probe amplification (MLPA), Allele-specific PCR (ASO-PCR) and sequencing analyses. Southern blot identified alleles which were: mono (n = 26), bi (n = 26) and trimodular (n = 5) with chimeric genes. A novel monomodular allele was identified that carry C4A [6,4 kb] variant and also bore an unique CYP21A21P/CYP21A2 formation. MLPA technique mapped three main recombination regions in CYP21A21P/CYP21A2 chimerical genes in the three RCCX configurations. Moreover, it indicated possible chimeric C4A and B genes in both mono- and bimodular configurations. Therefore, five mono-, seven bi- and three trimodular haplotypes had been defined. Both ASO-PCR and sequencing techniques for CYP21A21P/CYP21A2 and CYP21A21P analysis had refined the characterization subdividing these haplotypes in ten mono-, fifteen bi- and five trimodular. Considering the high degree of variability observed it was not possible to identify a founder effect of any specific haplotype for the deficiency of 21-hidroxilase. Conversely, a novel haplotype corresponding to about 15% of the monomodular alleles was characterized as carrying the mutations p.P34L and p.H62L and, similarly one haplotype carrying the p.H62L was found among bimodular alleles. SNPs in the 5 ' UTR, intron 2 and exon 7 were responsible for the main differentiation among chimerical genes within a group as well as upon comparison between different groups. The results presented here indicate that the combination of four different techniques and the study of segregation in the families had been essential for defining the genotypes of the patients. It is also shown that CYP21A21P/CYP21A2 chimeric genes can be related to different clinical forms: salt losing, non-salt losing and non-classical depending on the region where the recombination for its formation occurs. / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientadores: Maricilda Palandi de Mello, Fernanda Caroline Soardi / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T09:56:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lusa_AnaLeticiaGori_D.pdf: 4582728 bytes, checksum: a14d0d0453e90b4a59cb02532b21d83b (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A Hiperplasia congênita da Adrenal (HCA) é uma das doenças mais comuns com herança autossômica recessiva. Uma das causas é a deficiência da 21-hidroxilase que surge por mutações no gene CYP21A2. O desequilíbrio na síntese de cortisol causa um estímulo excessivo das glândulas adrenais pelo hormônio adrenocorticotrópico (ACTH) e, consequentemente, à hiperplasia da glândula e ao aumento na síntese de andrógenos. O presente trabalho teve por objetivo clonar e expressar variantes do gene CYP21A2 e, avaliar as variantes enzimáticas da 21-hidroxilase quanto à atividade residual, comparando suas formas nativa e mutantes. Foi também realizado o estudo in silico para se comparar as estruturas das enzimas 21-hidroxilase e 3?-hidroxiesteróide desidrogenase tipo 2 (HSD3B2) avaliando o impacto das alterações provocadas por mutações sobre a estrutura da proteína nativa. Para a enzima 21-hidroxilase, as mutações analisadas quanto à atividade foram: p.Ser113Phe, p.Pro267Leu, p.Val358Ile, p.Arg426Cis e, as combinações p.Ile172Asn+p.Val358Ile e p.Val281Leu+p.Arg426Cis. Nos testes de atividade enzimática, as enzimas com as mutações p.Val358Ile e as combinações p.Ile172Asn+p.Val358Ile e p.Val281Leu+p.Arg426Cis apresentaram valores de atividade residual compatíveis com a forma perdedora de sal. Por outro lado, a enzima com a mutação p.Pro267Leu apresentou atividade residual maior que 50%, compatível com mutações da forma não clássica. As mutações p.Ser113Phe e p.Arg426Cis, por sua vez, apresentaram atividade residual entre 2 e 7% que, em relação aos controles utilizados, foram correspondentes à forma clássica virilizante simples. Os modelos estruturais gerados para as enzimas 21-hidroxilase portadoras da deleção p.(Gln389_Ala391del) e das mutações individuais ou combinadas acima citadas foram comparados ao da enzima nativa. Estudo similar foi realizado com enzimas HSD3B2 nativa e portadoras de duas mutações, p.Pro222Gln e p.Pro222Thr, relacionadas à forma perdedora de sal da deficiência de HSD3B2. Esse estudo demonstrou boa correlação das mutações encontradas nos pacientes com os seus fenótipos tanto no que diz respeito à atividade enzimática quanto às alterações estruturais. Assim, ficou demonstrado que este tipo de abordagem é eficaz para a avaliação dos aspectos funcionais de mutações inéditas / Abstract: Congenital adrenal hyperplasia (CAH) is one of the most common hereditary autosomal recessive diseases. 21-hydroxylase deficiency is one important cause of the disease and results from mutations in CYP21A2 gene. The unbalance in cortisol synthesis leads to excessive stimulation of adrenal glands by adrenocorticotropic hormone (ACTH), consequently, to adrenal hyperplasia and excessive androgen synthesis. The present study aimed to obtain and express CYP21A2 clones carrying sequence variations and to evaluate 21-hydroxylase enzymatic residual activities of variant enzymes in comparision to the wild-type. In silico studies were also performed to compare the structure of 21-hydroxylase and 3?-hydroxysteroid dehydrogenase type 2 (HSDB2) evaluating the impact of mutations upon the native structure of the enzymes. Residual activity analyses for 21-hydroxylase enzyme comprised the mutations p.Ser113Phe, p.Pro267Leu, p.Val358Ile and the combined mutations p.Ile172Asn+p.Val358Ile and p.Val281Leu+p.Arg426Cys. The assays indicated that p.Val358Ile and p.Ile172Asn+p.Val358Ile and p.Val281Leu+p.Arg426Cys reduced CYP21A2 activity to levels corresponding to the salt wasting form. Whereas the enzyme bearing p.Pro267Leu mutation showed residual activity higher than 50% indicating a nonclassic mutation. Conversely, p.Ser113Phe and p.Arg426Cys mutations showed residual activities that varied between 2% and 7% that, compared to controls, corresponded to simple virilizing form. Structural models generated for 21-hydroxylase enzyme with p.(Gln389_Ala391del) and each individual or combined mutations cited above have been compared to the native enzime. Similar study was performed with HSD3B2 enzyme in its native and mutated formas with p.Pro222Gln e p.Pro222Thr that are related to the salt wasting form of HSD3B2 deficiency. This study demonstrated a good genotype-phenotype correlation in patients either for residual activities or for structural changes. Therefore, it has been demonstrated that such analyses are effective to evaluate functional aspects for novel mutations / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutora em Genética e Biologia Molecular

Ziel der Untersuchungen war, zur Klärung der Ursachen einer während der letzten Jahrzehnte erhöhten Frequenz sowohl von PCOS als auch von IO beizutragen. Es war zu ermitteln, ob hormonelle Verschiebungen bei den Patienten nachweisbar und diese durch genetische und epigenetische Faktoren erklärbar sind. Ausgehend von dem Postulat, daß verminderte 21-OH- und 3beta-HSD-Aktivitäten als prädisponierende Faktoren von PCOS und IO angesehen werden, waren hormonanalytische Untersuchungen zur Ermittlung partieller 21-OH- bzw. 3beta-HSD-Defizienzen durchgeführt worden. Den eigenen Erfahrungen und Darstellungen der internationalen Literatur entsprechend befaßt sich ein Teil der Methodik mit der Entwicklung einer neuen, der üblichen 17alfa-OHP-Messung überlegenen Methode zur Ermittlung von 21-OH-Defizienzen durch 21-DOF-Bestimmung nach ACTH-Test im Blutplasma. Wir erhielten bei vier von 21 PCOS-Patientinnen und drei von acht Patienten mit IO erhöhte 21-DOF-, 21-DOF/F- bzw. 17alfa-OHP-Werte nach ACTH-Test, die auf partielle 21-OH-Defizienzen hinweisen. Zusätzlich wurden bei 12 PCOS-Patientinnen erhöhte basale DHEAS- oder DHEAS/F-Werte gefunden, die als Hinweise auf partielle 3beta-HSD-Defizienzen oder 17,20-Lyase-Hyperaktivität gedeutet wurden. In der Stichprobe der IO waren DHEAS oder DHEAS/F-Werte bei vier Patienten erhöht. Da bei vier der 12 Patientinnen mit PCOS und zwei von vier Patienten mit IO genetisch und endokrinologisch gleichzeitig eine partielle 21-OH-Defizienz nachgewiesen wurde, kann bei diesen Patienten eine partielle 3beta-HSD-Defizienz weitgehend ausgeschlossen werden. Es wurden molekulargenetische Untersuchungen für die 14 häufigsten Mutationen in CYP21 bei Cohorten mit AGS, PCOS und IO durchgeführt. Die Untersuchung der AGS-Patienten sollte dazu dienen, ein effizientes und schnelles System der Mutationssuche für diagnostische Zwecke zu etablieren. Es wurden die häufigsten, phänotypisch wirksamen Mutationen in CYP21 bei der Mehrzahl dieser Patientengruppe im homozygoten bzw. compound heterozygoten Zustand gefunden und eine deutliche Genotyp-Phänotyp-Korrelation festgestellt. Auch bei Patientinnen mit PCOS sowie bei IO, bei denen partielle 21-OH-Defizienzen nachweisbar waren, wurden Mutationen in CYP21 gefunden. Die hierbei heterozygot vorliegenden Mutationen waren dieselben, die homozygot oder compound heterozygot bei schweren Formen des AGS gefunden wurden. Es ergab sich eine Korrelation molekulargenetischer und hormonanalytischer Befunde bei AGS, PCOS sowie IO. Allerdings konnten bei der Mehrzahl der Fälle mit PCOS und mit IO weder Mutationen noch hormonelle Auffälligkeiten hinsichtlich partieller 21-OH-Defizienzen gefunden werden. Die jedoch bei vielen Patientinnen gefundenen erhöhten DHEAS- und DHEAS/F-Werte stimmen mit Untersuchungen überein, die parallel starke Zunahmen der Häufigkeit der Hemmung des Enzyms 3ß-HSD bzw. der Aktivierung der 17,20-Lyase bei PCOS-Patientinnen und der Prävalenz des PCOS selbst bei nach 1955 geborenen Frauen und von Spermatogenesestörungen bei nach 1960 geborenen Männern fanden. Die Ursache hierfür wird in der Beeinflussung der adrenalen und gonadalen Steroidhormonsynthese vor allem durch das Umweltteratogen DDT und seine Metaboliten gesehen. Weiterhin wurde der Umweltfaktor Streß diskutiert. Für die Ätiopathogenese der untersuchten Fertilitätsstörungen werden materno-fetale Mechanismen postuliert, worauf unsere sowohl molekulargenetischen als auch hormonanalytischen Befunde hinweisen. Insgesamt bestätigen die Ergebnisse unserer Arbeit die These, daß Leben auf der Interaktion von Genen und Umweltfaktoren beruht und daß Hormone dabei als Mediatoren wirken. In gen- oder umweltbedingten unphysiologischen Konzentrationen können sie während kritischer Entwicklungsphasen des neuroendokrinen Systems als Teratogene wirken und zu lebenslangen Reproduktionsstörungen führen. / This paper describes a mutational and hormonal screening in a cohort of 21 patients ultrasonically diagnosed with PCO. Our data show single heterozygous base pair CYP21 mutations in 4 patients. The four women with PCOS and CYP21 mutations also displayed clear signs of partial 21-hydroxylase deficiency through a significant rise in 21DOF or 17alfa-OHP plasma levels after ACTH stimulation. Azziz et al. have reported several heterozygous mutations in hyperandrogenic women with LO-CAH. Other studies report several heterozygous point mutations in hyperandrogenic woman who, however, were not examined for polycystic ovaries.The correlation between the hormone profiles and genetic screening results found with our patients underscores the latter s usefulness with PCOS patients. In contrast to the hormone profile, genetic screening is not influenced by external factors. The frequency of heterozygous CYP21 mutations is higher (19%) than in the normal population (5-8%), suggesting a link with PCOS in some cases. The ratio of LH/FSH was significantly raised in 43% of the cases. Most importantly, basal plasma DHEA-S levels and DHEA-S/F ratios were clearly increased, higher than the means +2SD in controls. This suggests a partial 3beta-hydroxysteroid dehydrogenase deficiency or 17,20 lyase hyperactivity. Other authors, however, were not able to find mutations in the corresponding genes. This could be explained by the fact that the DDT metabolite o,p DDD is a strong inhibitor of 3beta-HSD, and that DDT and its metabolites may be able to activate the 17,20 lyase, a cytochrome P450 enzyme. Furthermore, DDT has some oestrogen activity, and its perinatal administration can produce a PCOS-like syndrome in rats. Very significantly, there has not only been an approximately fourfold increased prevalence of PCO in women borne since 1955 in eastern Germany, following a massive prenatal exposure to DDT, but also a notable shift in the hormone profiles of those affected. A predominance of 3beta-HSD deficiencies and 17,20 lyase hyperactivity (70%) vs. 21-hydroxylase deficiency (23%) has emerged, in contrast with 21-hydroxylase deficiencies in 70% vs. 3beta-HSD deficiencies or 17,20 lyase hyperactivity in 14% for those born earlier than 1955. Similar results were obtained in this study for women with PCOS born since 1955, suggesting that the prenatal exposure of high amounts of DDT and its metabolites indeed appear to be responsible - at least in part - for the major increase in PCO and PCOS.

A deficiência da 21-hidroxilase é uma doença genética comum, causada por mutações no gene CYP21A2, que codifica a enzima 21-hidroxilase (P450c21). A deficiência da 21-hidroxilase afeta a síntese de cortisol e aldosterona e promove acúmulo de precursores, que são desviados para a síntese de andrógenos. Observa-se três principais fenótipos: a forma clássica virilizante simples (VS), na qual as meninas nascem com virilização da genitália externa e ambos os sexos apresentam virilização pós-natal; a forma perdedora de sal (PS), na qual além da virilização, ambos os sexos apresentam crise de perda de sal no período neonatal; e a forma não clássica (NC), na qual os sintomas de hiperandrogenismo iniciam-se mais tardiamente, na infância, adolescência ou idade adulta. Os estudos in vitro das mutações do CYP21A2 demonstram que existe uma boa correlação do grau de comprometimento da atividade enzimática conferido pelo genótipo com o fenótipo. Entretanto, existem algumas divergências como: pacientes que apresentam quadro clínico e hormonal de forma não clássica, nos quais mutações não são identificadas em um ou em ambos os alelos do CYP21A2, e pacientes que apresentam o fenótipo mais leve do que o predito pelo genótipo. Essas divergências sugerem a presença de fatores moduladores do fenótipo na deficiência da 21-hidroxilase. A primeira hipótese foi de que houvesse mutações no gene P450 óxido-redutase (POR), que codifica uma flavoproteína que doa elétrons para as enzimas microssomais P450, inclusive a P450c21, passo fundamental para a atividade enzimática das mesmas. A segunda hipótese foi de que outras enzimas P450, que não a P450c21, tivessem a capacidade de realizar a 21-hidroxilação extra-adrenal da progesterona e 17OH-progesterona (17OHP), sendo então capazes de modular o fenótipo da perda de sal e/ou virilização. Os citocromos P450 hepáticos CYP2C19 e CYP3A4, responsáveis pelo metabolismo de drogas, são capazes de realizar 21-hidroxilação da progesterona, porém essa atividade nunca foi comparada com a atividade de 21-hidroxilação da P450c21, a fim de que se possa extrapolar a importância dessa atividade extra-adrenal in vivo. A casuística desse estudo constou de 11 pacientes com a forma NC e genótipo incompleto, e 6 pacientes com fenótipo discordante do genótipo (5 com genótipo predizendo forma PS e manifestando forma VS, e 1 com genótipo predizendo VS e apresentando forma NC). O gene POR foi sequenciado em todos 17 pacientes e 10/30 alelos não relacionados apresentavam o polimorfismo A503V. O estudo funcional foi realizado através da expressão em bactéria do P450c21, do POR selvagem (PORwt) e da variante do POR A503V, e de estudo enzimático in vitro comparando a 21-hidroxilação da P450c21 promovida pela PORwt e POR A503V. Essa comparação foi realizada através de cálculos dos parâmetros que avaliam cinética enzimática (Km, Vmax e Vmax/Km). Apesar da variante POR A503V diminuir significativamente a atividade da P450c17 in vitro, nosso estudo demonstrou que ela não altera a capacidade de 21-hidroxilase da P450c21. Portanto, não existem substituições no POR que justifiquem as discordâncias de fenótipo/genótipo na deficiência da 21-hidroxilase nesta casuística. Para avaliarmos o papel da 21-hidroxilação extra-adrenal, as enzimas P450c21, as enzimas P450 hepáticas CYP2C19 e CYP3A4 e o POR foram expressos em bactéria. A capacidade das enzimas P450c21, CYP2C19 e CYP3A4 de 21- hidroxilar progesterona e 17OHP foram avaliadas in vitro e medidas através dos mesmos parâmetros de cinética enzimática. Comparado com a P450c21, o Vmax/Km da 21-hidroxilação da progesterona pelos CYP2C19 e CYP3A4 foram 17% e 10%, respectivamente. Os citocromos hepáticos não apresentaram atividade de 21-hidroxilação da 17OHP. Considerando que uma atividade residual mínima de 21-hidroxilação da progesterona é satisfatória para produzir quantidades suficientes de aldosterona para se evitar a perda de sal, este estudo sugere que a atividade de 21-hidroxilação extra-adrenal do CYP2C19 e CYP3A4 é capaz de melhorar o fenótipo de perda de sal, mas não o da deficiência de glicocorticóide. O gene CYP2C19, ao contrário do CYP3A4, é extremamente polimórfico, e são descritos vários haplótipos com diferentes atividades enzimáticas, os quais explicam as diferenças no metabolismo de várias drogas utilizadas na prática clínica. O único polimorfismo ultra-metabolizador é o CYP2C19*17, representado por duas substituições na região promotora que aumentam a transcrição do gene em 2-4 vezes. Os indivíduos que apresentam o haplótipo ultra-metabolizador podem ter maior atividade de 21-hidroxilação extraadrenal da progesterona e, dessa forma, não apresentarem a crise de perda de sal. O gene CYP2C19 foi sequenciado nos cinco pacientes com genótipo de forma perdedora de sal e que não desidrataram como predito, e encontramos o haplótipo ultra-metabolizador em homozigose em 1/5 pacientes e em heterozigose em 1/5 pacientes. Heterozigose para o CYP2C19*17 também foi encontrada no grupo controle (indivíduos perdedores de sal com genótipo/fenótipo concordantes). Portanto, o haplótipo CYP2C19*17 em heterozigose é insuficiente para modular a perda de sal e, provavelmente, em homozigose pode evitar a perda de sal. Em conclusão, pela primeira vez descrevemos o efeito modulador de uma variante alélica dos citocromos hepáticos P450 melhorando o fenótipo da forma perdedora de sal; no entanto, os demais casos permanecem com indefinição do genótipo. Estes resultados sugerem que não apenas uma única enzima, mas múltiplas enzimas extra-adrenais estão possivelmente envolvidas na modulação do fenótipo da deficiência da 21-hidroxilase. / Adrenal 21-hydroxylase deficiency is a common genetic disorder, caused by mutations in the CYP21A2 gene, which encodes the 21-hydroxylase P450c21. The 21-hydroxylase deficiency disrupts cortisol and aldosterone biosynthesis and leads to accumulation of androgen precursors. There are 3 main phenotypes: the simple virilizing (SV) form, in which girls present with virilized external genitalia at birth and both sexes present with precocious pseudopuberty; the salt wasting (SW) form, characterized by additional salt-wasting crisis in the neonatal period in both sexes; and the nonclassic (NC) form, in which the hyperandrogenic signs occur later in life, during childhood, adolescence or adulthood. In vitro studies show a good correlation between the degree of enzymatic impairment determined by genotype and phenotype. However, there are some discrepancies as: patients with clinical and hormonal profiles of nonclassic form in whom mutations are not found in one or both alleles, and patients with milder phenotype than the ones predicted by genotyping. These discrepancies suggest the existence of modulatory factors in 21- hydroxylase deficiency phenotype. The first hypothesis was that there were mutations in P450 oxidoreductase (POR), a gene which encodes a flavoprotein that donates electrons for all microsomal P450s, including P450c21, an essential step for P450s activity. The second hypothesis was that other enzymes that not P450c21 could perform extra-adrenal 21-hydroxylation of progesterone and 17OHprogesterone (17OHP), modulating salt balance and virilization. Hepatic drugmetabolizing P450 enzymes CYP2C19 and CYP3A4 can 21-hydroxylate progesterone; however, this activity was never compared to 21-hydroxylation performed by P450c21, in order to determine the importance of this extra-adrenal activity in vivo. The present cohort consisted of 11 patients with nonclassic form and incomplete genotype and 6 patients with genotype/phenotype discrepancies (genotype-predicted SW form and manifested SV form, n=5; genotyped-predicted SV form and manifested NC form, n=1). The POR gene was sequenced in these 17 patients, and 10/30 alleles presented the polymorphism A503V. P450c21, PORwt and POR A503V were expressed in bacteria, assayed in vitro, and the kinetics parameters Km, Vmax and Vmax/Km were calculated. Although POR A503V variant decreases the activity of P450c17, our study showed that it does not alter the 21-hydroxylation by P450c21. Therefore, there are no POR variants in this cohort that could explain discrepancies between genotype and phenotype in 21- hydroxylase deficiency. To evaluate the hypothesis of extra-adrenal 21- hydroxylation, P450c21, CYP2C19, CYP3A4, and POR were expressed in bacteria, assayed in vitro, and kinetic parameters assessed. Compared to P450c21, the Vmax/Km of 21-hydroxylation of progesterone by CYP2C19 and CYP3A4 was 17% and 10%, respectively. Neither CYP2C19 nor CYP3A4 were able to 21-hydroxylate 17OHP. Considering that little 21-hydroxylation activity is enough to produce sufficient amount of aldosterone to avoid the dehydration, this study suggests that extra-adrenal 21-hydroxylation by CYP2C19 and CYP3A4 may be able to ameliorate the mineralocorticoid, but not the glucocorticoid deficiency. CYP2C19 is very polymorphic, and some haplotypes can modify enzymatic activity. For example, the unique ultrametabolizer allele CYP2C19*17 has two polymorphisms in the promoter region that increase gene transcription in 2-4 times. Thus, patients harboring the CYP2C19 ultra-metabolizer allele could present an increased extraadrenal 21-hydroxylation of progesterone, and hence be able to avoid salt wasting crisis. CYP2C19 gene was sequenced in the 5 patients who did not present salt wasting crisis as expected, and 1/5 patients was homozygous and 1/5 patients was heterozygous for the CYP2C19*17 allele. Heterozygosity was also present in the control group (patients with salt wasting form and genotype/phenotype concordance). Therefore, heterozygosity for CYP2C19*17 seems to be insufficient to modulate salt balance but homozygosity might be able to avoid salt wasting crisis. In conclusion, we described for the first time the modulatory effect of an allelic variant of an extra-adrenal P450 enzyme ameliorating the salt wasting phenotype in a patient with 21-hydroxylase deficiency. Taken together with the remaining undefined genotypes, these results suggest that multiple extra-adrenal enzymes, rather than a single one, modulate the phenotypic expression of defects in 21-hydroxylase.

Introdução: A Hiperplasia Adrenal Congênita por deficiência da 21-hidroxilase (HAC) é uma doença com mortalidade neonatal elevada sendo elegível para programas públicos de Triagem Neonatal (TN). A HAC é causada por mutações no gene CYP21A2, as quais acarretam diferentes comprometimentos da atividade enzimática e resultam em espectro amplo de manifestações clínicas. Apesar da eficiência da TN para diagnosticar os casos graves, a taxa elevada de resultados falso-positivos (RFP), principalmente relacionados à prematuridade, é um dos maiores problemas. Porém, resultados falso-negativos também podem ocorrer em coletas antes de 24 horas de vida. No Brasil, a coleta da amostra neonatal difere entre os municípios, podendo ser no terceiro dia de vida como após. Objetivo: Avaliar se os valores da 17OH-progesterona neonatal (N17OHP) das coletas no terceiro dia de vida diferem significativamente das coletas a partir do quarto dia. Determinar qual percentil (99,5 ou 99,8) pode ser utilizado como valor de corte para a N17OHP, de acordo com o peso ao nascimento e tempo de vida na coleta, a fim de que proporcione taxa menor de RFP. Métodos: Foi avaliada, retrospectivamente, a N17OHP de 271.810 recém-nascidos (Rns) de acordo com o tempo de vida na coleta (G1: 48 - = 72h) e peso ao nascimento (P1: <= 1.500g, P2: 1.501-2.000g, P3: 2.001-2.500g e P4: >= 2.500g), pelo método imunofluorimétrico. Testes com resultados alterados foram confirmados no soro por Espectrometria de Massas em Tandem - LC-MS/MS. Rns afetados e/ou assintomáticos e com valores persistentemente elevados de 17OHP sérica foram submetidos ao estudo molécular, sequenciamento do gene CYP21A2. Resultados: os valores da N17OHP no grupo G1 foram significativamente menores do que em G2 em todos os grupos de peso (p < 0.001). A taxa de RFP em G1 e G2 foi de 0,2% para o percentil 99,8 e de 0,5% para o percentil 99,5 em ambos os grupos. O percentil 99,8 da N17OHP foi o melhor valor de corte para distinguir os Rns não afetados dos afetados, cujos valores são: G1 (P1: 120; P2: 71; P3: 39 e P4: 20 ng /mL) e em G2 (P1: 173; P2: 90; P3: 66 e P4: 25 ng/mL). Vinte e seis Rns do grupo G1 apresentaram a forma perdedora de sal (PS) (13H e 13M), nestes a N17OHP variou de 31 a 524 ng/mL e vinte Rns no grupo G2 (8H e 12M), nestes a N17OHP variou de 53 a 736 ng/mL. Para ambos os grupos foram encontrados três Rns com a forma virilizante simples (1H e 2M) e os valores da N17OHP variaram de 36 a 51 ng/mL. Resultados falso-negativos não foram relatados. O valor preditivo positivo (VPP) no teste do papel filtro foi de 5,6% e 14,1% nos grupos G1 e G2, respectivamente, ao se utilizar o percentil 99,8, e de 2,3% e 7% nos grupos G1 e G2 ao se utilizar o percentil 99,5. Dentre os casos com TN alterada (RFP), 29 deles também apresentaram 17OHP sérica elevada quando dosada por LC-MS/MS. Os casos assintomáticos foram acompanhados até normalização da 17OHP sérica e/ou submetidos ao estudo molecular, que identificou dois Rns com genótipo que prediz a forma não clássica. Conclusão: a melhor estratégia para otimização do diagnóstico da HAC na triagem neonatal é se padronizar valores de corte da N17OHP em dois grupos de acordo com o tempo de vida na coleta (antes e depois de 72 horas), subdivididos em quatro grupos de peso. A utilização dos valores de corte do percentil 99,8 se mantém eficaz no diagnóstico da HAC-21OH na triagem neonatal, reduzindo de forma significativa a taxa de RFP, sem perda do diagnóstico da forma PS / Introduction: Congenital Adrenal Hyperplasia (CAH) due to 21-hydroxylase is disorder with high mortality rate, being eligible for Public Programs of Newborn Screening (NBS). It is caused by mutations in the CYP21A2 gene leading to different impairments of enzyme activity and consequently to a spectrum of clinical manifestations. Despite the efficacy of NBS in diagnosing the severe clinical forms, the main concern is the high rate of false-positive results (FPR), mainly related to prematurity. False-negative results can also occur due to precocious sample collections, especially before 24 hs of life. Neonatal samples are collected at different times across our country, at third day of life or after. Objective: To determine if the values of neonatal 17OH-progesterone (N17OHP) collected on the third day of life differ significantly to the ones collected after the fourth day. To evaluate the best percentile of N17OHP values, according to birth-weight and age at the sample collection, to be used as a cut-off in NBS, in order to result in lower rate of FPR. Methods: N17OHP of 271,810 newborns (NB) according to sample collection time (G1: 48 - = 72 hs) and birth-weight (P1: <= 1,500g, P2: 1,501-2,000g, P3: 2,001-2,500 and P4: >2,500g) were retrospectively evaluated. N17OHP was measured by immunofluorimetric assay. N17OHP tests with altered values were confirmed through serum 17OHP by Tandem Mass Spectrometry - LC-MS/MS. Affected newborns (NB) and those asymptomatic with persistently increased serum 17OHP levels were submitted to molecular analysis, entire CYP21A2 gene sequencing. Results: N17OHP values of G1 on the third day of life were significantly lower than those of G2, in all birth-weight groups (p < 0.001). The FPR rate in G1 and G2 was 0.2% using the 99.8th and 0.5% in G1 and G2 using the 99.5th. The 99.8th percentile of N17OHP values was the best cut-off for distinguishing unaffected from affected NBs: G1 (P1: 120 ng/mL; P2: 71; P3: 39 and P4: 20 ng/mL) and G2 (P1: 173 ng/mL; P2: 90; P3: 66 and P4: 25 ng/mL). Twenty six (13M and 13F) NB were diagnosed with the salt wasting (SW) form, their N17OHP values ranged from 31 to 524 ng/mL. Twenty (8M, 12F) NB were diagnosed with the SW form in G2 group, N17OHP values ranged from 53 to 736 ng/mL. Three NB were diagnosed with the simple virilizing form (1M and 2F) in G1 and G2, their N17OHP values ranged from 36 to 51 ng/mL. False-negative results were not reported. The positive predictive value (PPV) of an altered neonatal test using the 99.8 percentile was 5.6% and 14.1% in G1 and G2, respectively, and using the percentile 99.5 was 2.3% and 7% in G1 and G2, respectively. Among cases with abnormal N17OHP result (RFP), 29 of them still presented with increased serum 17OHP levels through LC-MS/MS. Asymptomatic cases were followed up until normalization of serum 17OHP and/or submitted to molecular analysis, which identified two Rns with genotype that predicts the nonclassical form. Conclusions: the best strategy to optimize the CAH-NBS is to adjust N17OHP levels into two groups according to age at sample collection (before and after 72 hs), subdivided into four birth-weight groups. The use of N17OHP values according to the 99.8th remains effective to perform the CAH diagnosis CAH and significantly reduces the RFP rate without loss of diagnosis of the severe clinical forms

A deficiência da 21-hidroxilase é uma doença genética comum, causada por mutações no gene CYP21A2, que codifica a enzima 21-hidroxilase (P450c21). A deficiência da 21-hidroxilase afeta a síntese de cortisol e aldosterona e promove acúmulo de precursores, que são desviados para a síntese de andrógenos. Observa-se três principais fenótipos: a forma clássica virilizante simples (VS), na qual as meninas nascem com virilização da genitália externa e ambos os sexos apresentam virilização pós-natal; a forma perdedora de sal (PS), na qual além da virilização, ambos os sexos apresentam crise de perda de sal no período neonatal; e a forma não clássica (NC), na qual os sintomas de hiperandrogenismo iniciam-se mais tardiamente, na infância, adolescência ou idade adulta. Os estudos in vitro das mutações do CYP21A2 demonstram que existe uma boa correlação do grau de comprometimento da atividade enzimática conferido pelo genótipo com o fenótipo. Entretanto, existem algumas divergências como: pacientes que apresentam quadro clínico e hormonal de forma não clássica, nos quais mutações não são identificadas em um ou em ambos os alelos do CYP21A2, e pacientes que apresentam o fenótipo mais leve do que o predito pelo genótipo. Essas divergências sugerem a presença de fatores moduladores do fenótipo na deficiência da 21-hidroxilase. A primeira hipótese foi de que houvesse mutações no gene P450 óxido-redutase (POR), que codifica uma flavoproteína que doa elétrons para as enzimas microssomais P450, inclusive a P450c21, passo fundamental para a atividade enzimática das mesmas. A segunda hipótese foi de que outras enzimas P450, que não a P450c21, tivessem a capacidade de realizar a 21-hidroxilação extra-adrenal da progesterona e 17OH-progesterona (17OHP), sendo então capazes de modular o fenótipo da perda de sal e/ou virilização. Os citocromos P450 hepáticos CYP2C19 e CYP3A4, responsáveis pelo metabolismo de drogas, são capazes de realizar 21-hidroxilação da progesterona, porém essa atividade nunca foi comparada com a atividade de 21-hidroxilação da P450c21, a fim de que se possa extrapolar a importância dessa atividade extra-adrenal in vivo. A casuística desse estudo constou de 11 pacientes com a forma NC e genótipo incompleto, e 6 pacientes com fenótipo discordante do genótipo (5 com genótipo predizendo forma PS e manifestando forma VS, e 1 com genótipo predizendo VS e apresentando forma NC). O gene POR foi sequenciado em todos 17 pacientes e 10/30 alelos não relacionados apresentavam o polimorfismo A503V. O estudo funcional foi realizado através da expressão em bactéria do P450c21, do POR selvagem (PORwt) e da variante do POR A503V, e de estudo enzimático in vitro comparando a 21-hidroxilação da P450c21 promovida pela PORwt e POR A503V. Essa comparação foi realizada através de cálculos dos parâmetros que avaliam cinética enzimática (Km, Vmax e Vmax/Km). Apesar da variante POR A503V diminuir significativamente a atividade da P450c17 in vitro, nosso estudo demonstrou que ela não altera a capacidade de 21-hidroxilase da P450c21. Portanto, não existem substituições no POR que justifiquem as discordâncias de fenótipo/genótipo na deficiência da 21-hidroxilase nesta casuística. Para avaliarmos o papel da 21-hidroxilação extra-adrenal, as enzimas P450c21, as enzimas P450 hepáticas CYP2C19 e CYP3A4 e o POR foram expressos em bactéria. A capacidade das enzimas P450c21, CYP2C19 e CYP3A4 de 21- hidroxilar progesterona e 17OHP foram avaliadas in vitro e medidas através dos mesmos parâmetros de cinética enzimática. Comparado com a P450c21, o Vmax/Km da 21-hidroxilação da progesterona pelos CYP2C19 e CYP3A4 foram 17% e 10%, respectivamente. Os citocromos hepáticos não apresentaram atividade de 21-hidroxilação da 17OHP. Considerando que uma atividade residual mínima de 21-hidroxilação da progesterona é satisfatória para produzir quantidades suficientes de aldosterona para se evitar a perda de sal, este estudo sugere que a atividade de 21-hidroxilação extra-adrenal do CYP2C19 e CYP3A4 é capaz de melhorar o fenótipo de perda de sal, mas não o da deficiência de glicocorticóide. O gene CYP2C19, ao contrário do CYP3A4, é extremamente polimórfico, e são descritos vários haplótipos com diferentes atividades enzimáticas, os quais explicam as diferenças no metabolismo de várias drogas utilizadas na prática clínica. O único polimorfismo ultra-metabolizador é o CYP2C19*17, representado por duas substituições na região promotora que aumentam a transcrição do gene em 2-4 vezes. Os indivíduos que apresentam o haplótipo ultra-metabolizador podem ter maior atividade de 21-hidroxilação extraadrenal da progesterona e, dessa forma, não apresentarem a crise de perda de sal. O gene CYP2C19 foi sequenciado nos cinco pacientes com genótipo de forma perdedora de sal e que não desidrataram como predito, e encontramos o haplótipo ultra-metabolizador em homozigose em 1/5 pacientes e em heterozigose em 1/5 pacientes. Heterozigose para o CYP2C19*17 também foi encontrada no grupo controle (indivíduos perdedores de sal com genótipo/fenótipo concordantes). Portanto, o haplótipo CYP2C19*17 em heterozigose é insuficiente para modular a perda de sal e, provavelmente, em homozigose pode evitar a perda de sal. Em conclusão, pela primeira vez descrevemos o efeito modulador de uma variante alélica dos citocromos hepáticos P450 melhorando o fenótipo da forma perdedora de sal; no entanto, os demais casos permanecem com indefinição do genótipo. Estes resultados sugerem que não apenas uma única enzima, mas múltiplas enzimas extra-adrenais estão possivelmente envolvidas na modulação do fenótipo da deficiência da 21-hidroxilase. / Adrenal 21-hydroxylase deficiency is a common genetic disorder, caused by mutations in the CYP21A2 gene, which encodes the 21-hydroxylase P450c21. The 21-hydroxylase deficiency disrupts cortisol and aldosterone biosynthesis and leads to accumulation of androgen precursors. There are 3 main phenotypes: the simple virilizing (SV) form, in which girls present with virilized external genitalia at birth and both sexes present with precocious pseudopuberty; the salt wasting (SW) form, characterized by additional salt-wasting crisis in the neonatal period in both sexes; and the nonclassic (NC) form, in which the hyperandrogenic signs occur later in life, during childhood, adolescence or adulthood. In vitro studies show a good correlation between the degree of enzymatic impairment determined by genotype and phenotype. However, there are some discrepancies as: patients with clinical and hormonal profiles of nonclassic form in whom mutations are not found in one or both alleles, and patients with milder phenotype than the ones predicted by genotyping. These discrepancies suggest the existence of modulatory factors in 21- hydroxylase deficiency phenotype. The first hypothesis was that there were mutations in P450 oxidoreductase (POR), a gene which encodes a flavoprotein that donates electrons for all microsomal P450s, including P450c21, an essential step for P450s activity. The second hypothesis was that other enzymes that not P450c21 could perform extra-adrenal 21-hydroxylation of progesterone and 17OHprogesterone (17OHP), modulating salt balance and virilization. Hepatic drugmetabolizing P450 enzymes CYP2C19 and CYP3A4 can 21-hydroxylate progesterone; however, this activity was never compared to 21-hydroxylation performed by P450c21, in order to determine the importance of this extra-adrenal activity in vivo. The present cohort consisted of 11 patients with nonclassic form and incomplete genotype and 6 patients with genotype/phenotype discrepancies (genotype-predicted SW form and manifested SV form, n=5; genotyped-predicted SV form and manifested NC form, n=1). The POR gene was sequenced in these 17 patients, and 10/30 alleles presented the polymorphism A503V. P450c21, PORwt and POR A503V were expressed in bacteria, assayed in vitro, and the kinetics parameters Km, Vmax and Vmax/Km were calculated. Although POR A503V variant decreases the activity of P450c17, our study showed that it does not alter the 21-hydroxylation by P450c21. Therefore, there are no POR variants in this cohort that could explain discrepancies between genotype and phenotype in 21- hydroxylase deficiency. To evaluate the hypothesis of extra-adrenal 21- hydroxylation, P450c21, CYP2C19, CYP3A4, and POR were expressed in bacteria, assayed in vitro, and kinetic parameters assessed. Compared to P450c21, the Vmax/Km of 21-hydroxylation of progesterone by CYP2C19 and CYP3A4 was 17% and 10%, respectively. Neither CYP2C19 nor CYP3A4 were able to 21-hydroxylate 17OHP. Considering that little 21-hydroxylation activity is enough to produce sufficient amount of aldosterone to avoid the dehydration, this study suggests that extra-adrenal 21-hydroxylation by CYP2C19 and CYP3A4 may be able to ameliorate the mineralocorticoid, but not the glucocorticoid deficiency. CYP2C19 is very polymorphic, and some haplotypes can modify enzymatic activity. For example, the unique ultrametabolizer allele CYP2C19*17 has two polymorphisms in the promoter region that increase gene transcription in 2-4 times. Thus, patients harboring the CYP2C19 ultra-metabolizer allele could present an increased extraadrenal 21-hydroxylation of progesterone, and hence be able to avoid salt wasting crisis. CYP2C19 gene was sequenced in the 5 patients who did not present salt wasting crisis as expected, and 1/5 patients was homozygous and 1/5 patients was heterozygous for the CYP2C19*17 allele. Heterozygosity was also present in the control group (patients with salt wasting form and genotype/phenotype concordance). Therefore, heterozygosity for CYP2C19*17 seems to be insufficient to modulate salt balance but homozygosity might be able to avoid salt wasting crisis. In conclusion, we described for the first time the modulatory effect of an allelic variant of an extra-adrenal P450 enzyme ameliorating the salt wasting phenotype in a patient with 21-hydroxylase deficiency. Taken together with the remaining undefined genotypes, these results suggest that multiple extra-adrenal enzymes, rather than a single one, modulate the phenotypic expression of defects in 21-hydroxylase.

Introdução: A Hiperplasia Adrenal Congênita por deficiência da 21-hidroxilase (HAC) é uma doença com mortalidade neonatal elevada sendo elegível para programas públicos de Triagem Neonatal (TN). A HAC é causada por mutações no gene CYP21A2, as quais acarretam diferentes comprometimentos da atividade enzimática e resultam em espectro amplo de manifestações clínicas. Apesar da eficiência da TN para diagnosticar os casos graves, a taxa elevada de resultados falso-positivos (RFP), principalmente relacionados à prematuridade, é um dos maiores problemas. Porém, resultados falso-negativos também podem ocorrer em coletas antes de 24 horas de vida. No Brasil, a coleta da amostra neonatal difere entre os municípios, podendo ser no terceiro dia de vida como após. Objetivo: Avaliar se os valores da 17OH-progesterona neonatal (N17OHP) das coletas no terceiro dia de vida diferem significativamente das coletas a partir do quarto dia. Determinar qual percentil (99,5 ou 99,8) pode ser utilizado como valor de corte para a N17OHP, de acordo com o peso ao nascimento e tempo de vida na coleta, a fim de que proporcione taxa menor de RFP. Métodos: Foi avaliada, retrospectivamente, a N17OHP de 271.810 recém-nascidos (Rns) de acordo com o tempo de vida na coleta (G1: 48 - = 72h) e peso ao nascimento (P1: <= 1.500g, P2: 1.501-2.000g, P3: 2.001-2.500g e P4: >= 2.500g), pelo método imunofluorimétrico. Testes com resultados alterados foram confirmados no soro por Espectrometria de Massas em Tandem - LC-MS/MS. Rns afetados e/ou assintomáticos e com valores persistentemente elevados de 17OHP sérica foram submetidos ao estudo molécular, sequenciamento do gene CYP21A2. Resultados: os valores da N17OHP no grupo G1 foram significativamente menores do que em G2 em todos os grupos de peso (p < 0.001). A taxa de RFP em G1 e G2 foi de 0,2% para o percentil 99,8 e de 0,5% para o percentil 99,5 em ambos os grupos. O percentil 99,8 da N17OHP foi o melhor valor de corte para distinguir os Rns não afetados dos afetados, cujos valores são: G1 (P1: 120; P2: 71; P3: 39 e P4: 20 ng /mL) e em G2 (P1: 173; P2: 90; P3: 66 e P4: 25 ng/mL). Vinte e seis Rns do grupo G1 apresentaram a forma perdedora de sal (PS) (13H e 13M), nestes a N17OHP variou de 31 a 524 ng/mL e vinte Rns no grupo G2 (8H e 12M), nestes a N17OHP variou de 53 a 736 ng/mL. Para ambos os grupos foram encontrados três Rns com a forma virilizante simples (1H e 2M) e os valores da N17OHP variaram de 36 a 51 ng/mL. Resultados falso-negativos não foram relatados. O valor preditivo positivo (VPP) no teste do papel filtro foi de 5,6% e 14,1% nos grupos G1 e G2, respectivamente, ao se utilizar o percentil 99,8, e de 2,3% e 7% nos grupos G1 e G2 ao se utilizar o percentil 99,5. Dentre os casos com TN alterada (RFP), 29 deles também apresentaram 17OHP sérica elevada quando dosada por LC-MS/MS. Os casos assintomáticos foram acompanhados até normalização da 17OHP sérica e/ou submetidos ao estudo molecular, que identificou dois Rns com genótipo que prediz a forma não clássica. Conclusão: a melhor estratégia para otimização do diagnóstico da HAC na triagem neonatal é se padronizar valores de corte da N17OHP em dois grupos de acordo com o tempo de vida na coleta (antes e depois de 72 horas), subdivididos em quatro grupos de peso. A utilização dos valores de corte do percentil 99,8 se mantém eficaz no diagnóstico da HAC-21OH na triagem neonatal, reduzindo de forma significativa a taxa de RFP, sem perda do diagnóstico da forma PS / Introduction: Congenital Adrenal Hyperplasia (CAH) due to 21-hydroxylase is disorder with high mortality rate, being eligible for Public Programs of Newborn Screening (NBS). It is caused by mutations in the CYP21A2 gene leading to different impairments of enzyme activity and consequently to a spectrum of clinical manifestations. Despite the efficacy of NBS in diagnosing the severe clinical forms, the main concern is the high rate of false-positive results (FPR), mainly related to prematurity. False-negative results can also occur due to precocious sample collections, especially before 24 hs of life. Neonatal samples are collected at different times across our country, at third day of life or after. Objective: To determine if the values of neonatal 17OH-progesterone (N17OHP) collected on the third day of life differ significantly to the ones collected after the fourth day. To evaluate the best percentile of N17OHP values, according to birth-weight and age at the sample collection, to be used as a cut-off in NBS, in order to result in lower rate of FPR. Methods: N17OHP of 271,810 newborns (NB) according to sample collection time (G1: 48 - = 72 hs) and birth-weight (P1: <= 1,500g, P2: 1,501-2,000g, P3: 2,001-2,500 and P4: >2,500g) were retrospectively evaluated. N17OHP was measured by immunofluorimetric assay. N17OHP tests with altered values were confirmed through serum 17OHP by Tandem Mass Spectrometry - LC-MS/MS. Affected newborns (NB) and those asymptomatic with persistently increased serum 17OHP levels were submitted to molecular analysis, entire CYP21A2 gene sequencing. Results: N17OHP values of G1 on the third day of life were significantly lower than those of G2, in all birth-weight groups (p < 0.001). The FPR rate in G1 and G2 was 0.2% using the 99.8th and 0.5% in G1 and G2 using the 99.5th. The 99.8th percentile of N17OHP values was the best cut-off for distinguishing unaffected from affected NBs: G1 (P1: 120 ng/mL; P2: 71; P3: 39 and P4: 20 ng/mL) and G2 (P1: 173 ng/mL; P2: 90; P3: 66 and P4: 25 ng/mL). Twenty six (13M and 13F) NB were diagnosed with the salt wasting (SW) form, their N17OHP values ranged from 31 to 524 ng/mL. Twenty (8M, 12F) NB were diagnosed with the SW form in G2 group, N17OHP values ranged from 53 to 736 ng/mL. Three NB were diagnosed with the simple virilizing form (1M and 2F) in G1 and G2, their N17OHP values ranged from 36 to 51 ng/mL. False-negative results were not reported. The positive predictive value (PPV) of an altered neonatal test using the 99.8 percentile was 5.6% and 14.1% in G1 and G2, respectively, and using the percentile 99.5 was 2.3% and 7% in G1 and G2, respectively. Among cases with abnormal N17OHP result (RFP), 29 of them still presented with increased serum 17OHP levels through LC-MS/MS. Asymptomatic cases were followed up until normalization of serum 17OHP and/or submitted to molecular analysis, which identified two Rns with genotype that predicts the nonclassical form. Conclusions: the best strategy to optimize the CAH-NBS is to adjust N17OHP levels into two groups according to age at sample collection (before and after 72 hs), subdivided into four birth-weight groups. The use of N17OHP values according to the 99.8th remains effective to perform the CAH diagnosis CAH and significantly reduces the RFP rate without loss of diagnosis of the severe clinical forms