Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by Oliveira Flávia (flavia@sisbin.ufop.br) on 2014-12-09T19:50:52Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_AvaliaçãoVivoEfeito.pdf: 1898867 bytes, checksum: f85eee9ac16ab6cce5a6d1e2f8473061 (MD5) / Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2014-12-09T20:20:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_AvaliaçãoVivoEfeito.pdf: 1898867 bytes, checksum: f85eee9ac16ab6cce5a6d1e2f8473061 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-12-09T20:20:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_AvaliaçãoVivoEfeito.pdf: 1898867 bytes, checksum: f85eee9ac16ab6cce5a6d1e2f8473061 (MD5) Previous issue date: 2013 / O aumento dos níveis plasmáticos de aldosterona após infarto do miocárdio (IM) está relacionado com a piora do prognóstico da doença e contribui para patogênese da insuficiência cardíaca. O tratamento do IM com antagonistas de receptores mineralocorticoides (MR) da aldosterona, espironolactona e eplerenona, têm reduzido a remodelação do ventrículo esquerdo e a morte súbida. Entretanto, existem evidências clínicas e experimentais de que a cardioproteção promovida por esses antagonista pode ser em parte independente do bloqueio da ação da aldosterona. O objetivo do presente estudo foi avaliar comparativamente os efeitos cardioprotetores da espironolactona e eplerenona em um modelo agudo de isquemia cardíaca em ratos. Ratos machos wistar, submetidos a adrenalectomia lateral ou não foram tratados, via oral, com Espironolactona 20mg/kg ou Eplerenona 10mg/kg, na presença e na ausência de um antagonista de receptor GR (Mifepristona 20mg/kg) e submetidos a isquemia cardíaca. O sinal de ECG em ratos anestesiados foi obtido antes e após a ligadura coronária esquerda, durante 1 hora. A área sob a curva do segmento ST do ECG, um parâmetro que indica isquemia do miocárdio, foi significativamente menor para a espironolactona (53.9.3 ± 13,07) e eplerenona (31,3 ± 10,08) de animais tratados em comparação com os animais de controle (179,4 ± 32,3). Mifepristona (76,6 ± 14,54) não foi capaz de alterar os efeitos de espironolactona. Estes resultados sugerem que doses baixas de espironolactona e eplerenona são cardioprotetoras mesmo quando os níveis de aldosterona não estão aumentados e que este efeito não é dependente da ativação dos receptores GR. ______________________________________________________________________________________________ / ABSTRACT: The increasing plasma levels of aldosterona after myocardial infarction (MI) is related to its prognostic aggravation and contributes to the cardiac failure pathogenesis. The MI treatment with the mineralocorticoid receptors (MR) antagonists, spironolactone and eplerenone, can reduce the left ventricular remodeling and sudden death occurrence. However, clinical and experimental evidences demonstrated that this cardioprotection could be in part independent of the aldosterone inhibition. The mechanisms activated by these two drugs in the heart remain unknown. Spironolactone also presents glucocorticoid receptors (GR) affinity, which also shows cardioprotective properties. The objective of the present work was to evaluate the cardioprotective effects of spironolactone and eplerenone in a model of acute cardiac ischemia in rats. Male Wistar rats were first subjected to adrenalectomy and received by oral route 20mg/kg of spironolactone or 10mg/kg eplerenone in the presence and in the absence of mifepristone (20mg/kg), a GR receptor antagonist. The ECG signal was obtained in anaesthetized rats before and after the left coronary ligature, during 1 hour. The area under the curve of the ST segment of ECG, a parameter that indicates myocardial ischemia, was significantly smaller for the spironolactone (53.9.3±13.07) and eplerenone (31.3±10.08) treated animals compared to the control animals (179.4 ± 32.3). Mifepristone (76.6±14.54) was not able to alter the effects of spironolactone. These results suggest that low doses of spironolactone and eplerenone are cardioprotective even when plasma levels of aldosterone are not augmented and that this effect is not dependent of GR receptors activation.

Massas adrenais clinicamente silenciosas, diagnosticadas ao acaso ("incidentalomas"), são frequentemente encontradas em avaliações radiológicas devido ao constante progresso dos métodos de imagem. Na revisão das principais fontes científicas até 2004, analisado o grau de evidência concluiu-se: a maioria dos "incidentalomas" são não hipersecretores, mas a avaliação endócrina demonstrou que é comum o achado de hiperfunção hormonal discreto; "incidentaloma" acima de 6cm sugerem malignidade e entre 4-6cm devem ser analisadas por suas características de imagem; adrenalectomia deve ser indicada em massas adrenais funcionantes; massas adrenais não operadas devem ser acompanhadas pelo prazo de 2 anos / Introduction: Clinically silent adrenal masses, incidentally diagnosed during imaging methods performed for other clinical conditions (“incidentalomas") have been more frequently detected due to the constant improvement in imaging methods. There are several causes, diagnoses and treatments for these masses. Thus, whenever a physician comes across such lesion, it is necessary to define whether this mass is hormonally active and whether there is a risk of being malignant. Nevertheless, the methods for clarifying these issues have yet to be defined. Objective: To evaluate the best diagnosis, treatment and follow up of the incidental adrenal lesion. Methods: The main scientific literature available until October 2004 was reviewed, taking evidence into account. Results: Two studies which selected and reviewed articles until September 2003 were found. Fourty-three other studies included in a systematic review until October 2004 were added to this study. Conclusions: In general, “incidentalomas" are non-functioning, but endocrinological evaluation has shown that subclinical hormonal hyperfunction is not unusual, thus stressing the need for measuring substances such as with metanephrine assay, dexamethasone suppression test in low dosage and establishing the upright plasma aldosterone/plasma renin activity ratio. Non-functioning “incidentalomas" smaller than 4 cm should be followed carefully; those between 4 and 6 cm should be analyzed for its imaging characteristics; for those greater than 6 cm adrenalectomy is indicated. Functioning “incidentalomas" must undergo adrenalectomy. Nonoperated adrenal masses must be followed for two years through imaging and function testing.

Massas adrenais clinicamente silenciosas, diagnosticadas ao acaso ("incidentalomas"), são frequentemente encontradas em avaliações radiológicas devido ao constante progresso dos métodos de imagem. Na revisão das principais fontes científicas até 2004, analisado o grau de evidência concluiu-se: a maioria dos "incidentalomas" são não hipersecretores, mas a avaliação endócrina demonstrou que é comum o achado de hiperfunção hormonal discreto; "incidentaloma" acima de 6cm sugerem malignidade e entre 4-6cm devem ser analisadas por suas características de imagem; adrenalectomia deve ser indicada em massas adrenais funcionantes; massas adrenais não operadas devem ser acompanhadas pelo prazo de 2 anos / Introduction: Clinically silent adrenal masses, incidentally diagnosed during imaging methods performed for other clinical conditions (“incidentalomas”) have been more frequently detected due to the constant improvement in imaging methods. There are several causes, diagnoses and treatments for these masses. Thus, whenever a physician comes across such lesion, it is necessary to define whether this mass is hormonally active and whether there is a risk of being malignant. Nevertheless, the methods for clarifying these issues have yet to be defined. Objective: To evaluate the best diagnosis, treatment and follow up of the incidental adrenal lesion. Methods: The main scientific literature available until October 2004 was reviewed, taking evidence into account. Results: Two studies which selected and reviewed articles until September 2003 were found. Fourty-three other studies included in a systematic review until October 2004 were added to this study. Conclusions: In general, “incidentalomas” are non-functioning, but endocrinological evaluation has shown that subclinical hormonal hyperfunction is not unusual, thus stressing the need for measuring substances such as with metanephrine assay, dexamethasone suppression test in low dosage and establishing the upright plasma aldosterone/plasma renin activity ratio. Non-functioning “incidentalomas” smaller than 4 cm should be followed carefully; those between 4 and 6 cm should be analyzed for its imaging characteristics; for those greater than 6 cm adrenalectomy is indicated. Functioning “incidentalomas” must undergo adrenalectomy. Nonoperated adrenal masses must be followed for two years through imaging and function testing.

Orientador: Marcus Antonio Rossi Feliciano / Coorientador: Wilter Ricardo Russiano Vicente / Coorientador: Sofia Borin Crivellenti / Banca: Eliandra Antônia Pires Buttler / Banca: Lenadro Zuccolotto Crivellenti / Resumo: As glândulas adrenais exercem papel fundamental na manutenção da homeostasia tanto em humanos, como nos animais, logo a avaliação ultrassonográfica dessas glândulas deve ser rotina, uma vez que pode auxiliar no diagnóstico de uma dada afecção, principalmente o hiperadrenocorticismo, doença relativamente comum principalmente nos cães, cujo diagnóstico baseia-se na avaliação do eixo hormonal hipotálamo-hipófise-adrenal. Quanto às outras doenças, como neoplasias, cistos, hiperplasias, dentre outras, o diagnostico se torna desafiador, pois depende de métodos invasivos de alto risco. Logo, este estudo buscou a aplicabilidade de técnicas de imagem avançadas e não invasivas, como a elastografia ARFI (quantitativa e qualitativa) e a ultrassonografia Doppler, com o objetivo de determinar os valores de normalidade ainda não relatados. Os resultados obtidos na avaliação ultrassonográfica modo-B nos cães saudáveis, mostraram hipoecoica em relação a gordura adjacente, homogêneas, contorno liso, formato típico e dimensões dentro dos valores de normalidade. A avaliação Doppler determinou os índices vasculares da artéria frênico-abdominal da glândula adrenal esquerda: velocidade sistólica 31,34 ± 5,79 cm/s e velocidade diastólica 9,54±3,03 cm/s, e da glândula adrenal direita: velocidade sistólica: 34,25±8,18 cm/s e velocidade diastólica 10,72±3,75 cm/s. Portanto, este estudo conseguiu com êxito demostrar a aplicabilidade destas técnicas na avalição das glândulas adrenais, mostrando-se promis... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The adrenals glands have an important role in maintaining homeostasis in humans and animals, so the ultrasonography evaluation of these glands should be routine, since it may help in the early diagnosis of a particular condition, as hyperadrenocorticism, a relatively common disease mostly in dogs, whose diagnosis is based on the evaluation of the hypothalamic-pituitary-adrenal hormonal axis. Other diseases such as tumors, cysts, hyperplasia, among others, the diagnosis becomes challenging because it depends on high-risk invasive methods. Therefore, this study sought the application of advanced imaging techniques and non-invasive, such as elastography ARFI (quantitative and qualitative) and Doppler ultrasound, in order to determine normal values not reported yet. The results obtained in the ultrasound B-mode assessment in healthy dogs, were within the normal range. The Doppler evaluation determined the vascular indices of the phrenic-abdominal artery of the left adrenal gland: systolic velocity 31.34 ± 5.79 cm / s and diastolic velocity 9:54 ± 3:03 cm / s, and right adrenal gland: systolic velocity: 34.25 ± 8.18 cm / s speed diastolic 10.72 ± 3.75 cm / s, hitherto not described in the veterinary literature. Therefore, this study was able to successfully demonstrate the applicability of these techniques in adrenal glands, showing promise for the diagnosis aid conditions of the canine adrenals. / Mestre

Orientador: Márcia Rita Fernandes Machado / Banca: Leandro Luís Martins / Banca: Ana Carolina Gonçalves dos Reis / Banca: Fabrício Singaretti de Oliveira / Banca: Tais Harumi de Castro Sasahara / Resumo: A paca (Cuniculus paca, Linnaeus, 1766) é um roedor de porte médio, que embora pertença à fauna brasileira, poucas são as informações sobre sua morfologia na literatura especializada. Nesse sentido, objetivou-se estudar a morfologia da sua glândula adrenal mediante análise à microscopia de luz, microscopia eletrônica de varredura e de transmissão, glândula essa cuja importância refere-se ao fato de ser um órgão secretor de substâncias particulares que provocam no organismo funções biológicas de alta importância, além de subsidiar uma base anatômica de grande ajuda em várias áreas da investigação biomédica e ainda fornecer dados para a realização de estudos comparativos. Foram utilizadas dez pacas adultas, machos e fêmeas, provenientes do plantel do Setor de Animais Silvestres da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinarias, UNESP- Jaboticabal, Jaboticabal-SP. Após a eutanásia foram posicionadas em decúbito dorsal e foi realizada a abertura de sua cavidade abdominal por meio de incisão pré-retro umbilical, seguido do rebatimento lateral das paredes abdominais para a exposição da glândula em questão. As glândulas adrenais foram individualizadas e fragmentos das glândulas foram colhidos e fixados para observação histológica e ultraestrutural. Mensurou-se as espessuras das camadas do córtex adrenal e analisou-se os resultados pela estatística descritiva, teste Kruskal-Wallis (p<0,01) e teste de Dunn (p<0,05). Constatou-se que a morfologia geral da glândula adrenal da paca assemelha-se aos outros mamíferos; estatisticamente, as camadas do córtex adrenal diferem entre si em relação às suas espessuras / Abstract: The agouti (Cuniculus paca, Linnaeus, 1766) is a medium size rodent although it belongs to Brazilian fauna, there is a little information in the literature about its morphology. Therefore, the aim of this study was to describe the morphological characteristics of their adrenal gland by analysis with light microscopy, scanning electron microscopy and transmission. This is important because adrenal gland is an organ that secrets particular substances in the body that promote biological functions and provides an anatomical basis in many areas of biomedical research for comparative studies. Ten adults agouti were used is this study, four males and four females, from Department Wild Animals of Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinarias, UNESP- Jaboticabal, Jaboticabal-SP. After their euthanasia they were put in a supine position and their abdominal cavity was opened with an incision umbilical medline incision, followed by lateral abdominal wall removal to expose the gland.The adrenal glands were isolated, fragments were collected, fixed and prepared for histological and ultrastructural observation. The thickness of the layers adrenal cortex were measured and the results analyzed using descriptive statistics, Kruskal-Wallis test (p <0.01) and Dunn (p <0.05). It was found that the overall morphology of the adrenal gland paca resembles other mammals. Statistically layers of the adrenal cortex differ regarding their thicknesses / Doutor

O carcinoma do córtex da supra-renal (ACC) é uma neoplasia rara e de prognóstico sombrio. Embora estudos moleculares tenham explorado diversos aspectos relacionados à tumorigênese destas neoplasias, o conhecimento das vias relacionadas à disseminação metastática é restrito. O objetivo do presente estudo é avaliar a expressão de genes relacionados a metástases em uma coorte de pacientes portadores de tumores do córtex da supra-renal metastáticos e não-metastáticos, a fim de identificar vias envolvidas na disseminação metastática destas neoplasias, novos marcadores prognósticos e eventuais alvos terapêuticos. Os perfis de expressão de 27 tumores do córtex da supra-renal de 15 pacientes adultos (8 ACC e 7 adenomas) e 12 pediátricos (5 metastáticos e 7 não-metastáticos) foram avaliados por um array de expressão contendo um painel de 113 genes que sabidamente estão envolvidos no processo de disseminação metastática de diversas neoplasias humanas. A análise de grupamentos mostrou que adenoma dos pacientes adultos forma um grupo distinto dos demais tumores (ACC de adultos e tumores pediátricos). Os genes MMP11e DENR foram identificados como diferencialmente expressos quando se compararam os adenomas e ACC de adultos. Na comparação dos tumores pediátricos nenhum gene foi diferencialmente expresso. Assim como a análise de grupamento, a PCA utilizando grupo selecionado de genes também não foi capaz partir os tumores pediátricos em subgrupos pela evolução. A expressão dos genes MMP2, TIMP3 e FN1 também foram avaliados por RT-PCR e foram concordantes com os dados gerados pelo array de expressão. O papel da LOH como causa da redução da expressão de TIMP3 foi estudado com tipagem de microssatélites. Em alguns casos, foi identificada LOH da região 22q13. Porém, em outros casos em que a expressão do TIMP3 foi bastante reduzida, não houve LOH. Em resumo, foram identificados aspectos moleculares importantes envolvidos na disseminação e metástases de neoplasias do córtex da supra-renal de adultos e crianças, bem como características biológicas deste processo. Diferentes padrões de expressão identificados em tumores metastáticos e não-metastáticos podem ajudar na predição do prognóstico / Adrenocortical carcinoma (ACC) is a rare neoplasm with a poor prognosis. Although molecular studies have uncovered many aspects of ACC tumorigenesis, little is known about molecular pathways involved in metastatic spread. The objective of our study is to analyze the expression profile of metastasis-related genes in a cohort of metastatic and nonmetastatic adrenocortical tumors in order to identify genes involved in the metastatic spread, as well as to find new prognostic markers. The expression profiles of 27 adrenocortical tumors from 15 adults (8 ACC and 7 adenomas) and 12 children (5 metastatic and 7 non-metastatic) were evaluated by an array of 113 known to be involved in human metastasis. Cluster analysis showed adult adrenocortical adenomas form a group distinct from other adrenocortical tumors (adult carcinomas and pediatric tumors). The comparison of adult adenoma and ACC revealed that MMP11 and DENR were differentially expressed between these two groups while no gene was differentially expressed among pediatric adrenocortical tumors. Similarly to cluster analysis, Principal component analysis failed to identify partition amongst pediatric tumors categorized by their evolution. The expression data of MMP2, TIMP3 and FN1 genes by RT-PCR agreed with those generated by the arrays. LOH of 22q12.3 region was detected in some cases in which TIMP3 down regulation was verified (but not in all cases). In conclusion, we have identified important aspects of molecular pathways and biological characteristics involved in metastatic spread of adrenocortical tumors. Distinctive patterns of gene expression between metastatic and nonmetastatic tumors may help in prognosis prediction

O carcinoma do córtex da supra-renal (ACC) é uma neoplasia rara e de prognóstico sombrio. Embora estudos moleculares tenham explorado diversos aspectos relacionados à tumorigênese destas neoplasias, o conhecimento das vias relacionadas à disseminação metastática é restrito. O objetivo do presente estudo é avaliar a expressão de genes relacionados a metástases em uma coorte de pacientes portadores de tumores do córtex da supra-renal metastáticos e não-metastáticos, a fim de identificar vias envolvidas na disseminação metastática destas neoplasias, novos marcadores prognósticos e eventuais alvos terapêuticos. Os perfis de expressão de 27 tumores do córtex da supra-renal de 15 pacientes adultos (8 ACC e 7 adenomas) e 12 pediátricos (5 metastáticos e 7 não-metastáticos) foram avaliados por um array de expressão contendo um painel de 113 genes que sabidamente estão envolvidos no processo de disseminação metastática de diversas neoplasias humanas. A análise de grupamentos mostrou que adenoma dos pacientes adultos forma um grupo distinto dos demais tumores (ACC de adultos e tumores pediátricos). Os genes MMP11e DENR foram identificados como diferencialmente expressos quando se compararam os adenomas e ACC de adultos. Na comparação dos tumores pediátricos nenhum gene foi diferencialmente expresso. Assim como a análise de grupamento, a PCA utilizando grupo selecionado de genes também não foi capaz partir os tumores pediátricos em subgrupos pela evolução. A expressão dos genes MMP2, TIMP3 e FN1 também foram avaliados por RT-PCR e foram concordantes com os dados gerados pelo array de expressão. O papel da LOH como causa da redução da expressão de TIMP3 foi estudado com tipagem de microssatélites. Em alguns casos, foi identificada LOH da região 22q13. Porém, em outros casos em que a expressão do TIMP3 foi bastante reduzida, não houve LOH. Em resumo, foram identificados aspectos moleculares importantes envolvidos na disseminação e metástases de neoplasias do córtex da supra-renal de adultos e crianças, bem como características biológicas deste processo. Diferentes padrões de expressão identificados em tumores metastáticos e não-metastáticos podem ajudar na predição do prognóstico / Adrenocortical carcinoma (ACC) is a rare neoplasm with a poor prognosis. Although molecular studies have uncovered many aspects of ACC tumorigenesis, little is known about molecular pathways involved in metastatic spread. The objective of our study is to analyze the expression profile of metastasis-related genes in a cohort of metastatic and nonmetastatic adrenocortical tumors in order to identify genes involved in the metastatic spread, as well as to find new prognostic markers. The expression profiles of 27 adrenocortical tumors from 15 adults (8 ACC and 7 adenomas) and 12 children (5 metastatic and 7 non-metastatic) were evaluated by an array of 113 known to be involved in human metastasis. Cluster analysis showed adult adrenocortical adenomas form a group distinct from other adrenocortical tumors (adult carcinomas and pediatric tumors). The comparison of adult adenoma and ACC revealed that MMP11 and DENR were differentially expressed between these two groups while no gene was differentially expressed among pediatric adrenocortical tumors. Similarly to cluster analysis, Principal component analysis failed to identify partition amongst pediatric tumors categorized by their evolution. The expression data of MMP2, TIMP3 and FN1 genes by RT-PCR agreed with those generated by the arrays. LOH of 22q12.3 region was detected in some cases in which TIMP3 down regulation was verified (but not in all cases). In conclusion, we have identified important aspects of molecular pathways and biological characteristics involved in metastatic spread of adrenocortical tumors. Distinctive patterns of gene expression between metastatic and nonmetastatic tumors may help in prognosis prediction

Para avaliar a reserva adrenal após o uso de glicocorticóide na fase de indução de remissão em pacientes com Leucemia Linfocítica Aguda, estudo duplo-cego foi realizado em 29 crianças e adolescentes de 1,7 a 15,9 anos (média:6,8 anos], que receberam por escolha aleatória, Prednisona na dose de 40 mg/m²/dia ou Dexametasona, 6 mg/m²/dia, via oral, por um mês. Testes do ACTH em baixa dose (1,0 µg/m² EV) foram realizados antes e a cada 7 dias por 8 semanas para avaliar pico de cortisol após o estímulo. Não houve diferença significativa entre as médias dos picos de cortisol nos testes realizados em cada grupo e entre os dois grupos, mostrando reserva adrenal adequada. Não houve correlação entre os picos de cortisol nos dois grupos e a presença de infecção / In order to evaluate adrenal reserve after adminstration of glucocorticoid during induction phase in patients with Acute LymphociticLeukemia, a double-blind study was performed in 29 children and adolescents 1,7 to 15.9 years old (mean: 6.8 years old), who randomly were chosen to receive either Prednisone, 40 mg/m²/day or Dexamethasone, 6 mg/m²/day, PO, for one month. Low-dose ACTH tests (1.0 µg/m² IV), were performed before and every 7 days after glucocorticoid for 8 weeks. There were no significant differences of cortisol mean peak levels in the tests of each group and in both group, suggesting adequate adrenal reserve. There was no correlation of cortisol mean peak levels in both groups and the presence of infection

Para avaliar a reserva adrenal após o uso de glicocorticóide na fase de indução de remissão em pacientes com Leucemia Linfocítica Aguda, estudo duplo-cego foi realizado em 29 crianças e adolescentes de 1,7 a 15,9 anos (média:6,8 anos], que receberam por escolha aleatória, Prednisona na dose de 40 mg/m²/dia ou Dexametasona, 6 mg/m²/dia, via oral, por um mês. Testes do ACTH em baixa dose (1,0 µg/m² EV) foram realizados antes e a cada 7 dias por 8 semanas para avaliar pico de cortisol após o estímulo. Não houve diferença significativa entre as médias dos picos de cortisol nos testes realizados em cada grupo e entre os dois grupos, mostrando reserva adrenal adequada. Não houve correlação entre os picos de cortisol nos dois grupos e a presença de infecção / In order to evaluate adrenal reserve after adminstration of glucocorticoid during induction phase in patients with Acute LymphociticLeukemia, a double-blind study was performed in 29 children and adolescents 1,7 to 15.9 years old (mean: 6.8 years old), who randomly were chosen to receive either Prednisone, 40 mg/m²/day or Dexamethasone, 6 mg/m²/day, PO, for one month. Low-dose ACTH tests (1.0 µg/m² IV), were performed before and every 7 days after glucocorticoid for 8 weeks. There were no significant differences of cortisol mean peak levels in the tests of each group and in both group, suggesting adequate adrenal reserve. There was no correlation of cortisol mean peak levels in both groups and the presence of infection

A deficiência da 21-hidroxilase é uma doença genética comum, causada por mutações no gene CYP21A2, que codifica a enzima 21-hidroxilase (P450c21). A deficiência da 21-hidroxilase afeta a síntese de cortisol e aldosterona e promove acúmulo de precursores, que são desviados para a síntese de andrógenos. Observa-se três principais fenótipos: a forma clássica virilizante simples (VS), na qual as meninas nascem com virilização da genitália externa e ambos os sexos apresentam virilização pós-natal; a forma perdedora de sal (PS), na qual além da virilização, ambos os sexos apresentam crise de perda de sal no período neonatal; e a forma não clássica (NC), na qual os sintomas de hiperandrogenismo iniciam-se mais tardiamente, na infância, adolescência ou idade adulta. Os estudos in vitro das mutações do CYP21A2 demonstram que existe uma boa correlação do grau de comprometimento da atividade enzimática conferido pelo genótipo com o fenótipo. Entretanto, existem algumas divergências como: pacientes que apresentam quadro clínico e hormonal de forma não clássica, nos quais mutações não são identificadas em um ou em ambos os alelos do CYP21A2, e pacientes que apresentam o fenótipo mais leve do que o predito pelo genótipo. Essas divergências sugerem a presença de fatores moduladores do fenótipo na deficiência da 21-hidroxilase. A primeira hipótese foi de que houvesse mutações no gene P450 óxido-redutase (POR), que codifica uma flavoproteína que doa elétrons para as enzimas microssomais P450, inclusive a P450c21, passo fundamental para a atividade enzimática das mesmas. A segunda hipótese foi de que outras enzimas P450, que não a P450c21, tivessem a capacidade de realizar a 21-hidroxilação extra-adrenal da progesterona e 17OH-progesterona (17OHP), sendo então capazes de modular o fenótipo da perda de sal e/ou virilização. Os citocromos P450 hepáticos CYP2C19 e CYP3A4, responsáveis pelo metabolismo de drogas, são capazes de realizar 21-hidroxilação da progesterona, porém essa atividade nunca foi comparada com a atividade de 21-hidroxilação da P450c21, a fim de que se possa extrapolar a importância dessa atividade extra-adrenal in vivo. A casuística desse estudo constou de 11 pacientes com a forma NC e genótipo incompleto, e 6 pacientes com fenótipo discordante do genótipo (5 com genótipo predizendo forma PS e manifestando forma VS, e 1 com genótipo predizendo VS e apresentando forma NC). O gene POR foi sequenciado em todos 17 pacientes e 10/30 alelos não relacionados apresentavam o polimorfismo A503V. O estudo funcional foi realizado através da expressão em bactéria do P450c21, do POR selvagem (PORwt) e da variante do POR A503V, e de estudo enzimático in vitro comparando a 21-hidroxilação da P450c21 promovida pela PORwt e POR A503V. Essa comparação foi realizada através de cálculos dos parâmetros que avaliam cinética enzimática (Km, Vmax e Vmax/Km). Apesar da variante POR A503V diminuir significativamente a atividade da P450c17 in vitro, nosso estudo demonstrou que ela não altera a capacidade de 21-hidroxilase da P450c21. Portanto, não existem substituições no POR que justifiquem as discordâncias de fenótipo/genótipo na deficiência da 21-hidroxilase nesta casuística. Para avaliarmos o papel da 21-hidroxilação extra-adrenal, as enzimas P450c21, as enzimas P450 hepáticas CYP2C19 e CYP3A4 e o POR foram expressos em bactéria. A capacidade das enzimas P450c21, CYP2C19 e CYP3A4 de 21- hidroxilar progesterona e 17OHP foram avaliadas in vitro e medidas através dos mesmos parâmetros de cinética enzimática. Comparado com a P450c21, o Vmax/Km da 21-hidroxilação da progesterona pelos CYP2C19 e CYP3A4 foram 17% e 10%, respectivamente. Os citocromos hepáticos não apresentaram atividade de 21-hidroxilação da 17OHP. Considerando que uma atividade residual mínima de 21-hidroxilação da progesterona é satisfatória para produzir quantidades suficientes de aldosterona para se evitar a perda de sal, este estudo sugere que a atividade de 21-hidroxilação extra-adrenal do CYP2C19 e CYP3A4 é capaz de melhorar o fenótipo de perda de sal, mas não o da deficiência de glicocorticóide. O gene CYP2C19, ao contrário do CYP3A4, é extremamente polimórfico, e são descritos vários haplótipos com diferentes atividades enzimáticas, os quais explicam as diferenças no metabolismo de várias drogas utilizadas na prática clínica. O único polimorfismo ultra-metabolizador é o CYP2C19*17, representado por duas substituições na região promotora que aumentam a transcrição do gene em 2-4 vezes. Os indivíduos que apresentam o haplótipo ultra-metabolizador podem ter maior atividade de 21-hidroxilação extraadrenal da progesterona e, dessa forma, não apresentarem a crise de perda de sal. O gene CYP2C19 foi sequenciado nos cinco pacientes com genótipo de forma perdedora de sal e que não desidrataram como predito, e encontramos o haplótipo ultra-metabolizador em homozigose em 1/5 pacientes e em heterozigose em 1/5 pacientes. Heterozigose para o CYP2C19*17 também foi encontrada no grupo controle (indivíduos perdedores de sal com genótipo/fenótipo concordantes). Portanto, o haplótipo CYP2C19*17 em heterozigose é insuficiente para modular a perda de sal e, provavelmente, em homozigose pode evitar a perda de sal. Em conclusão, pela primeira vez descrevemos o efeito modulador de uma variante alélica dos citocromos hepáticos P450 melhorando o fenótipo da forma perdedora de sal; no entanto, os demais casos permanecem com indefinição do genótipo. Estes resultados sugerem que não apenas uma única enzima, mas múltiplas enzimas extra-adrenais estão possivelmente envolvidas na modulação do fenótipo da deficiência da 21-hidroxilase. / Adrenal 21-hydroxylase deficiency is a common genetic disorder, caused by mutations in the CYP21A2 gene, which encodes the 21-hydroxylase P450c21. The 21-hydroxylase deficiency disrupts cortisol and aldosterone biosynthesis and leads to accumulation of androgen precursors. There are 3 main phenotypes: the simple virilizing (SV) form, in which girls present with virilized external genitalia at birth and both sexes present with precocious pseudopuberty; the salt wasting (SW) form, characterized by additional salt-wasting crisis in the neonatal period in both sexes; and the nonclassic (NC) form, in which the hyperandrogenic signs occur later in life, during childhood, adolescence or adulthood. In vitro studies show a good correlation between the degree of enzymatic impairment determined by genotype and phenotype. However, there are some discrepancies as: patients with clinical and hormonal profiles of nonclassic form in whom mutations are not found in one or both alleles, and patients with milder phenotype than the ones predicted by genotyping. These discrepancies suggest the existence of modulatory factors in 21- hydroxylase deficiency phenotype. The first hypothesis was that there were mutations in P450 oxidoreductase (POR), a gene which encodes a flavoprotein that donates electrons for all microsomal P450s, including P450c21, an essential step for P450s activity. The second hypothesis was that other enzymes that not P450c21 could perform extra-adrenal 21-hydroxylation of progesterone and 17OHprogesterone (17OHP), modulating salt balance and virilization. Hepatic drugmetabolizing P450 enzymes CYP2C19 and CYP3A4 can 21-hydroxylate progesterone; however, this activity was never compared to 21-hydroxylation performed by P450c21, in order to determine the importance of this extra-adrenal activity in vivo. The present cohort consisted of 11 patients with nonclassic form and incomplete genotype and 6 patients with genotype/phenotype discrepancies (genotype-predicted SW form and manifested SV form, n=5; genotyped-predicted SV form and manifested NC form, n=1). The POR gene was sequenced in these 17 patients, and 10/30 alleles presented the polymorphism A503V. P450c21, PORwt and POR A503V were expressed in bacteria, assayed in vitro, and the kinetics parameters Km, Vmax and Vmax/Km were calculated. Although POR A503V variant decreases the activity of P450c17, our study showed that it does not alter the 21-hydroxylation by P450c21. Therefore, there are no POR variants in this cohort that could explain discrepancies between genotype and phenotype in 21- hydroxylase deficiency. To evaluate the hypothesis of extra-adrenal 21- hydroxylation, P450c21, CYP2C19, CYP3A4, and POR were expressed in bacteria, assayed in vitro, and kinetic parameters assessed. Compared to P450c21, the Vmax/Km of 21-hydroxylation of progesterone by CYP2C19 and CYP3A4 was 17% and 10%, respectively. Neither CYP2C19 nor CYP3A4 were able to 21-hydroxylate 17OHP. Considering that little 21-hydroxylation activity is enough to produce sufficient amount of aldosterone to avoid the dehydration, this study suggests that extra-adrenal 21-hydroxylation by CYP2C19 and CYP3A4 may be able to ameliorate the mineralocorticoid, but not the glucocorticoid deficiency. CYP2C19 is very polymorphic, and some haplotypes can modify enzymatic activity. For example, the unique ultrametabolizer allele CYP2C19*17 has two polymorphisms in the promoter region that increase gene transcription in 2-4 times. Thus, patients harboring the CYP2C19 ultra-metabolizer allele could present an increased extraadrenal 21-hydroxylation of progesterone, and hence be able to avoid salt wasting crisis. CYP2C19 gene was sequenced in the 5 patients who did not present salt wasting crisis as expected, and 1/5 patients was homozygous and 1/5 patients was heterozygous for the CYP2C19*17 allele. Heterozygosity was also present in the control group (patients with salt wasting form and genotype/phenotype concordance). Therefore, heterozygosity for CYP2C19*17 seems to be insufficient to modulate salt balance but homozygosity might be able to avoid salt wasting crisis. In conclusion, we described for the first time the modulatory effect of an allelic variant of an extra-adrenal P450 enzyme ameliorating the salt wasting phenotype in a patient with 21-hydroxylase deficiency. Taken together with the remaining undefined genotypes, these results suggest that multiple extra-adrenal enzymes, rather than a single one, modulate the phenotypic expression of defects in 21-hydroxylase.