Shigellen sind die Erreger der bakteriellen Ruhr beim Menschen, ihrem einzigen bisher bekannten Wirt. Ein wesentlicher Virulenzfaktor von Shigellen ist ihre Fähigkeit, in Epithelzellen des Intestinaltraktes einzudringen. Dabei induziert Shigella in der Wirtszelle Zytoskelettrearrangements, die zur Ausbildung einer blütenartigen Membranstruktur um das Bakterium herum führen, die schließlich über dem eindringenden Bakterium konfluiert und damit den Mikroorganismus internalisiert. Die Zytoskelettveränderungen sind essenziell für den Internalisierungsmechanismus und werden von der kleinen GTPase Rho gesteuert, wobei die Rho-Aktivität zeitlich und räumlich streng reguliert wird, um eine überschießende Bildung von F-Aktin auf Kosten des zellulären G-Aktin-pools zu verhindern. Myr5, ein atypisches Myosin der Klasse IX, ist das erste beschriebene Myosin mit einem Rho inaktivierenden GAP-Modul. Deshalb vermuteten wir, dass der Rho-Antagonist Myr5 während der Shigelleninvasion funktionell von Bedeutung sein könnte. Wir konnten zeigen, dass Myr5 bei der Shigelleninvasion in die zellulären Protrusionen rekrutiert wird. Dort kolokalisierte Myr5 mit F-Aktin und den Rho-Isoformen B und C, nicht jedoch mit RhoA. Die Rekrutierung von Myr5 in die Invasionszone erfolgte unabhängig von der Myosin-Kopf- und der GAP-Funktion. Die Resultate funktioneller quantitativer Untersuchungen zu einer möglichen Rolle während der bakteriellen Invasion sind kompatibel mit der Hypothese, dass sowohl die GAP-Funktion als auch die Myosin-Kopf-Funktion von Myr5 während unterschiedlicher Phasen der Shigelleninvasion von Bedeutung sind. / Shigella causes bacillary dysentery in humans, the only known host. A major feature of its pathogenic potential is the capacity to invade intestinal epithelial cells. Shigella entry into epithelial cells is considered a parasite induced internalization process requiring cytoskeletal rearrangements. Shigella induces a blossom-like membrane structure consisting of membrane sheaths that coalesce above and thus internalize the invasive microorganism. Cytoskeletal remodeling is an essential part of the entry process and is regulated by the small GTPase rho. Temporal and special regulation of rho activity is important to prevent excessive generation of F-actin in depense of the cellular G-actin pool. The class IX myosin myr5 is characterized by a GTPase activating protein (GAP)-module in the tail region. The GAP-module of myr5 is able to inactivate rho. We therefore hypothesized a potential role of myr5 in the regulation of rho activity during Shigella entry into epithelial cells. We could show that myr5 is recruited into bacterial entry spot. Myr5 colocalized with F-actin, rhoB and rhoC but not rhoA. Shigella-induced recruitment of myr5 did not require a functional myosin head or GAP-domain. The results of quantitative functional studies of a potential role of myr5 during bacterial entry suggest a dual role of the myosin head function and the GAP module of myr5 during different steps of the internalization process.

Die meisten Lebewesen nutzen zur Abwehr von pathogenen Mikroorganismen u.a. ein weites Spektrum von antimikrobiellen, oft kationischen Peptiden. Etliche dieser natürlichen und künstlichen Peptide sind in der Lage, Bakterienprodukte wie das Lipopolysaccharid (LPS) Gram-negativer Bakterien zu binden. LPS ist als potenter Stimulator des Immunsystems ein bedeutender Faktor bei der Entstehung von Infektion und Entzündung. LPS-bindende kationische Peptide, zu denen auch von der LPS-Bindungssequenz des Limulus-anti-LPS-Faktors (LALF) abgeleiteten Ringpeptide gehören, wirken synergistisch zu den klassischen Antibiotika, ohne jedoch wie diese zu einer vermehrten LPS-Freisetzung zu führen. LALF-Peptide zeigten in bisher veröffentlichten Versuchen vielversprechende Ergebnisse bei der Bindung von LPS und in murinen Sepsismodellen. In der vorliegenden Arbeit wird in Versuchen mit humanen Monozyten und murinen Makrophagen gezeigt, dass neuartige LALF-Peptide eine durch LPS induzierte Ausschüttung des Zytokins TNF-alpha und des vasoaktiv wirksamen Stickstoffoxids wirkungsvoll unterdrücken können. Ferner wird in LPS-Bindungsassays nachgewiesen, dass dies durch eine Blockierung der LPS-Erkennung durch das LPS bindende Protein (LPB) verursacht wird. Die Verwendung von D-Aminosäuren verspricht dabei in ersten in vitro Experimenten eine Optimierung der Peptid-Eigenschaften. Die Entschlüsselung der Wirkmechanismen dieser neuartigen Peptide könnte Auswirkungen auf die Entwicklung neuer therapeutischer Interventionsstrategien bei Infektion und Sepsis haben. / In host defense against pathogenic microorganisms most organisms employ a broad spectrum of antimicrobial, often cationic peptides. Several of these natural or synthetic peptides are able to bind bacterial products like Lipopolysaccharide (LPS) of Gram-negative bacteria. As a potential stimulator of the immune system LPS is an important pathogenetic factor for infection and inflammation. Cationic LPS-binding peptides like cyclic peptides corresponding to the LPS-binding domain of the Limulus-anti-LPS-factor (LALF) have been shown to act synergistic to classic antibiotics. An advantage of these compounds, however, may be their lack of induction of LPS release. In previous studies LALF-peptides have shown promising results for binding LPS, and in murine sepsis models. Here we show in experiments with human monocytes and murine macrophages that novel LALF-derived peptides are able to effectively block the LPS-induces release of the cytokine TNF-alpha and of the vasoactive nitric oxide. In addition it is shown here by employing an LPS-binding assay that this activity is caused by inhibition of LPS-recognition brought about by the LPS binding protein (LBP). In first in vitro experiments the use of D-amino acids looks promising as they improve peptide quality. To further elucidate the mode of action of these novel peptides could lead to the development of new therapeutic strategies against infection and sepsis.

Die Stressharnkontinenz wird durch die morphofunktionelle Einheit von Urethra, M. levator ani und der Fascia endopelvina gewährleistet, der Begriff "Stressharnkontinenz-Kontrollsystem" verkörpert diese Komplexität. In der vorliegenden Arbeit wurde die Morphologie des Stressharnkontinenz-Kontrollsystems kontinenter Nulliparae kernspintomographisch untersucht, um den Normalbefund zu definieren. Auf Grundlage dieser Untersuchungsergebnisse wurden Frauen mit Stressharninkontinenz (HI) kernspintomographisch untersucht, um eine Nomenklatur der MRT-Pathomorphologie des Stressharnkontinenz-Kontrollsystems bei Stressharninkontinenz vorzuschlagen. Bei den kontinenten Nulliparae (n = 20) zeigte die MRT-Morphometrie von Urethra, M. levator ani und Fascia endopelvina erhebliche anatomische Normvarianten (z.B. Urethraquerschnittsfläche von 1,7 ( 0,4 cm², Ratio 2,4; Volumen des M. levator ani 33,1 ( 8,1 cm³, Ratio 2,5), die in der "Ratio" (Vielfaches des größten zum kleinsten Messwert) zum Ausdruck kommen, eine Definition des "Normalwertes" noch nicht zulassen und ein konstitutionelles Risiko für die Entstehung einer Funktionsstörung des Stressharnkontinenz-Kontrollsystems vermuten lassen. Aufgrund der morphometrischen Normvarianten des Stressharnkontinenz-Kontrollsystems kontinenter Nulliparae wurden bei den Frauen mit HI (n = 54) die MRT-Befunde von Urethra, M. levator ani und Fascia endopelvina nach qualitativen Kriterien bewertet. Eine in der PD-gewichteten Aufnahme erhöhte Signalintensität der quergestreiften Muskulatur wurde pathologisch gewertet und ist durch biochemische bzw. morphologische Veränderungen der Muskulatur (Atrophie, vermehrte Fett-, Wasser- oder Laktateinlagerung) bedingt. Der Vergleich beider Studienkollektive zeigte diese HI-typische Veränderung am M. sphincter urethrae externus und M. levator ani (0 % bei Nulliparae vs. 50 % bzw. 28 % bei Frauen mit HI). Ein dorsaler Substanzverlust des M. sphincter urethrae externus (0 % bei Nulliparae vs. 37 % bei Frauen mit HI) und ein einseitiger Substanzverlust des M. levator ani (0 % bei Nulliparae vs. 30 % bei Frauen mit HI) können ebenfalls als HI-typisch gewertet werden. Der Verlust der symphysenwärts konkaven Konfiguration der vorderen Vaginalwand ist durch einen lateralen Fasziendefekt bedingt und HI-typisch (0 % bei Nulliparae vs. 39 % bei Frauen mit HI). Zentrale Fasziendefekte haben ebenfalls einen Einfluss auf die Pathogenese der HI (0 % bei Nulliparae vs. 39 % bei Frauen mit HI). MRT-Untersuchungen des Stressharnkontinenz-Kontrollsystems tragen zum Verständnis der Anatomie und ihrer Normvarianten bei und können Befunde objektivieren, die den aktuellen Theorien zur Pathogenese der HI gerecht werden. Die MRT hat damit einen hohen Stellenwert in der urogynäkologischen Forschung. / The preservation of urinary continence during stress is ensured by the morphofunctional unit of the urethra, the levator ani muscle, and the endopelvic fascia, whose complex interaction is reflected by the cover term "stress urinary continence control system". The present study investigated the morphology of the stress urinary continence control system in continent nulliparous women by magnetic resonance imaging (MRI) to define its normal anatomy. Based on these results, MRI was performed in women with stress urinary incontinence (UI) to develop a consistent terminology for the pathomorphologic changes of the stress urinary continence control system in stress UI visualized by MRI. In the continent nulliparous women (n = 20) MRI morphometry of the urethra, levator ani muscle, and endopelvic fascia revealed considerable variation in normal anatomy (e.g., cross-sectional area of urethra: 1.7 ( 0.4 cm², ratio 2.4; volume of levator ani muscle: 33.1 ( 8.1 cm³, ratio 2.5) as reflected by the calculated ratios (relation between the maximum and minimum values). These results preclude the definition of normal values and suggest that there is a constitutional risk for the development of dysfunction of the stress urinary continence control system. Because of the morphometric variation found in the normal stress urinary continence control system in continent nulliparious women, the MR images of the urethra, levator ani muscle, and endopelvic fascia acquired in women with UI (n = 54) were analyzed according to qualitative criteria. An increased signal intensity of striated muscle on proton-density-weighted images was classified as abnormal. This increase is caused by biochemical or morphologic changes of the muscle (atrophy, increased deposition of fat, water, or lactate). Comparison of both study groups demonstrated this typical UI-associated change in the external urethral sphincter muscle and the levator ani muscle (0 % in nulliparous women vs. 50 % and 28 %, respectively, in women with UI). A dorsal loss of muscle mass of the external urethral sphincter (0 % in nulliparous women vs. 37 % in UI) and a unilateral loss of mass of the levator ani muslce (0 % in nulliparous women vs. 30 % in women with UI) can likewise be regarded as typical features of UI. Another typical finding in UI is the loss of the hammock configuration of the anterior vaginal wall that is caused by a lateral fascial defect (0 % in nulliparous women vs. 39 % in UI). Defects of the central fascia are likewise involved in the pathogenesis of UI (0 % in nulliparous women vs. 39 % in UI). MRI studies of the stress urinary continence control system help us to gain new insights into its anatomy and normal morphologic variation and yield objective results to corroborate current theories on the pathogenesis of UI. Hence MRI has an important role in urogynecologic research.

In der Folge eines Status epilepticus entwickelt sich häufig eine chronische Epilepsie. In der vorliegenden Dissertation wurde die Fragestellung bearbeitet, ob ein Inhibitionsverlust im Gyrus dentatus Grundlage der Epileptogenese nach Status epilepticus ist. Ein selbst-erhaltender Status epilepticus (SSSE) wurde an erwachsenen Ratten durch elektrische Stimulation ausgelöst. Das Auftreten spontaner epileptischer Anfälle wurde im Verlauf von acht Wochen nach Status epilepticus zu drei Zeitpunkten (1, 4 und 8 Wochen) mittels Videoüberwachung erfasst. Zu denselben Zeitpunkten und vor Status epilepticus wurden elektrophysiologische Messungen im Gyrus dentatus durchgeführt. Die Aktivität der Prinzipalzellen des Gyrus dentatus unterliegt unter physiologischen Bedingungen einer ausgeprägten inhibitorischen Kontrolle. Durch Analyse von Doppelreizantworten wurden Veränderungen der Inhibition in dieser für die Epileptogenese relevanten Hirnstruktur beurteilt. Im Verlauf von acht Wochen nach SSSE entwickelte sich bei einem Großteil der Versuchstiere eine chronische Epilepsie. Zum spätesten Beobachtungszeitpunkt traten rekurrente spontane epileptische Anfälle bei 80 Prozent der Tiere auf. Die Inhibition im Gyrus dentatus war eine Woche nach Status epilepticus signifikant reduziert. Vier und acht Wochen nach SSSE zeigte sich eine zunehmende Wiederannäherung an die vor dem Status epilepticus erhobenen Messwerte, so dass von einem transienten Inhibitionsverlust im Gyrus dentatus nach Status epilepticus gesprochen werden kann. Zusammenfassend konnte in der Dissertation gezeigt werden, dass sich in der Folge eines Status epilepticus bei der Mehrzahl der Tiere eine chronische Epilepsie entwickelt. Der Inhibitionsverlust im Gyrus dentatus war zu einem Zeitpunkt am größten, da noch keine spontanen epileptischen Anfälle auftraten. Als sich bei den meisten Tieren eine chronische Epilepsie entwickelt hatte, war die Inhibition komplett wiederhergestellt. Daher ist ein Inhibitionsverlust im Gyrus dentatus nach einem Status epilepticus nicht der führende pathophysiologische Mechanismus für die Entwicklung einer chronischen Epilepsie. / Development of chronic epilepsy as a consequence of status epilepticus is a frequent clinical observation. The aim of this work was to test the hypothesis that epileptogenesis after status epilepticus depends on a loss of inhibitory function in the dentate gyrus. A self-sustaining status epilepticus (SSSE) was induced in rats by continuous electrical stimulation of the perforant path. The occurrence of spontaneous epileptic seizures was assessed by video monitoring 1, 4 and 8 weeks after SSSE. At the same time points and directly before SSSE, inhibition in the dentate gyrus was measured using a paired pulse paradigm. In this region, excitability of principal cells is under physiological conditions effectively controlled by the activity of inhibitory interneurons. In addition, the dentate gyrus is relevant for the process of epileptogenesis due to anatomical properties. In the time course after SSSE, the fraction of animals showing spontaneous epileptic seizures increased steadily reaching 80 % after eight weeks. One week after SSSE, inhibition in the dentate gyrus was significantly reduced. This loss proved to be transient, as inhibition recovered after 4 weeks and reached pre-status values after 8 weeks. In conclusion, the majority of animals developed chronic epilepsy as a consequence of status epilepticus. Loss of inhibition in the dentate gyrus was maximal while spontaneous seizures had not yet developed. Inhibition was normalized when most animals had become epileptic. Thus, loss of inhibition in the dentate gyrus following status epilepticus is not a decisive mechanism in the emergence of spontaneous seizures.

Die Arbeit untersucht die Akute Phase Reaktion nach erfolgreicher kardiopulmonaler Reanimation. Untersuchungsgegenstand war der Verlauf unterschiedlicher Akute Phase Proteine und Procalcitonin in Abhängigkeit von verschiedenen klinischen Parametern. Ebenso wurde das Verhalten der Akute Phase Proteine bei gesunden Probanden unter kontrollierter systemischer Hypoxie untersucht, da die Hypoxie als Auslöser der Akute Phase Reaktion diskutiert wird. Außerdem wurde betrachtet, welche Parameter sich für die Diagnose einer nach der Reanimation auftretenden Ventilator-assoziierten Pneumonie eignen. In die Untersuchung wurden 33 reanimierte Patienten eingeschlossen sowie 7 Probanden, die sich freiwillig einer hypobaren Hypoxie ausgesetzt hatten. Die wesentlichen Resultate sind: 1) Die untersuchten Akute Phase Proteine verhalten sich nach kardiopulmonaler Reanimation wie dies in der Literatur für andere Genesen beschrieben ist. Das Procalcitonin zeigt gewisse Charakteristika eines Akute Phase Proteins, wobei die Daten eine abschließende Beurteilung nicht ermöglichen. 2) Die Konzentrationsänderungen der Akute Phase Proteine treten bei allen Patienten unabhängig von ihrem Krankheitsverlauf auf. Schlussfolgerung ist, dass nach kardiopulmonaler Reanimation unabhängig von der Ursache regelmäßig eine Akute Phase Reaktion auftritt. 3) Die Probanden zeigten unter hypobarer Hypoxie keine Akute Phase Reaktion, obwohl ein Anstieg der Erythropoetin-Konzentration eine Aktivierung der sauerstoffabhängigen Genexpression anzeigte. Der Sauerstoffmangel reicht deshalb zur Erklärung der Akute Phase Reaktion als alleinige Ursache nicht aus. 4) Der Verlauf der untersuchten Akute Phase Parameter bleibt von einer Ventilator-assoziierten Pneumonie als Komplikation unbeeinflusst. Das Procalcitonin zeigte hingegen bereits frühzeitig im Verlauf deutliche Unterschiede zwischen Patienten mit und ohne Ventilator-assoziierte Pneumonie. / The thesis paper studies the acute phase reaction after successful cardiopulmonary resuscitation. Focus were different acute phase proteins as well as procalcitonin in relation to different clinical parameters. Also the course of these acute phase proteins during hypobaric hypoxia in volunteers was studied, because hyoxia is being discussed as a potential cause of the acute phase reaction. Additionally it was determined, which parameters are suitable to diagnose a ventilator-associated pneumonia after resuscitation. The study included 33 resuscitated patients as well as 7 volunteers undergoing a hypobaric hypoxia. The main results are: 1) The acute phase proteins studied behave after cardiopulmonary resuscitation as described in the literature for other causes. Procalcitonin show certain aspects of an acute phase protein, however, the data do not permit a final judgment. 2) The changes in concentration of the acute phase proteins take place in all patients regardless of the case history. It can be concluded that after cardiopulmonary resuscitation always an acute phase reaction occurs. 3) The volunteers undergoing hypobaric hypoxia showed no acute phase reaction, even though a rise in erythropoetin concentration indicated an oxygen-dependent gene expression. The hypoxia alone therefore is not a sufficient explanation for the development of the acute phase reaction. 4) The course of the acute phase proteins studied is not influenced by a ventilator-associated pneumonia as complication. The course of procalcitonin, however, shows early significant differences between patients with and without ventilator-associated pneumonia.

Die Dysregulation von Zelltod-Signalwegen und die Inaktivierung von Apoptose-Signalwegen ist ein häufiges Ereignis bei der Entstehung maligner Tumore. Ziel dieser dieser Studie war es den prognostischen Wert der Bax- und p16INK4a-Proteinexpression in Korrelation zum Mutationsstatus des p53-Gens bei Patienten in einem Kollektiv von primären kolorektalen Adenokarzinom zu analysieren. Methoden: Retrospektiv wurden 116 Patienten mit einem kolorektalen Karzinom (CRC) im Stadium III und IV nach operativer Therapie und follow-up über 5 Jahre untersucht (UICC Stadium III: 59 Patienten; UICC Stadium IV: 57 Patienten). Die Profile der Bax- und p16INK4a-Proteinexpression wurden mittels Immunhistochemie, die p53-Mutationen (Exon 5 - 8) mittels Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP)-PCR untersucht. Die gewonnenen Daten wurden mit klinisch-pathologischen Daten korreliert und statistisch analysiert Ergebnisse: Das mediane Gesamtüberleben betrug 17 Monate. Patienten im Stadium III lebten länger als solche im Stadium IV: 69 vs. acht Monate (p / Deregulation of cell death and cell cycle regulation pathways is a frequent event in cancer. Therefore, the purpose of this study was to analyse the prognostic value of Bax and p16INK4a protein expression in correlation to the mutational status of the p53 tumorsuppressor gene in primary colorectal adenocarcinoma. Methods: 116 patients with colorectal adenocarcinoma (CRC) undergoing surgery with curative intention a followed-up for a minimum of five years were analyzed (UICC Stage III: 59 patients, UICC Stage IV: 57 patients). Protein expression profiles of Bax and p16INK4a were analysed by immunhistochemistry, the p53-mutations (exon 5 - 8) by Single-Strand-Conformation-Polymorphism (SSCP)-PCR. Data was correltated with clinical and pathological parameters and analysed statistically. Results: Overall median survival was 17 months. As expected, patients with stage III malignancies survived longer than stage IV patients: 69 months vs. 8 months (p

Die Rationale für immuntherapeutische Ansätze zur Behandlung maligner Neoplasien geht davon aus, daß Tumore über spezifische Tumorantigene verfügen. Dendritische Zellen als die wichtigsten antigenpräsentierenden Zellen sind in der Lage, Tumorantigene naiven T-Zellen zu präsentieren und spezifische zytotoxische T-Zellen zu stimulieren. In der vorliegenden Arbeit wurden dendritische Zellen durch Stimulation mit Interleukin-4 (IL-4) und Granulozyten/ Makrophagen Koloniestimulierender Faktor (GM-CSF) aus peripheren mononukleären Blutzellen gesunder Spender und an Tumoren des gastroenteropankreatischen Systems erkrankter Patienten generiert. Mit den dendritischen Zellen cokultivierte immunologische Effektorzellen (Zytokin- induzierte Killerzellen, CIK-Zellen) wurden im Zytotoxizitätstest gegen kolorektale und pankreatische Karzinomzellen eingesetzt. CIK-Zellen sind zytototoxische Zellen, die durch Stimulation mit Zytokinen aus peripheren Blutlymphozyten erzeugt werden. Durch die Cokultivierung der Effektorzellen mit dendritischen Zellen konnte eine signifikante Steigerung der unspezifischen zytotoxischen Wirkung der CIK-Zellen bewirkt werden. Zur Steigerung der spezifischen Zytotoxizität wurden dendritische Zellen mit dem Gesamtprotein der tumor- assoziierten Antigene cancer associated antigen (CA 19-9) und carcinoembryonic antigen (CEA) gepulst. Effektorzellen zeigten nach der Cokultur mit gepulsten dendritischen Zellen zytotoxische Wirkung gegen Targetzellen, die das zum Pulsen verwendete Tumorantigen auf der Zelloberfläche exprimieren. Die Antigenspezifität der zytotoxischen Wirkung konnte durch eine signifikant verminderte Zellyse nach Blockade des Tumorantigens auf den Targetzellen belegt werden. Erstmals beschrieben ist hier das Pulsen dendritischer Zellen mit sowohl autologen als auch allogenen Seren von Patienten mit erhöhten Tumormarkerspiegeln. Eine Kultivierung dendritischer Zellen in tumormarkerhaltigem Serum bewirkte dosisabhängig eine verstärkte zytotoxische Wirkung cokultivierter Effektorzellen gegen Tumorzellen. Die verstärkte Zellyse zeigte sich unabhängig vom allogenem oder autologem Charakter des Serums. Der immunstimulierende Effekt des Patientenserums konnte durch eine vorhergehende Hitzeinaktivierung des Serums neutralisiert werden. Die höchsten Zellysen wurden durch eine Kultivierung dendritischer Zellen in tumormarkerhaltigem Serum und zusätzlichem Pulsen mit exogenem Tumorantigen erreicht. Untersuchungen an komplett autologen Systemen reproduzierten die an Zellkulturen erhobenen Befunde. Hierfür wurden erfolgreich Primärkulturen kolorektaler Tumore etabliert.Aus dem Blut von Tumorpatienten wurden dendritische Zellen generiert, die mit autologem Serum kultiviert wurden. Die cokultivierten autologen Effektorzellen erwiesen sich im Zytotoxizitätstest gegen autologe Tumorzellen als zytotoxisch. Die Cokultivierung der Effektorzellen mit den dendritischen Zellen bewirkte bei beiden Zellpopulationen Veränderungen. Dendritische Zellen zeigten nach der Cokultur eine verstärkte Expression antigenpräsentierender und costimulatorischer Moleküle. Bei den CIK-Zellen kam es zu einem Anstieg der Proliferationsrate. Bei Untersuchungen zur Antigenspezifität von T-Zellrezeptoren konnte vermehrt antigenspezifischer T-Zellrezeptor nachgewiesen werden. Des weiteren stieg das Verhältnis zwischen zytotoxischen T-Zellen und T-Helferzellen zugunsten der zytotoxischen T-Zellen. In ELISpot-Untersuchungen wurde eine Zunahme Interferon-gamma sezernierender CIK-Zellen nachgewiesen. Dendritische Zellen ließen sich erfolgreich mit inaktiviertem Adenovirus, an das kovalent Poly-L-Lysin gekoppelt ist, transfizieren. Die für den adenoviralen Gentransfer benötigten Oberflächenstrukturen konnten auf dendritischen Zellen nachgewiesen werden. Zur Verbesserung der Zytotoxizität wurden dendritische Zellen erfolgreich mit dem Gen für den Transaktivator CIITA transfiziert. CIITA- transfizierte dendritische Zellen exprimierten vermehrt MHC Klasse II-Moleküle. Die transduzierten dendritischen Zellen induzierten bei cokultivierten Effektorzellen eine erhöhte unspezifische Zytotoxizität. Mit Tumorantigen gepulste dendritische Zellen können bei der Entwicklung immuntherapeutischer Protokolle bei malignen Neoplasien von Bedeutung sein. / The immunotherapeutic approach against malignant neoplasias appreciates that tumours encode tumour rejection antigens, that enable them to induce protective immunity. Dendritic cells are major antigen-presenting cells and are able to present tumour antigens to naive T-cells and stimulate cytotoxic T-cells in a specific manner. In the present graduation-manuscript dendritic cells were generated in the presence of Interleukin-4 and granulocyte/macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) from peripheral mononuclear blood cells of healthy donors and tumour-patients. Immunological effector cells termed cytokine-induced killer cells (CIK cells) were co-cultured with dendritic cells and tested for their cytotoxic capacity against colorectal and pancreatic cancer cell-lines in a LDH-release assay. CIK cells are cytotoxic lymphocytes generated by incubation of peripheral blood lymphocytes with different cytokines. Co-culture of effector cells with dendritic cells led to a significant increase of the cytotoxic effect of CIK cells. For a further increase of specific cytotoxicity dendritic cells were pulsed with total protein of the tumour-associated antigens cancer associated antigen CA 19-9 and carcinoembryonic antigen (CEA). Co-cultured effector cells showed an increase in cytotoxicity against tumour-antigen expressing target cells, after co-culture with pulsed dendritic cells. The specificity of the cytotoxic effect could be shown by blocking the tumour-antigens with a monoclonal antibody. Autologous and allogenec untreated serums from patients with elevated tumour-marker levels were also used for pulsing of dendritic cells. Similar to the results when using total protein for pulsing, a cultivation in serum of patients with elevated tumour marker levels caused an intensified cytotoxic effect of effector cells against tumour cells in a dose-dependent manner. The intensified cytotoxicity was seen independent of the allogenec or autologous character of the serum. The immuno-stimulating effect of the patient serum could be neutralized by preceding heat inactivating. The highest cytotoxicity was achieved by a cultivation of dendritic cells in serum from patients with elevated tumour marker levels and additional pulsing with exogenous tumour antigen. Experiments with completely autologous systems reproduced the results made with cell-lines. Primary cultures of colorectal tumours were established. Dendritic cells were generated from the blood of tumour patients and were cultivated in autologous serum. Co-cultured autologous effector cells showed cytotoxicity when used against autologous tumour cells. Co-culturing of effector cells with dendritic cells caused modifications at both cell populations. Dendritic cells showed an increase expression of antigen-presenting and co-stimulatory molecules. CIK cells showed a higher proliferation-rate when co-cultured. They express more antigen-specific T-cell receptor, and the cytotoxic T-cells to T-helper cells ratio increased. ELISpot-assays showed an increase of interferon gamma producing cells. Dendritic cells were successfully transduced by using an inactivated adenovirus, which covalently binds poly-L-lysine. Dendritic cells express the molecules that enables adenoviral gene delivery on their surface. For the improvement of cytotoxicity dendritic cells were transduced with the gene encoding for the transactivator CIITA. CIITA transduced dendritic cells increases expression of MHC class II molecules. Cytotoxicity experiments with transduced dendritic cells resulted in an increased induction of non-specific cytolysis from co-cultured effector cells. DC pulsed with tumour-antigens may have a major impact on immunotherapeutic protocols for cancer patients.

Ausgehend von einer unspezifischen bakteriellen Infektion kann es während der Schwangerschaft zu einer Infektion der Fruchthöhle kommen. Das volle Bild dieser Art von Infektionen wird Amnioninfektionssyndrom genannt. Die Infektion der Fruchthöhle bedroht Mutter und Kind und die sofortige Entbindung würde ein rasches Abklingen der Infektion des Uterus herbeiführen. Auf der anderen Seite würde häufig eine Entbindung zu einem Zeitpunkt induziert, da das Kind zusätzlich zur Infektion durch die Unreife bedroht ist. Aus der Diagnostik heraus wird die Entscheidung über konservatives oder progressives Vorgehen getroffen. Es stellen sich folgende Fragen: 1. Sind die präpartal erhobenen klinischen Zeichen eines Amnioninfektionssyndromes relevant in der Diagnostik einer konnatal erworbenen neonatalen Infektion? 2. Sind die immunkompetenten Zellen des Neugeborenen in der Lage, inflammatorische Zytokine zu produzieren? 3. Gibt es lösliche Faktoren im Nabelschnurblut, die die Diagnostik einer Infektion des Neugeborenen entscheidend verbessern und die einen Zusammenhang mit einer Infektion der Plazenta aufweisen? 4. Besteht ein Zusammenhang zwischen der präpartalen klinischen Symptomatik eines Amnioninfektionssyndromes und den infektionsabhängigen löslichen Parametern im Nabelblut? Es wurden zwei prospektive Studien zur Beantwortung der Fragestellung durchgeführt. Im Rahmen der ersten Studie wurden 511 Fälle analysiert. Es fand eine Evaluierung der präpartalen klinischen Parameter bezogen auf das Ereignis neonatale Infektion und histologisch gesicherte Infektion der Plazenta statt. Die Konzentrationen der Zytokine Interleukin-6, Interleukin-8, Tumornekrosefaktor-a, G-CSF und der laborchemischen Parameter C-reaktives Protein und Procalcitonin wurde im Nabelschnurblut direkt nach der Geburt bestimmt. Diese Konzentrationen wurden in Bezug gesetzt zu klinischen Anzeichen einer Infektion des Neugeborenen und histologischen Zeichen einer Infektion der Plazenta. Außerdem wurden sie in Bezug gesetzt zu den präpartalen Symptomen eines Amnioninfektionssyndromes. In einer zweiten Studie wurden 42 Fälle analysiert. Mittels Durchflußzytometrie wurden Zellen aus Vollblut isoliert. Isoliert wurde die T-Zellpopulation CD 4 und CD 8 der Lymphozyten untersucht Eine intrazytoplasmatische Zytokinbestimmung nach Stimulation mit Ionomycin und Phorbol-12,13-Dibutyrat unter Verwendung von Monensin wurde durchgeführt. Bestimmt wurde die intrazytoplasmatische Zytokinfreisetzung der Zytokine Interleukin-6 und Interleukin-8. Die präpartalen Symptome mütterliche Temperaturerhöhung, mütterliche CRP-Erhöhung und fetale Tachykardie haben nur eine begrenzte Aussagekraft im Hinblick auf das Ereignis Neonatale Infektion. Während für die präpartal festgestellte fetale Tachykardie und die mütterliche Temperaturerhöhung eine Sensitivität für die "Neonatale Infektion" von 28,6 % bestimmt wurde, liegt dieser Wert für die präpartale mütterliche CRP-Erhöhung bei 45,5% deutlich höher. Die aus dem Nabelblut isolierten Lymphozyten sind in der Lage, auf eine unspezifische Stimulation hin, Interleukin-8 und Interleukin-6 zu produzieren. Signifikant höher liegt die Sekretion an Interleukin-6 dann, wenn die Kinder mit dem Verdacht auf eine peripartale Infektion geboren wurden oder wenn infektionsrelevante Ereignisse vor der Geburt aufgetreten waren. Von den im Nabelschnurblut untersuchten löslichen Parametern fällt auf, daß Procalcitonin mit einer Sensitivität von 93,3% und einer Spezifität von 73,1% ein sehr zuverlässiger Parameter zur Diagnostik einer neonatalen Infektion darstellt. Mit einer Sensitivität von 58,3% und einer Spezifität von 90,4% hebt sich auch der hochsensitive Nachweis des CRP im Nabelblut noch deutlich von den herkömmlich verwendeten Parametern ab. Nur eingeschränkte Aussagekraft auf das Ereignis "Neonatale Infektion" hat die Bestimmung des Interleukin-6. Die kombinierte Betrachtung der präpartal erhobenen klinischen Parameter fetale Tachykardie, mütterliche Temperaturerhöhung und mütterliche CRP-Erhöhung verbessert die vorgeburtliche Diagnostik einer intrauterin bestehenden Infektion deutlich. Der Nachweis der intrazellulären Interleukin-6- und Interleukin-8-Produktion durch neonatale Lymphozyten zeigt die Fähigkeit der zellvermittelten Immunität des Neugeborenen schon vor der Geburt auf bakterielle Infektionen reagieren zu können. Die differenzierte Reaktionsfähigkeit zeigt sich in der gesteigerten Interleukin-6-Syntheseleistung in all den Fällen, die in die "Infektionsgruppe" eingeschlossen waren. Von den löslichen Infektparametern im Nabelblut sticht das Procalcitonin als sehr zuverlässiger Marker sowohl einer Infektion des Neugeborenen als auch der histologisch gesicherten Infektion der Plazenta hervor. Auch Interleukin-6 sollte bestimmt werden. Die nachgewiesene Möglichkeit des Neugeborenen, inflammatorische Zytokine in hohen Konzentrationen als Antwort auf eine bakterielle Invasion produzieren zu können, scheint auch die Gefahr in sich zu bergen, durch eben dieses Interleukin-6 eine cerebral schädigende Reaktion zu erfahren. Zur Abschätzung dieses Risikos ist eine Bestimmung des Interleukin-6 im Nabelschnurblut empfehlenswert. / Starting with a nonspecific bacterial infection, during the pregnancy an infection of the amnion can occur. The full expression of this kind of infections is called chorioamnionitis. The infection of the amnion endangers mother and child, and the immediate delivery would produce a quick subsidence of the uterine infection. On the other hand a delivery would frequently be induced at a time when in addition to the infection the child is endangered by prematurity. Out of the diagnostic investigation the decision on conservative or progressive procedure is made. Following questions arise: 1. Are the prepartally ascertained clinical signs of a chorioamnionitis relevant in the diagnosis of a connatally acquired neonatal infection? 2. Are the immunocompetent cells of the neonate able to produce inflammatory cytokines? 3. Are there soluble factors in the cord blood which decisively improve the diagnosis of an infection of the neonate and show a correlation with an infection of the placenta? 4. Is there a correlation between the prepartal clinical symptoms of an amniotic infection syndrome and the infection-dependent soluble parameters in cord blood? Two prospective studies were carried out in order to answer the question. Within the scope of the first study 511 cases were analyzed. An evaluation of the prepartal clinical parameters related to the occurence neonatal infection and histologically established infection of the placenta took place. The concentrations of the cytokines interleukin-6, interleukin-8, tumor necrosis factor-a, G-CSF and the lab-chemical parameters C-reactive protein and procalcitonin were measured in the cord blood directly after birth. These concentrations were related to clinical signs of an infection of the neonate and histological signs of an amniotic infection. In addition they were related to the prepartal symptoms of an amniotic infection syndrome. In a second study 42 cases were analyzed. Using flow cytometry cells were isolated from whole blood. The T cell population CD 4 and CD 8 of lymphocytes was isolatedly examined. An intracytoplasmic cytokine analysis after stimulation with Ionomycin and phorbol-12,13-dibutyrate using Monensin was performed. The intracytoplasmic cytokine release of interleukin-6 and interleukin-8 was determined. The prepartal symptoms maternal elevation of temperature, maternal CRP increase and fetal tachycardia are only poor prognostic predictors with regard to the occurence neonatal infection. While for the prepartally ascertained fetal tachycardia and the maternal rise of temperature a sensitivity for the "neonatal infection" of 28.6% was determined, for the prepartal maternal CRP increase this value is clearly higher with 45.5%. The lymphocytes isolated from cord blood are able to produce interleukin-8 and interleukin-6 on account of a nonspecific stimulation. The interleukin-6 secretion is significantly higher if the children were born with the suspicion of a peripartal infection or if infection-relevant occurences were arisen before birth. Regarding the soluble parameters examined from the cord blood, it is remarkable that with a sensitivity of 93.3% and a specificity of 73.1% procalcitonin shows to be a very reliable parameter for diagnosis of a neonatal infection. With a sensitivity of 58.3% and a specificity of 90.4% also the high sensitive detection of CRP in cord blood stands out clearly from the conventionally used parameters. The determination of interleukin-6 has only a limited meaningfulness with regard to the occurence "neonatal infection". The combined contemplation of the prepartally measured clinical parameters fetal tachycardia, maternal rise of temperature and maternal CRP elevation clearly improves the antenatal diagnosis of an intrauterine infection. The detection of intracellular interleukin-6 and interleukin-8 production through neonatal lymphocytes shows the capability of cell-mediated immunity of neonate to react to a bacterial infection before birth. The differentiated reactivity is shown in the increased interleukin-6 synthesis in all those cases which were included in the "infection group". Among the soluble infection parameters in cord blood the procalcitonin stands out as a very reliable marker of neonatal infection as well as the histologically established infection of the placenta. Interleukin-6 should also be determined. The proved possibility of the neonate to produce inflammatory cytokines in high concentrations as an answer to a bacterial invasion seems also to involve the risk to experience a cerebrally damaging reaction through exactly this interleukin-6. For estimation of this risk, an interleukin-6 analysis in cord blood is recommendable.

Eine Analyse der wirkenden Belastungen im intakten als auch frakturierten Knochen liegt bisher nicht vor. Hypothese der vorliegenden Arbeit ist, dass ein besseres Verständnis der mechanischen Beanspruchungen die Basis für eine Optimierung der Rahmenbedingungen der Frakturheilung bildet. Ziel dieser Arbeit ist es, am Beispiel der unteren Extremität die wirkenden Belastungen zu analysieren und für exemplarische Situationen im Hinblick auf ihre Bedeutung für die Frakturheilung zu diskutieren. Ausgehend von ersten validierten Analysen der muskuloskelettalen Belastungen wird auf die Bedeutung der Weichteile für die Beanspruchung langer Röhrenknochen eingegangen. Dem schliessen sich Betrachtungen über die mechanischen Rahmenbedingungen bei der Versorgung von Tibiafrakturen mit unterschiedlichen Osteosyntheseformen an: Unaufgebohrte Marknagelung, interne Fixation und externe Fixation mit Ringfixateur. Abschliessend werden am Beispiel von Messungen der Frakturspaltbewegungen weitere Einflüsse auf die mechanischen Rahmenbedingungen der Heilung diskutiert. Durch die vorliegende Arbeit wird die Bedeutung der ausgeglichenen Muskelaktivität für die mechanischen Rahmenbedingungen der Frakturheilung illustriert. Es werden Grenzindikationen für den Einsatz einzelner Implantate aufgezeigt und mögliche Konzepte für die Nachbehandlung diskutiert. Langfristig werden die aufgezeigten Verfahren in präoperativen Planungen zum Einsatz kommen und beanspruchungsgerechte Osteosynthesen, Umstellungen und Korrekturen des muskuloskelettalen Systems ermöglichen. / Analyses of the loading conditions in intact and fractured long bones are so far not available. The hypothesis of the current work was that a better understanding of the mechanical loading may form the basis for an optimization of the boundary conditions during fracture healing. The goal was to determine the loading conditions in the lower limb and to discuss its significance for fracture healing. Based on a validated analysis of musculo-skeletal loading, the significance of the soft tissues for the mechanical loading conditions is discussed. The mechanical conditions are evaluated in fracture treatment by means of unreamed nailing, internal fixation and external fixation with a ring fixator. Finally, influences on the mechanical boundary conditions during healing are discussed using the example of fracture gap movements in patients treated by the Ilizarov method. The presented work illustrates the importance of the coordinated activity of muscles that leads to a balanced loading condition at the fracture during healing. Critical conditions for the bone as well as for the different implant types are described and possible concepts for a post operative treatment are discussed. In the long term, the demonstrated methods will allow preoperative planing of correction osteotomies and fracture treatment for individual patients and specific clinical situations.

Bei der adaptiven Immunantwort wird ein breites Repertoire an Effektor-T-Zellen gebildet, das sich durch spezifische und vielfältige funktionelle Fähigkeiten auszeichnet. Neben der Aktivierung der Immunantwort werden Mechanismen benötigt, die Immunantworten regulieren und abschalten können, um unerwünschte Immunreaktion zu verhindern. Die Arbeit befasst sich mit der Rolle von CD152 (CTLA-4), einem Homolog zu CD28, bei der Begrenzung von T-Zellantworten. Die Inhibition der Proliferationsbegrenzung der T-Zellen durch CD152 war ursprünglich auf eine späte Abschaltung der T-Zellproliferation zurückgeführt worden. Wir konnten zeigen, dass CD152 bereits die T-Zellaktivierung abschalten kann und somit die Aktivierungsschwelle der T-Zelle heraufsetzt. Wir konnten auch zeigen, dass CD152 die frühe T-Zellproliferation auf zwei Ebenen inhibiert: Durch die Transkriptionsinitiierung des autologen, Proliferation-induzierenden Zytokins IL-2 und durch die Expression von G1-Kinasen, die für das voranschreiten des Zellzyklus unerläßlich sind. Bisher war es nicht möglich, individuelle, CD152-oberflächen-exprimierende T-Zellen zu detektieren. Um die Expression von CD152 auf der Oberfläche von T-Zellen zu analysieren, haben wir eine sensitive Färbemethode für Oberflächen-exprimiertes CD152 etabliert. Wir konnten damit zeigen, dass während einer antigen-spezifischen Stimulation Zellmembran-gebundenes CD152 lediglich auf einer Subpopulation von aktivierten Zellen (CD152+ T-Zellen) exprimiert wird. Isolierte, aktivierte CD152+ T-Zellen waren im Gegensatz zu aktivierten CD152- T-Zellen bei Restimulation in ihrer Proliferation inhibiert. Dies zeigt auch, dass CD152 in der Lage ist, bereits aktivierte T-Zellen zu inhibieren. Die heterogene Expression von CD152 auf der Oberfläche lässt vermuten, dass die CD152 exprimierenden Zellen, wenn sie ein CD152-Signal bekommen, eine andere Zelldifferenzierung einschlagen als Zellen ohne CD152. Wiederholte oder chronische Aktivierung von Th-Zellen führt zu einer Form von Apoptose, dem Aktivierungs-induzierter Zelltod, gegen den Th2-Zellen resistent sind. Aktivierte Th2-Zellen exprimieren, im Gegensatz zu Th1-Zellen, häufiger CD152 auf ihrer Oberfläche. Wir konnten zeigen, dass CD152-Kreuzvernetzung von aktivierten T-Zellen direkt Resistenz gegen Apoptose vermittelt. Dies geschieht, indem ein Signaltransduktionsmolekül, die PI3´Kinase, aktiviert wird. Dies führt zur Inaktivierung von Apoptose-unterstützenden Molekülen (Phosphorylierung von FKHRL1 und Herunterregulation von FasL) und zur Induktion des Apoptose-verhindernden Moleküls Bcl-2. Vermeidung von Apoptose ist eine zentrale Voraussetzung zur Induktion von Gedächtniszellen. CD152 exprimierende Zellen wären somit gute Kandidaten, um zu Gedächtniszellen zu differenzieren. Um die Rolle von CD152 bei der späten T-Zelldifferenzierung in vivo untersuchen zu können, wurde das CD152 Gen konditionell in der Maus mutagenisiert. / During adaptive immune responses a broad repertoire of effector T-cells is generated, characterized by diverse functional capabilities. Besides activation of the immune response other mechanisms are needed in order to regulate and terminate responses, thus preventing unwanted immune reactions. Here I focus on the role of CD152 (CTLA-4), a homologue of CD28, in the limitation of T-cell responses. Inhibition of T-cell-proliferation by CD152 was originally attributed to a late regulation of the T-cell proliferation. We now show that CD152 is already able to prevent the activation of T-cells and to set the threshold for their activation. We also show that CD152 inhibits T-cell activation in two ways: It inhibits the induction of the growth-factor IL-2 and it inhibits the expression of G1-kinases mandatory for the progression of the cell cycle. Until now, it has not been possible to detect individual T-cells expressing CD152 at their surface. To analyze the expression of CD152 at the surface of individual cells, we developed a sensitive staining method. Using this technique we could show that antigen-specific stimulation of T-cells leads to the expression of surface-bound CD152 only on a fraction of the activated T-cells. Isolated, activated CD152+ T-cells were inhibited in their proliferation whereas CD152- T cells were not. This also shows that CD152 is indeed able to inhibit already activated T-cells. The heterogenous expression of CD152 at the cell surface of already activated T-cells also suggests that CD152+ T-cells will differentiate differently compared to CD152-T-cells. Repeated or chronic activation of Th-cells leads to one form of apoptosis, activation-induced cell death (AICD), against which Th2-cells are resistant. Activated Th2-cells express surface CD152 at higher frequencies than Th1-cells. We show here, that CD152-crosslinking of activated T-cells directly induces resistance against AICD by a mechanism requiring PI3´kinase. This leads to the inactivation of pro-apoptotic molecules (phosphorylation of FKHRL1 and downregulation of FasL). It also leads to the induction of the survival molecule Bcl-2. Prevention of apoptosis is a central prerequisite for the generation of memory cells. Therefore, surface CD152+ T-cells might be good candidates to differentiate into memory cells. To investigate the role of CD152 during the differentiation of T-cells in vivo, the CD152 gene was conditional mutagenese of the CD152 gene was generated.