Die physische Nähe zwischen Genpromotoren und regulatorischen Elementen (Enhancer) spielt eine entscheidene Rolle in der Genexpression, um präzise räumliche und zeitliche Genexpressionmuster während der Embryogenese zu erzeugen. Abhängig von der Aktivität der Zielgene lassen sich zwei Typen von Interaktionen unterscheiden. Zum einen führen dynamische Enhancer-Promoter Interaktionen unmittelbar zur Genexpression, wohingegen in anderen Fällen stabile Interaktionen bereits vor der Genexpression existieren. In der vorliegenden Studie wurde die Rolle der stabilen Interaktion zwischen dem Shh Gen und dem Extremitätenenhancer, der ZRS, während der Embryonalentwicklung in der Maus untersucht. Der Verlust der konstitutiven Transkription, die den ZRS Enhancer abdeckt, führte zu einer Verschiebung innerhalb der Shh-ZRS Kontakte und einer moderaten Reduzierung der Shh Genexpression. Im Gegensatz dazu führte die Mutation von CTCF Bindungsstellen, die den ZRS Enhancer umgeben, zu einem Verlust der stabilen Shh-ZRS Interaktion und einem 50%igen Rückgang in der Shh Genexpression. Dieser Expressionsverlust hatte jedoch keine phänotypischen Auswirkungen in den Deletionsmutanten, was darauf hindeutet, dass die restliche Genaktivität und Enhancer-Promotor-Interaktion über einen zusätzlichen, CTCF-unabhängigen Mechanismus erfolgt. Erst die kombinierte Deletion von CTCF-Bindungsmotiven und einem hypomorphen ZRS-Allel führte zu einem fast vollständigen Expressionsverlust von Shh und damit zu einem schweren Funktionsverlust und Gliedmaßen-Agenesie. Die hier präsentierten Ergebnisse zeigen, dass die stabile Chromatinstruktur am Shh Locus von mehreren Komponenten getragen wird und die physicalische Interaktion zwischen Enhancern und Promotern für eine robuste Transkription während der Embryonalentwicklung benötigt werden. / Long-range gene regulation involves physical proximity between enhancers and promoters to generate precise patterns of gene expression in space and time. However, in some cases proximity coincides with gene activation, whereas in others preformed topologies already exist before activation. In this study, we investigate the preformed configuration underlying the regulation of the Shh gene by its unique limb enhancer, the ZRS, in vivo during mouse development. Abrogating the constitutive transcription covering the ZRS region led to a shift within the Shh-ZRS contacts and a moderate reduction in Shh transcription. Deletion of the CTCF binding sites around the ZRS resulted in a loss of the Shh-ZRS preformed interaction and a 50% decrease in Shh expression but no phenotype, suggesting an additional, CTCF-independent mechanism of promoter-enhancer communication. This residual activity, however, was diminished by combining the loss of CTCF binding with a hypomorphic ZRS allele resulting in severe Shh loss-of-function and digit agenesis. Our results indicate that the preformed chromatin structure of the Shh locus is sustained by multiple components and acts to reinforce enhancer-promoter communication for robust transcription.

Die 3D Struktur von Chromosomen im Zellkern reguliert verschiedene Funktionen in der Zelle und Fehler in der 3D Faltung des Genoms können pathogen sein. 3D Genomfaltung kann mit verschiedenen Methoden untersucht werden um Chromatinkontakte, sowie die Position von DNA in Relation zu sub-nuklearen Bereichen oder der Kernmembran zu detektieren. Hier verwende ich GAM und Hi-C um zwei Aspekte der 3D Genomtopologie zu untersuchen, die Allelspezifität von Chromatinkontakten und Kontakte zwischen Chromosomen. Ich untersuche allelspezifische Kontakte in murinen embryonalen Stammzellen und Interaktionen zwischen Chromosomen im Zusammenhang mit Autismus Spektrum Störung auf ihre Relevanz in der Regulation von Genen. Zur allelspezifischen Detektion von Chromatinkontakten generierte ich einen GAM Datensatz der tausende von nuklearen Cryodünnschnitten enthält. Die Generierung dieser Daten beinhaltete die Entwicklung einer verbesserten Version der GAM Methode zur Produktion von großen Datensätzen in Hochdurchsatz. Hier zeige ich, dass GAM effizient Haplotyp-spezifische Chromatinkontakte bestimmen kann. Erste Untersuchungen von allelspezifischer 3D Genomtopologie zeigten weitreichende Unterschiede zwischen den Allelen, welche „A/B compartments“ und spezifische Chromatinkontakte beinhalten, wie zum Beispiel am Imprinting Locus H19/Igf2. Zur Untersuchung von interchromosomalen Kontakten detektierte ich Chromatinkontakte mit Hi-C im Kontext einer genomischen Deletion am humanen 16p11.2 Locus, assoziiert mit Autismus Spektrum Störung. Ich zeige hier, dass die Deletion am 16p11.2 Locus zu der Reorganisation von spezifischen interchromosomalen Kontakten zwischen 16p11.2 und Chromosom 18 führt, und stelle eine Hypothese auf wie diese interchromosomalen Kontakte zur ektopischen Aktivierung von Pcdh Genen auf Chromosom 18 führen. Protocadherins haben wichtige Funktionen in neuronaler Konnektivität, ein Prozess dessen Störung zur Manifestierung von Autismus Spektrum Störung beitragen könnte. / The 3D folding of interphase chromosomes inside the nucleus regulates important nuclear functions and once disrupted can lead to the manifestation of disease. Different techniques can be used to map 3D genome folding and detect pairwise and multiway interactions of the genome, or map the positions of DNA with respect to subnuclear compartments or the nuclear lamina. Here, I use GAM and Hi-C to explore two aspects of 3D genome topology, the allele specificity of chromatin contacts and long-range contacts between chromosomes, respectively. I detect specific contacts of the parental alleles in mouse embryonic stem cells and interactions between chromosomes in the context of congenital disease and study them with regard to their functionality and importance in mammalian gene regulation. For detecting chromatin contacts with allele specificity, I produced a GAM dataset containing thousands of nuclear slices. The collection of this data was accompanied by the development of a high-throughput version of GAM that allows the generation of large datasets. I show that GAM can determine haplotype-specific chromatin contacts with high efficiencies. First explorations of allele-specific chromatin topologies reveal many differences between the parental alleles, including allele-specific compartments A and B, and specific chromatin contacts, for example at the imprinted H19/Igf2 locus. For the exploration of inter-chromosomal contacts in disease, I mapped chromatin interactions with Hi-C in the context of a CNV at the human 16p11.2 locus, associated with autism spectrum disorders. Here, I show that the deletion at the 16p11.2 locus results in the rearrangement of specific inter-chromosomal contacts between the 16p11.2 locus and chromosome 18 and propose a role for these inter-chromosomal contact changes in the upregulation of the nearby Pcdhb gene cluster, which comprises protocadherin genes with important functions in neuronal connectivity during development.