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Im Rahmen der Arbeit Molekularbiologische Charakterisierung des Glukose Phosphotransferase System Regulators MtfA aus Escherichia coli wurde das als Mlc titration factor A charakterisierte Protein MtfA auf genetischer, biochemischer und physiologischer Ebene näher charakterisiert. Mit Hilfe von gezielten Austauschen konservierter Aminosäuren konnte im aminoterminalen Bereich eine leuzinreiche Dimerisierungsdomäne und im carboxyterminalen Bereich eine Mlc Wechselwirkungsdomäne identifiziert werden. Letzteres konnte mit Hilfe von Di-Hybrid Studien unabhängig bestätigt werden. Die EIIBGlc Domäne des Glukosetransporters vermag Mlc zu binden. Durch die Membranassoziation des Transporters kann Mlc von seiner Operatorsequenz durch Titration entfernt werden. Lösliches EIIBGlc bindet ebenfalls an Mlc. Es löst aber keine Inaktivierung des Repressors aus. MtfA dagegen liegt cytoplasmatisch vor und inaktiviert Mlc vermutlich über die Inhibierung seiner Tetramerisierung. Eine parallele Expression von MtfA und EIIBGlc zeigte einen inhibitorischen Einfluss von EIIBGlc auf die Wechselwirkung von MtfA und Mlc. Physiologische Untersuchungen von MtfA weisen auf einen Einfluss des Proteins auf das Chemotaxisverhalten von E.coli hin. Darüber hinaus konnte ein relativ schwacher mtfA-Promotor nachgewiesen werden. Im Rahmen von Wachstumskompetitionsversuchen wurde ein Wachstumsvorteil des MtfA Wildtyps im Vergleich zur Mutante beim Wachstum auf Glukose und bei 42°C beobachtet. Außerdem stellte sich bei diesen Versuchen ein Unterschied in der Regulation von MtfA in den Stämmen K-12 und LJ110 heraus. Dieser konnte im Rahmen von RT-RT PCR Studien sowie mittels Western-Blot Analysen bestätigt werden. Die erfolgreiche Reinigung des Proteins ermöglichte den Nachweis der Dimerisierung in verschiedenen biochemischen Analysen, sowie die Herstellung spezifischer Antikörper.

Es wurde ein System zur chemischen Modifizierung von Einzelcysteinvarianten des PTS- Transporters EIICBGlc etabliert, mit dem durch unterschiedliche Zugänglichkeit von Markersubstanzen die Zuordnung der jeweiligen Cysteine in Hinblick auf die Cytoplasmamembran gelang. Für die Methode war es notwendig, eine cysteinfreies EIICBGlc zu konstruieren. Dieses trägt des Weiteren eine Mutation, die die Phosphorylierung des Substrats Glukose von dem Transport entkoppelt. Dies ist notwendig, da das Cystein 421, das für die Phosphorylierung des WT verantwortlich ist, in dem cysteinfreien Protein nicht mehr vorhanden ist. Die Transportfähigkeit der Mutanten konnte nachgewiesen werden. Die Ergebnisse des Cystein-Scannings, Daten über dieses Protein aus vorangegangenen Arbeiten, sowie ein Vergleich der Struktur des EIIChb aus B. cereus, ermöglichten die Erstellung eines neuen Modells des Proteins EIICBGlc. In diesem Modell enthält das Protein 10 transmembrane Helices. Die postulierte Substratbindetasche wird aus haarnadelartigen Strukturen gebildet. Die Lage funktioneller Mutanten in dem Modell wurde diskutiert. Die entkoppelte Mutation R203H des Proteins EIICBGlc wurde isoliert. Eine Charakterisierung in Bezug auf ihre Fähigkeit Mlc zu titrieren, zeigte, dass eine Bindung von Mlc in diesem Protein möglich ist. Eine Konformationsänderung, die die Wechselwirkung zu Mlc inhibiert, liegt daher in diesem Protein nicht vor. Es wurde außerdem gezeigt, dass keine Erweiterung der Substratspezifität in diesem Protein vorliegt.

The essential gene YNL152w was previously found in a screen designed to isolate putative negative regulators of the S. cerevisiae Pkc1p pathway. Activity assays were performed with a lexA-RLM1-lacZ integrated reporter in different ynl152w truncated mutants. In contrast to the original screen, there were no differences or the activities were even lower in some mutants. To analyze the consequences of different expression levels, YNL152w was expressed under the control of the GAL1/10 promoter. Growth curves were performed under high, intermediate and low expression levels. Strikingly, both conditional strains were able to grow under repressing conditions. However, an aberrant morphology was found suggesting that the cells are indeed affected by low amounts of Ynl152w protein. A series of successive Ynl152wp C-terminal truncations was analyzed to determine cell viability and to investigate the function of the protein. Remarkably, about 2/3 of the protein were dispensable to confer viability. Microscopic analyses of constructs revealed an aberrant morphology characteristic of a cytokinesis defective mutant, with the appearance of swollen cells and formation of big aggregates. Interestingly, the phenotype was more pronounced in the larger truncations. Coherent with these results time-lapse experiments with a large truncated mutant showed a stabilization of the SH3 protein Hof1p at the bud neck. This protein is involved in septum formation and has been reported as a binding partner of YNL152w. The phenotypes observed in the truncated mutants could be attributed to the presence of 4 proline rich motifs. Such motifs have been reported to interact with SH3 domains. An internal deletion of an aspartate rich domain present in the Ynl152wp sequence also displayed a phenotype very similar to that of the largest truncations. Therefore, this domain may play an important role in Ynl152wp function.

Unter K+-limitierenden Wachstumsbedingungen oder, in wesentlich geringerem Ausmaß, unter Salzstress synthetisiert E. coli den KdpFABC-Komplex, ein hoch-affines K+-Transportsystem (Km ~ 2μM). Die Regulation der Expression des kdpFABC-Operons erfolgt durch das Sensorkinase/Antwortregulator-System KdpD/KdpE. Ziel des ersten Teils dieser Arbeit war die Identifizierung des Stimulus, der von der Sensorkinase KdpD wahrgenommen wird. Ausgangspunkt der Untersuchungen war die Beobachtung, dass die K+-Aufnahme über das Kdp-System bei K+-Konzentrationen >5 mM inhibiert wird. Diese wichtige Eigenschaft des Kdp-Systems wurde in der Vergangenheit häufig übersehen, da die Inhibierung des Kdp-Systems bei höheren pH-Werten (pH 7,8) durch eine hohe Rate unspezifischen K+-Transports kompensiert und somit überdeckt wird. Es konnte gezeigt werden, dass einzelne Aspartat-Substitutionen in den periplasmatischen Schleifen der Sensor-Domäne von KdpD ausreichten, um die Inhibierung des Kdp-Systems bei höheren K+-Konzentrationen aufzuheben. Diese KdpD-Derivate zeigten eine, im Vergleich zum KdpD-WT, veränderte Regulation der kdpFABC-Expression bei K+-Konzentrationen >5 mM, die eine adäquate K+-Aufnahme via KdpFABC ermöglichte. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Inhibierung der K+-Aufnahme über das Kdp-System bei K+-Konzentrationen >5 mM auf einer Inhibierung der kdpFABC-Expression durch KdpD basiert. Weiterhin konnte gezeigt werde, dass eine Abnahme der extrazellulären K+-Konzentration eine effiziente und sofortige Stimulierung der KdpD/KdpE-Signaltransduktion bewirkt. Aus diesen Ergebnissen wurde geschlussfolgert, dass die extrazelluläre K+-Konzentration als Reiz für die Sensorkinase KdpD dient. Im zweiten Teil dieser Arbeit erfolgte erstmals eine absolute Quantifizierung von KdpD und KdpE, sowie der Untereinheiten des KdpFABC-Komplexes unter induzierenden und nicht-induzierenden Bedingungen mittels hoch-sensitiver und selektiver Massenspektrometrie. Unter nicht-induzierenden Bedingungen liegt die KdpFABC-Synthese in der gleichen Größenordnung wie die KdpD- und KdpE-Synthese vor. Dieser Befund ist eine wichtige Voraussetzung für die postulierte, regulatorische Interaktion zwischen der Sensorkinase KdpD und der K+-Transportuntereinheit KdpB (Kipschull, 2011). Unter induzierenden Bedingungen stieg die KdpFABC-Synthese 100-300-fach, während eine etwa 10-fache Erhöhung der KdpD- und KdpE-Synthese nachgewiesen werden konnte. Diese Beobachtung bestätigt, dass das Zweikomponenten-System KdpD/KdpE unter induzierenden Bedingungen einer Autoregulation unterliegt. Die Autoregulation konnte durch eine räumliche Trennung des kdpFABC- und kdpDE-Operons aufgehoben werden. Die Aufhebung der Autoregulation von KdpD/KdpE hatte jedoch keinen Einfluss auf die Expressionskinetik des kdpFABC-Operons unter induzierenden Bedingungen. Der dritte Teil dieser Arbeit beschreibt die Konstruktion eines E. coli-Stamms, der eine vollständige Deletion des kdpD-Gens trägt. Nach einer zeitlichen Verzögerung konnte in dem daraus resultierenden E. coli-Stamm (LB2240ΔkdpD) unter K+-Limitation eine KdpD-unabhängige Expression des kdpFABC-Operons nachgewiesen werden. Die kdpFABC-Expression befähigte diesen Stamm, in Abwesenheit von KdpD unter K+-Limitation zu wachsen. Es konnte gezeigt werde, dass das K+-limitierte Wachstum von LB2240ΔkdpD eine Phosphorylierung von KdpE voraussetzt, wobei Acetylphosphat nicht als alternativer Phosphodonor diente. Da nur wenige Zellen einer LB2240ΔkdpD-Kultur den beschriebenen Phänotyp zeigten, liegt die Vermutung nahe, dass diese Zellen Träger einer Suppressormutation sind, die eine KdpD-unabhängige Phosphorylierung von KdpE und daraus folgend eine kdpFABC-Expression verursacht.

The yeast cell wall confers shape and integrity and serves as a first barrier against adverse environmental conditions. This thesis provides a first analysis of the cell wall structure of the milk yeast Kluyveromyces lactis and compares it to the one of the baker’s yeast Saccharomyces cerevisiae. Transmission electron microscopy revealed that the cell wall of K. lactis is 60 nm thick in glucose-grown cells and increases to 100 nm on ethanol media, whereas S. cerevisiae displays a cell wall thickness of 100 nm under both conditions. The cell wall proteome of K. lactis shares several homologs with the one of S. cerevisiae, but also contains three proteins not found in the latter. Moreover, three of the common cell wall proteins have two isoforms in K. lactis, but only one in S. cerevisiae. The restructuring of the cell wall on different carbon sources (i.e. glucose versus ethanol) indicates a relation between cell wall synthesis and/or remodeling and glucose signaling. Therefore, a key regulator which mediates the glucose response in S. cerevisiae, the SNF1 protein kinase complex, was further investigated. Mutants lacking the kinase activity have a thinner cell wall and show pronounced cell wall phenotypes in S. cerevisiae, i.e. they are hypersensitive to Zymolyase, Congo red, Calcofluor white and to the antifungal agent Caspofungin. Epistasis analyses with mutants affecting cell wall integrity signaling indicate that the SNF1 complex acts in parallel to the CWI pathway, which is induced upon cell wall stress. Immunological detection reveals the phosphorylation of Thr210 in the Snf1 kinase subunit, which is an indication for the activation of the kinase complex. Genetic analyses suggest that the transcriptional repressor Mig1 may be a downstream target mediating the cellular response. Further epistasis analyses with glycolytic mutants indicate that the availability of glucose-6-phosphate influences the cell wall phenotype of snf1Δ mutants. Hence, the role of the SNF1 complex in cell wall integrity is related to the glucose metabolism and glycolytic flux. This work provides the first comprehensive analysis of the role of glucose signaling and the SNF1 complex in yeast cell wall biosynthesis.

Halobacteria balance high external osmolality by the accumulation of almost equimolar amounts of KCl. Thus, steady Kplus supply is a vital prerequisite for life of these extreme halophiles. So far, Kplus was supposed to enter the cell only passively by use of potential-driven uniporters. However, the genome of the extreme halophilic archaeon Halobacterium sp. NRC-1 comprises one single operon containing the genes kdpFABC coding for homologs of the bacterial ATP-driven Kplus uptake system KdpFABC, together with an additional ORF so far annotated as cat3. Deletion of the kdpFABCcat3 genes led to a reduced ability to grow under limiting Kplus concentrations, whereas real-time RT-PCR measurements revealed both high induction rates and a transcriptional regulation of the Kdp system dependent on external Kplus concentration and growth phase. The synthesis of the high-affinity KdpFABC complex enables H. salinarum to grow under extreme potassium-limiting conditions of down to 20 µM Kplus. These results provide the first experimental evidence of ATP-driven Kplus uptake in halobacteria. The current opinion that Kplus homeostasis of H. salinarum is solely mediated via membrane potential-driven Kplus uniporters is obviously only one aspect of a more complex system.