Saccharomyces cerevisiae tem sido empregada como modelo experimental em testes de mutagenicidade, devido à presença de um sistema citocromo P-450 capaz de metabolizar substâncias promutagênicas a sua forma ativa. O grande número de linhagens e as diferenças na capacidade de produção de citocromo P-450 dificultam a definição das condições ideais de cultivo para obtenção de células com alto conteúdo desta enzima, sendo que poucos são os trabalhos publicados a este respeito. O objetivo deste trabalho é avaliar as melhores condições de cultivo para produção de citocromo P-450 em S. cerevisiae. Para tanto, quatro diferentes linhagens foram cultivadas sob diferentes condições, a fim de avaliar a influência de fatores como fonte de carbono, tempo de incubação e adição de etanol ao meio de cultura. Foi verificado que células cultivadas na presença de fontes de carbono altamente fermentáveis e coletadas no final da fase de crescimento exponencial apresentavam o maior conteúdo da enzima. Observou-se também que o nível de citocromo P-450 variou entre as linhagens estudadas, bem como o tempo de incubação para atingir a concentração máxima, sendo que o conteúdo mais alto foi encontrado na linhagem ATCC 44953. A adição de 2 % de etanol (v/v) ao meio de cultura contendo 2 % de glicose (p/v) resultou em aumento do nível de citocromo P-450, indicando o efeito indutor do etanol. Os resultados deste trabalho mostram a importância de estabelecer condições de cultivo para obtenção de células com altas concentrações da enzima, uma vez que fatores como a composição do meio de cultura, o tempo de incubação e a linhagem empregada podem influenciar a produção de citocromo P-450 por S. cerevisiae. / Saccharomyces cerevisiae has been employed as experimental model in mutagenicity tests due to the presence of a cytochrome P-450 system capable of metabolizing promutagens to its active form. The large number of S.cerevisiae strains and their different capacity of producing cytochrome P-450 make the definition of the ideal cultivation conditions to obtain cells with high enzyme content difficult. Moreover, there are only a few reports related to this subject. The aim of this work is evaluate the ideal cultivation conditions to produce cytochrome P-450 by S. cerevisiae. For this purpose, four different S. cerevisiae strains were cultured under different cultivation conditions in order to evaluate the influence of factors such as carbon source, incubation time and addition of ethanol to the culture media. It was found that the cytochrome P-450 content was higher in cells growth on strongly fermentable carbon source and harvested at the end of the exponential growth phase. Our results also showed that the cytochrome P-450 concentration varied among the strains studied, as well as the incubation time to reach the maximum level. The highest content was found in the ATCC 44953 strain and the addition of 2 % ethanol (w/w) to the culture media containing 2 % glucose (w/v) increased the cytochrome P-450 amount, indicating the induction of cytochrome P-450 production by ethanol action. These results show the importance of establishment of the cultivation conditions to obtain cells with high cytochrome P-450 concentrations, considering that factors such as the culture media, incubation time and strain employed can influence the cytochrome P-450 production by S.cerevisiae.

O citocromo P450 (CYP450) e suas isoformas podem ser reguladas por compostos exogenos, endogenos e patologias. O Diabetes Mellitus (DM) e uma sindrome de etiologia multipla, decorrente da incapacidade da insulina em exercer adequadamente sua acao, sendo capaz de alterar a atividade do CYP450. Este estudo avalia a influencia do DM na atividade das isoformas CYP2D6 e CYP3A4 utilizando como marcadores de atividade o metoprolol (MET) e o midazolam (MDZ) respectivamente. Ratos machos Wistar, 200-250 g, foram tratados com dose unica, por via oral 20 mg/Kg para MET e 15 mg/Kg para MDZ. O DM foi induzido por estreptozotocina (50 mg/Kg) por via intravenosa. Midazolam, metoprolol e alfa-hidroximetoprolol foram analisados em plasma por cromatografia liquida de ultraperformance (coluna XR-ODS 100 mm x 3,0 mm) acoplada a espectrometro de massas. O preparo das amostras foi realizado por extracao liquido-liquido. A analise farmacocinetica do MDZ em ratos mostrou reducao significativa (54,01 vs 12,24 L/h/kg) no clearance dos animais diabeticos em relacao ao controle e aumento significativo (402,66 vs 1742,6 h.ng/mL) do AUC0- ‡ no grupo diabetico quando comparado com o controle. O DM modificou o AUC0- ‡ do MET no grupo diabetico em relacao ao controle (998,09 vs 348,45 h.ng/mL) acompanhado de reducao significativa do clearance no grupo diabetico (46,85 vs 17,80 L/h/kg). Desde que nao foi observada qualquer alteracao na farmacocinetica do alfa-hidroximetoprolol, o aumento do AUC0- ‡ do MET pode ser devido a inibicao de outra via de metabolizacao pelo DM, como comprovado pela alteracao na via do CYP3A. A analise dos dados sugere que o DM inibe a atividade do CYP3A4 e nao exerce influencia sobre a atividade do CYP2D6 / Cytochrome P450 (CYP450) and its isoforms can be regulated by exogenous and endogenous compounds and also diseases. Diabetes Mellitus (DM) is a multiple etiology syndrome resulting from a lack or inability of insulin to properly exercise its action, that can modify the CYP450 activity. This research evaluates the influence of DM on CYP2D6 and CYP3A4 isoforms activity employing metoprolol (MET) and midazolam (MDZ) as probe drugs. Male Wistar rats 200-250g, were treated with single oral dose of 20mg/kg for MET and 15 mg/kg for MDZ. Diabetes mellitus was induced by streptozotocin (50mg/kg) intravenously administered. Midazolam, metoprolol and alpha-hydroxymetoprolol were analyzed in plasma by ultraperformance liquid chromatography (column XR-ODS) coupled to a mass spectrometer. The sample preparation was perfomed using liquid-liquid extraction. Pharmacokinetics of MDZ in rats showed a significant decrease (54,01 vs 12,24 L/h/kg) of total clearance in the diabetic animals compared to control group and a significant increase (402.66 vs 1742.6 h.ng/mL) AUC0- ‡ in the diabetic group compared with the control. The DM altered the AUC0- ‡ of MET in the diabetic group compared to control (998.09 vs 348.45 h.ng/mL) followed by a significant decrease in clearance in the diabetic group (46.85 vs 17.80 L/h/kg). Since no changes in alpha- hydroxymetoprolol pharmacokinetics was observed, the increase in MET AUC0- ‡ can be explained by DM inhibition of other MET metabolization pathways. Data analysis suggests that DM inhibits CYP3A4 activity and had no effect on CYP2D6 activity / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq

Xiao, Yajie. / Thesis (Ph.D.)--Chinese University of Hong Kong, 2013. / Includes bibliographical references (leaves 156-190). / Electronic reproduction. Hong Kong : Chinese University of Hong Kong, [2012] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Abstract also in Chinese.

Saccharomyces cerevisiae tem sido empregada como modelo experimental em testes de mutagenicidade, devido à presença de um sistema citocromo P-450 capaz de metabolizar substâncias promutagênicas a sua forma ativa. O grande número de linhagens e as diferenças na capacidade de produção de citocromo P-450 dificultam a definição das condições ideais de cultivo para obtenção de células com alto conteúdo desta enzima, sendo que poucos são os trabalhos publicados a este respeito. O objetivo deste trabalho é avaliar as melhores condições de cultivo para produção de citocromo P-450 em S. cerevisiae. Para tanto, quatro diferentes linhagens foram cultivadas sob diferentes condições, a fim de avaliar a influência de fatores como fonte de carbono, tempo de incubação e adição de etanol ao meio de cultura. Foi verificado que células cultivadas na presença de fontes de carbono altamente fermentáveis e coletadas no final da fase de crescimento exponencial apresentavam o maior conteúdo da enzima. Observou-se também que o nível de citocromo P-450 variou entre as linhagens estudadas, bem como o tempo de incubação para atingir a concentração máxima, sendo que o conteúdo mais alto foi encontrado na linhagem ATCC 44953. A adição de 2 % de etanol (v/v) ao meio de cultura contendo 2 % de glicose (p/v) resultou em aumento do nível de citocromo P-450, indicando o efeito indutor do etanol. Os resultados deste trabalho mostram a importância de estabelecer condições de cultivo para obtenção de células com altas concentrações da enzima, uma vez que fatores como a composição do meio de cultura, o tempo de incubação e a linhagem empregada podem influenciar a produção de citocromo P-450 por S. cerevisiae. / Saccharomyces cerevisiae has been employed as experimental model in mutagenicity tests due to the presence of a cytochrome P-450 system capable of metabolizing promutagens to its active form. The large number of S.cerevisiae strains and their different capacity of producing cytochrome P-450 make the definition of the ideal cultivation conditions to obtain cells with high enzyme content difficult. Moreover, there are only a few reports related to this subject. The aim of this work is evaluate the ideal cultivation conditions to produce cytochrome P-450 by S. cerevisiae. For this purpose, four different S. cerevisiae strains were cultured under different cultivation conditions in order to evaluate the influence of factors such as carbon source, incubation time and addition of ethanol to the culture media. It was found that the cytochrome P-450 content was higher in cells growth on strongly fermentable carbon source and harvested at the end of the exponential growth phase. Our results also showed that the cytochrome P-450 concentration varied among the strains studied, as well as the incubation time to reach the maximum level. The highest content was found in the ATCC 44953 strain and the addition of 2 % ethanol (w/w) to the culture media containing 2 % glucose (w/v) increased the cytochrome P-450 amount, indicating the induction of cytochrome P-450 production by ethanol action. These results show the importance of establishment of the cultivation conditions to obtain cells with high cytochrome P-450 concentrations, considering that factors such as the culture media, incubation time and strain employed can influence the cytochrome P-450 production by S.cerevisiae.

La 3,4-metilenodioximetanfetamina (MDMA, éxtasis) es una anfetamina sustituida de consumo frecuente y abusivo. La enzima principal que participa en el metabolismo de fase I de la MDMA, la isoforma 2D6 (CYP2D6) del citocromo P450, resulta también inhibida por la MDMA. Además, ésta es a la vez metabolizada por otras isoformas de CYP, por ejemplo la CYP1A2. La contribución de esta enzima y los posibles cambios en su actividad tras una administración de MDMA nunca han sido estudiados in-vivo. En consecuencia, se realizó un ensayo clínico donde los marcadores, dextrometorfano y cafeína se administraron tras una dosis oral de MDMA. En base a la farmacocinética de ambos marcadores se evaluaron posibles cambios en la actividad de las enzimas. En base al ratio metabólico urinario de dextrometorfano i dextrorfano (MR) se calculó la vida-media de degradación de CYP2D6. Tras una dosis de MDMA, el Cmax i AUC del dextrometorfano aumentó aproximadamente 10 veces con la correspondiente disminución en los parámetros farmacocineticos de dextrorfano. Se aumentó el MR casi 100 veces después de una dosis de MDMA, con un 67% de los sujetos superando la antimoda de 0.3 para la asignación del fenotipo de metabolizador lento de CYP2D6. La actividad de CYP2D6 se recuperó después de 10 días con una vida media de degradación de CYP2D6 de 46.6 h. La farmacocinética de la cafeína y sus metabolitos no fue afectada por la MDMA. Se debería avisar los consumidores de MDMA de las consecuencias de tal inhibición. A pesar de que hay muchas evidencias en animales sugiriendo que el MDMA es una neurotoxina serotonergica, todavía hay mucho debate sobre cuál es la causa de estos cambios cerebrales a largo plazo. La investigación apunta a la producción excesiva de especies reactivos de oxigeno (ROS) en el cerebro después de la administración de MDMA. La MDMA induce hipertermia, la liberación excesiva de dopamina cerebral y lleva a la desregulación energética del metabolismo. Conjuntamente, el metabolismo de MDMA produce un catecol reactivo, cuyos productos causan neurotoxicidad serotonergica en ratas. Cualquiera de los factores anteriores podrían ser la causa de la excesiva producción de ROS y los consecuentes cambios serotonergicos. A tenor de estas hipótesis, se investigó si diferentes temperaturas corporales afectarían el metabolismo de MDMA. Se administró MDMA a ratas a tres temperaturas ambientales distintas con el fin de prevenir o exacerbar la hipertermia inducida por MDMA. Se determinaron las concentraciones plasmáticas de MDMA y sus metabolitos principales durante las 6 h posteriores a la administración de la droga. Después de siete días, se sacrificaron los animales y se determinaron las cantidades de índoles cerebral. La administración de MDMA a 15ºC bloqueó la respuesta hipertermica y la disminución a largo plazo de 5-HT encontrada en ratas administradas a 21.5 ºC. A 15ºC, las concentraciones plasmáticas de MDMA aumentaron significativamente mientras que las concentraciones de sus metabolitos disminuyeron en comparación con ratas administradas a 21.5ºC. En contraste, la hipertermia y las deficiencias de indoles fueron exacerbadas en ratas tratadas a 30ºC. Se observó que las concentraciones plasmáticas de metabolitos de MDMA aumentaron significativamente en estos animales. La depleción a largo plazo de 5-HT no estuvo potenciada por la perfusión intrastriatal de MDMA después de una dosis sistémica de MDMA. Además, la interferencia del metabolismo de MDMA con la administración del inhibidor de catecol-o-metiltransferasa, entacapona, potenció la neurotoxicidad de MDMA, indicando que los metabolitos que son sustratos para este enzima podrían contribuir a la neurotoxicidad. Estos resultados tienen implicaciones tanto con el papel de la temperatura en el mecanismo del desarrollo de la neurotoxicidad del MDMA como en el abuso en humanos donde la hipertermia esta asociado con casos de toxicidad aguda. Se ha sugerido también que la causa de la depleción de 5-HT por MDMA es debido a un aumento de niveles de tirosina en el cerebro, cuyo hidroxilación no enzimática conduce a la formación de radicales libres derivados de la dopamina. En consecuencia, se propuso que el metabolismo de MDMA en compuestos pro-oxidantes fuera el paso limitante del proceso. En una serie de experimentos se encontraron niveles más altos de hipertermia aguda, concentraciones plasmáticas de tirosina, MDMA y sus metabolitos después de una dosis toxica de MDMA (15 mg/kg i.p.) versus una dosis no-toxica (7.5 mg/kg i.p.). La administración de una dosis no-toxica de MDMA (7.5 mg/kg i.p.) en conjunto con L-tirosina (0.2 mmol/kg i.p.) produció un aumento similar de niveles de tirosina en el suero con los niveles encontrados tras una dosis toxica de MDMA, sin embargo, los niveles de 5-HT cerebral permanecieron en niveles normales. Una dosis no-toxica de MDMA en combinación con una dosis alta de tirosina (0.5 mmol/kg i.p.) causó depleciones a largo plazo en ratas administradas a 21.5ºC pero no a 15ºC, condiciones conocidas por disminuir el metabolismo de MDMA. Al mismo tiempo, la perfusión estriatal de MDMA en combinación con tirosina (0.5 mmol/kg i.p.) en ratas hipertermicas no causaron depleciones de 5-HT. En contraste, se observaron reducciones significativas en 5-HT cerebral tras la administración de una dosis no-toxica de MDMA en ratas en condiciones de hipertermia en combinación con entacapona o acivisina, compuestos capaces de interferir con el metabolismo de MDMA o aumentar la disponibilidad de sus metabolitos en el cerebro, respectivamente. En conjunto estos datos indican que a pesar de que la tirosina y la hipertermia pueden contribuir a la neurotoxicidad inducida por la MDMA, el metabolismo de la droga parece ser el paso limitante.

Thesis (Ph. D.)--West Virginia University, 2001. / Title from document title page. Document formatted into pages; contains viii, 199 p. : ill. (some col.). Vita. Includes abstract. Includes bibliographical references (p. 176-195).

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2001. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 169-182).

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2001. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 165-195).

Thesis (Ph. D.)--West Virginia University, 2004. / Title from document title page. Document formatted into pages; contains xiii, 133 p. : ill. Vita. Includes abstract. Includes bibliographical references (p. 110-125).

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karolinska institutet, 2002. / Härtill 5 uppsatser.