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Olfactory neuroethology of the Oriental fruit moth, Grapholita molesta (Busck)

Ammagarahalli Munishamappa, Byrappa 06 October 2015 (has links)
The oriental fruit moth, Grapholita molesta, is one of the main pests of peach trees worldwide. It is conThe oriental fruit moth, Grapholita molesta, is one of the main pests of peach trees worldwide. Plant volatiles are a promising technique to attract G. molesta under mating disruption conditions. In my thesis I have characterized the response of olfactory receptor neurons (ORN) to pheromone and plant odors by means of single-sensillum electrophisiology. I then used this information to determine that a previously reported pheromone-plant synergism does not result from pheromone-plant interactions at the ORN level. I have compared several plant volatile blends previously tested in Australia and China, and have found that none of them attracted moths in the field, but they synergized pheromone responses in the laboratory. Finally, I investigated the role of plant blends and alcohols on the response to unnatural pheromone blend ratios or overdosed pheromone concentrations. With these studies we hopefully advanced on basic and applied aspects of the olfactory neuroethology of this species. / Grapholita molesta es una de las principales plagas del melocotonero. Los volátiles de planta son una técnica prometedora para atraer G. molesta en condiciones de confusión sexual. En mi tesis he caracterizado la respuesta de las neuronas receptoras olfativas (ORN) a la feromona y volátiles de planta mediante registros de sensila única. Después determiné que el sinergismo entre volátiles de planta y feromona previamente publicado no ocurre a nivel de la ORN. Más adelante he comparado volátiles de planta que en estudios anteriores en China y en Australia habían dado buenos resultados pero en mi caso no hubo respuestas en campo, aunque en el túnel de vuelo sí que aumentaron la respuesta a la feromona. Finalmente he explorado el papel de volátiles de planta y alcoholes en la respuesta a mezclas subóptimas de feromona. Con estos resultados espero haber contribuido al conocimiento de la neuretología olfativa de esta plaga. / Grapholita molesta és una de les principals plagues del presseguer. Els volàtils de planta són una tècnica prometedora per atreure G. molesta en condicions de confusió sexual. En la meva tesi he caracteritzat la resposta de les neurones receptores olfactòries (ORN) a la feromona i volàtils de planta mitjançant registres de sensila única. Després vaig determinar que el sinergismo entre volàtils de planta i feromona prèviament publicat no ocorre a nivell de la ORN. Més endavant he comparat volàtils de planta que en estudis anteriors a Xina i a Austràlia havien dau bons resultats però en el meu cas no va haver-hi respostes en camp, encara que en el túnel de vol sí que van augmentar la resposta a la feromona. Finalment he explorat el paper de volàtils de planta i alcohols en la resposta a mescles subóptimas de feromona. Amb aquests resultats espero haver contribuït al coneixement de la neuretología olfactòria d'aquesta plaga.trolled with sex pheromones (mating disrupton) and insecticide applications. Under mating disruption conditions it is difficult to monitor the pest and to evaluate the control methods. Plant volatiles are a promising technique to attract G. molesta under mating disruption conditions. In addition plant volatiles could attract females, while the sex pheromone only attracts males.
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Multiscale environmental-ichthyoplankton assemblages relationships in the Balearic Sea

Álvarez Ellacuría, Itziar 18 June 2015 (has links)
Understanding the early life stages of fishes and the processes influencing their survival has been at the heart of the fisheries oceanography since the beginning of the 20th century. By focusing on spatial and temporal patterns in the ichthyoplankton (those early stages whose horizontal location is largely determined by currents), it is possible to gain some understanding of interrelationships among environmental conditions, fish spawning phase and dispersal/survival dynamics of the planktonic stages of fish. The different physical and/or biological processes controlling Larval Fish Assemblages (LFAs) variability (abundances, composition and distribution) act at very different space and time scales. Sampling the sea at the appropriate frequency and at adequate time and space scales is required to evaluate those mechanisms. These studies are insufficiently developed in the Balearic Archipelago, a hotspot for biodiversity located in an extremely dynamic area of the Mediterranean. With this premise in mind, the main objective of the thesis was to deepen in the knowledge of LFA dynamics in the Balearic Sea (NW Mediterranean) at different spatio-temporal scales. Four different approaches were addressed. At a sub-seasonal temporal scale, the influence of coastal environmental conditions during the shift from winter-spring to summer on fish larvae assemblages in a temperate area was evaluated. Larval fish assemblages were sampled fortnightly at three stations located in coastal waters off southern Mallorca from March to August 2007, covering the main spawning period for the resident coastal fish in this region. The larval fish assemblage showed clear seasonality with higher specific abundance but lower diversity in the spring, probably linked to a spatial (at the vertical scale) shift in the energy flow, which may trigger the summer spawning of many bottom-dwelling species. At the submesoscale domain, the factors that may regulate the previously suggested high levels of larval self-recruitment were explored in Cabrera National Park (CNP), an insular Marine Protected Area (MPA) located off southern Mallorca. Our study attributes the regulation of larval arrival to the MPA to a combination of retention by topographically generated circulation patterns around the island and shelf break frontal dynamics. Also at scales smaller than the mesoscale, we examined fish larval distribution drivers in Palma Bay, a large (~20 Km) wind-driven microtidal bay in the southern coast of Mallorca. Distributions and abundances of fish larvae in the Bay were analyzed and interpreted in the context of the observed circulation patterns, adult habitat distribution and spawning traits. Acoustic Doppler Current Profiler (ADCP) observations showed the presence of retentive flow patterns in the middle of the Bay enhancing local larval accumulation and self-recruitment. A multivariate approach based on Redundancy Analysis (RDA) revealed differences between the larval fish assemblages in the Bay, constituted by small pelagic and benthopelagic families (Gobiidae, Chromis chromis and Serranus hepatus) and offshore larvae, mostly from meso and large pelagic fish. These larval fish assemblages were structured according to depth variations and zooplankton abundance, and remained relatively unmixed because of the circulation patterns in the mouth of the Bay that uncouple its dynamics from alongshelf circulation. At mesoscale level, we investigated the effect of two hydrographic scenarios, representing well-known contrasting examples of the early summer mesoscale dynamics in the archipelago, on the summer larval fish assemblages during two cruises in 2004 and 2005. While depth was the most important variable in explaining the assemblage structure and diversity observed under both scenarios, indicators of mesoscale activity (dynamic height, geostrophic velocity) contributed significantly to understanding the dynamics of the larval fish community. The larval assemblage dynamics are discussed in terms of species-specific and extrinsic factors, including future consequences of potential changes in these environmental scenarios. The main results of this thesis are put together in context in a general discussion section and shortcomings and future directions are explored. / Desde principios del siglo veinte, el estudio de los estadios tempranos de los peces y de los procesos que influyen en su supervivencia forma parte de la oceanografía pesquera. La investigación de los patrones temporales y espaciales del ictiopláncton hace posible entender las relaciones entre las condiciones del ambiente, la fase reproductiva de los adultos y la dinámica de supervivencia y retención de los estadios planctónicos de los peces. Los diferentes procesos físicos y/o biológicos que controlan la variabilidad (abundancia, composición y distribución) en las comunidades de larvas de peces (a partir de aquí LFA, del inglés Larval Fish Assemblage) actúan a escalas espaciales y temporales muy diferentes. Se hace necesario por tanto muestrear en el mar con la frecuencia apropiada y a la escala espacio-temporal adecuada para evaluar esos mecanismos. Este tipo de estudios son escasos en el archipiélago Balear, punto de interés de la biodiversidad y situado en un área del Mediterráneo extremadamente dinámica. Teniendo todo lo anterior en cuenta, el principal objetivo de la tesis fue profundizar en el conocimiento de la dinámica de las LFA en el Mar Balear, a diferentes escalas espacio-temporales. Se realizaron cuatro aproximaciones diferentes. A escala temporal, se evaluó la influencia de las condiciones ambientales costeras durante la transición primavera temprana-verano sobre las LFAs. Se realizaron muestreos quincenales entre marzo y agosto (cubriendo el pico de puesta de la mayoría de las especies de la zona) en tres estaciones de la zona costera del sur de Mallorca. Las LFAs reflejaron claramente la estacionalidad de la zona con una alta abundancia de especies pero bajas densidades de larvas en primavera, probablemente relacionada con la transición espacial (en el plano vertical) del flujo de energía que seguramente desencadena la puesta estival de muchas de las especies cercanas al fondo. A una escala menor que mesoescala, se estudiaron los factores que regulan los altos niveles de auto reclutamiento previamente sugeridos para el Parque Nacional de Cabrera. Nuestro estudio atribuye la regulación de la llegada de larvas al área a una combinación de retención por los patrones de circulación generados por la topografía alrededor de Mallorca y la dinámica asociada a un frente de plataforma. También a escala inferior a la mesoescala, examinamos los agentes responsables de la distribución de LFAs en la bahía de Palma en la costa sur de Mallorca. Se analizaron e interpretaron la abundancia y distribución horizontal de las larvas de peces en la bahía en el contexto de los patrones de circulación observados, el hábitat de los adultos y las estrategias de puesta. Mediante observaciones de un perfilador de corrientes mediante Doppler, se describió la presencia de patrones retentivos de circulación en el medio de la bahía que favorecen la acumulación de larvas locales y el auto reclutamiento. Una aproximación multivariante basada en el análisis de redundancia (RDA) reveló diferencias entre la comunidad de la bahía formada por familias bentopelágicas y de pequeños pelágicos y una LFA de especies más lejanas a la costa, principalmente mesopelágicos y grandes pelágicos. Esas comunidades estaban estructuradas según variaciones en profundidad de abundancia de zooplancton y permanecían relativamente separadas debido a que los patrones de circulación a la entrada de la bahía separan su dinámica interna de la circulación en la plataforma. A nivel de mesoescala investigamos mediante dos campañas en años consecutivos el efecto que ejercen dos escenarios hidrográficos (que representan ejemplos de escenarios muy contrastados entre sí característicos de la dinámica de mesosescala en verano en el archipiélago) sobre las LFAs estivales en la zona. Bajo ambos escenarios, la profundidad resultó ser la variable que mejor explicaba la estructura de la comunidad y su diversidad. Aun así, los indicadores de actividad mesoescalar (altura dinámica, velocidad geostrófica) contribuyeron de manera significativa a entender la dinámica de las LFAs. Los principales resultados de esta tesis se tratan como conjunto en una discusión general final donde también se comentan las limitaciones y se exploran las posibilidades de futuro. / Des de principis del segle vint, l’estudi dels estadis primerencs dels peixos i dels processos que influeixen en la seva supervivència forma part de l’oceanografia pesquera. La recerca dels patrons temporals i espacials del ictioplàncton fa possible entendre les relacions entre les condicions de l’ambient, la fase reproductiva dels adults i la dinàmica de supervivència i retenció dels estadis planctònics dels peixos. Els diferents processos físics i biològics que controlen la variabilitat (abundància, composició i distribució) en les comunitats de larves de peixos (d’aquí endavant LFA, de l’anglès larval Fish Assemblage) actuen a escales espacials i temporals molt diferents. Es fa necessari per tant mostrejar la mar amb la freqüència adient i a la escala espaitemporal adequada per avaluar aquests mecanismes. Aquest tipus d’estudi son escassos a les Illes Balears, punt d’interès de la biodiversitat i situades a un àrea de la Mediterrània extremadament dinàmica. Amb tot lo anterior en ment, l’objectiu principal d’aquesta tesi va ser augmentar el coneixement de la dinàmica de les LFA a la Mar Balear, a diferents escales espai-temporals. Es varen realitzar quatre aproximacions diferents. A l’escala temporal, es va avaluar la influencia de les condicions ambientals costaneres durant la transició primavera-estiu sobre les LFAs. Es varen realitzar mostreigs quinzenals de març a agost (pic de posta de la majoria de les especies de la zona) a tres estacions costaneres del sud de Mallorca. Les LFAs varen reflectir clarament la estacionalitat de la zona amb una alta abundància d’espècies però amb baixes densitats de larves a la primavera amb molta probabilitat relacionada amb la transició espacial (dins del pla vertical) del flux d’energia que segurament desencadena la posta estival de moltes especies properes al fons. A una escala menor que la mesoescala, es varen estudiar els factors que regulen els alts nivells de auto reclutament prèviament suggerits per el Parc Nacional de Cabrera. El nostre estudi atribueix la regulació de l’arribada de larves al àrea a una combinació de retenció pels patrons de circulació generats per la topografia al voltant de Mallorca i la dinàmica associada a un front de plataforma. També a escala inferior a mesoescala, vàrem examinar els agents responsables de la distribució del LFA a la badia de Palma a la costa sud de Mallorca. Es varen analitzar i interpretar la abundància i distribució horitzontal de les larves de peixos a la badia en el context dels patrons de circulació observats, l’habitat dels adults i les estratègies de posta. Mitjançant observacions amb un perfilador de corrents Doppler es va descriure la presencia de patrons retentius de circulació al mig de la badia que afavoreixen la acumulació de larves locals i el auto reclutament. Una aproximació multivariant basada en l’anàlisi de redundàncies (RDA) va revelar diferencies entre la comunitat de la badia formada per famílies bentopelàgiques i de petits pelàgics i una LFA d’espècies mes allunyades de costa, principalment mesopelàgics i grans pelàgics. Aquestes comunitats estaven estructurades segons variacions en profunditat de abundància de zooplàncton i romanien relativament separades degut a que els patrons de circulació a l’entrada de la badia separen la seva dinàmica interna de la circulació a la plataforma. A nivell de mesoescala vàrem investigar mitjançant dues campanyes a anys consecutius l’efecte que exerceixen dos escenaris hidrogràfics (que representen exemples d’escenaris molt contrastats l’un de l’altre característics de la dinàmica de mesoscale a l’estiu a l’arxipèlag) sobre les LFAs estiuenques a la zona. Sota ambdós escenaris, la fondària va resultar ésser la variable que millor explicava l’estructura de la comunitat i la seva diversitat. Tot i això, els indicadors d’activitat mesoscalar (alçada dinàmica i velocitat geostrofica) varen contribuir se manera significativa a entendre la dinàmica de les LFAs. Els principals resultat d’aquesta tesi es tracten com a conjunt a una discussió general final on també es comenten les limitacions i s’exploren les possibilitats de futur.
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Biotechnological approaches to cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells

Di Guglielmo, Claudia 09 February 2016 (has links)
Tesi realitzada a l'Institut de Bioenginyeria de Catalunya (IBEC) / The heart can be considered the most important organ of our body, as it supplies nutrients to all the cells. When affected from injuries or diseases, the heart function is hampered, as the damaged area is substituted by a fibrotic scar instead of functional tissue. Understanding the mechanisms leading to heart failure and finding a cure for cardiac diseases represents a major challenge of modern medicine, since they are the leading cause of death and disability in Western world. Being the heart a vital organ it is difficult to have access to its cells, especially in humans. In order to model it or find therapeutic strategies many approaches and cell sources have been studied. For example cardiac stem cells, skeletal myoblasts, bone marrow-derived cells and peripheral blood mononuclear cells have been tested in pre-clinical and clinical trials, without significant tissue regeneration. Human pluripotent stem cells (hPSC) are thought to be the most promising cell type in the field, thanks to their unlimited capacity of self-renewal and retention of differentiation potency. Induced pluripotent stem cells (iPSC) are pluripotent cells derived through reprogramming from adult cells, easily accessible from patients, like keratinocytes. iPSC can be differentiated to cardiac cells, through stage-specific protocols that reproduce embryonic development, offering a very useful platform for modelling diseases of patients with heart failure, for testing new drugs, and for cellular therapy in the future. However, properly mimicking cardiac tissue is very complex, since not only the correct cardiac cell type has to be reproduced, but also its overall cellular composition, architecture and biophysical functions. In order to study these aspects, we applied biotechnological strategies such as the use of transgenic cell lines for obtaining pure and scalable differentiated cells to be cultured in a 3D scaffold with a perfusion bioreactor. Although it is well known that iPSC can give rise to cardiomyocytes in vitro, not every cell line can be efficiently differentiated. Thus, a cell line-specific differentiation protocol has to be identified and optimized. We finally identified a fast and efficient stage-specific differentiation protocol suitable for the iPSC lines used in this work, derived from human keratinocytes. With this protocol, we can reproducibly obtain close to 50% cardiomyocytes after 15 days of differentiation. One important feature of currently available differentiation protocols is that the target cell type is obtained among a heterogeneous cell population. To track the cardiac population of interest we generated transgenic cell lines where the reporter protein GFP follows the expression of different genes specific for stages of differentiation, such as T (Brachyury) for mesoderm; NKX2.5 for cardiac progenitors; and MHC for cardiomyocytes. Moreover, cardiomyocytes obtained from hPSC using currently available differentiation protocols are typically immature, mostly resembling embryonic or fetal cardiomyocytes, arguably because of the lack of mechanical and electrical stimuli that only a 3D environment can provide. In order to create a piece of tissue in 3D we used a collagen and elastin-based scaffold, to mimic the structural proteins of endogenous extracellular matrix. We also built a perfusion bioreactor to culture the construct. After initial validation with primary cultures of rat neonatal cardiomyocytes, we tested iPSC-derived cardiac cells at different stages of differentiation. While early mesoderm or cardiac progenitors could not survive in our system, iPSC differentiated to cardiomyocytes, could be retained and maintained alive within the scaffold for at least 4 days. In conclusion, in this work we combined biotechnological tools in order to obtain a test platform for studying the mechanisms underlying cardiac differentiation, maturation, as well as providing valuable in vitro systems for disease modelling, drug screening of patient-specific heart muscle cells and cell therapy. / El corazón es el órgano más importante del cuerpo: impulsando la sangre, aporta oxigeno y nutrientes a cada célula del organismo. En caso de fallo cardiaco la función del corazón no puede recuperarse, ya que los cardiomiocitos son reemplazados por una cicatriz fibrosa no funcional. Las enfermedades cardiacas representan la mayor causa de muerte y enfermedad en el mundo occidental y entender los mecanismos de las patologías cardiacas, así como encontrar curas para ellas, es un desafío de primaria importancia para la medicina moderna. Siendo el corazón un órgano vital y difícilmente accesible, resulta imprescindible encontrar una fuente celular alternativa. Las células madre humanas con pluripotencia inducida (iPSC – induced pluripotent stem cells) parecen óptimas, porque se derivan de simples biopsias de piel de pacientes y se pueden diferenciar a cualquier tipo celular, cardiomiocitos incluidos. Aún así, diferenciar el tejido cardiaco es muy complejo: no solamente se debe de reproducir el tipo celular, sino también su composición celular, su arquitectura y sus funciones biofísicas. Para estudiar estos aspectos, por un lado obtuvimos tres líneas celulares de iPSC reporteras de genes específicos de diferentes estadios de diferenciación cardiaca (T para mesodermo, NKX2.5 para progenitores cardiacos y alpha-MHC para cardiomiocitos), y por otro desarrollamos un biorreactor adecuado para el cultivo de células cardiacas en 3D. Utilizamos las líneas transgénicas como herramienta para seleccionar células en diferentes estadios de diferenciación y las co-cultivamos con fibroblastos en un andamio compuesto de colágeno y elastina (imitando la matriz extracelular cardiaca y la composición celular del corazón). En conjunto, este estudio revela que las iPSC pueden ser retenidas y cultivadas en nuestro sistema 3D. Mientras células de mesodermo temprano y progenitores cardiacos no completaron la diferenciación cardiaca, los cardiomiocitos derivados de iPSC con cultivo convencional y cultivados en el biorreactor pudieron ser mantenidos viables en el mismo al menos 4 días. La aproximación experimental aquí presentada representa una base para desarrollar plataformas de estudio in vitro paciente-especificas para modelar enfermedades cardiacas humanas y estudios de fármacos, así como ofrecer una herramienta de estudio de los mecanismos de la diferenciación y maduración cardiacas.
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Lipidomics studies of recombinant Pichia pastoris for improved recombinant protein secretion through cell engineering

Adelantado Vallvé, Núria 05 February 2016 (has links)
L’ús cada cop més extensiu de plataformes “òmiques” per a l’estudi de llevats ha generat grans quantitats d’informació relativa a la fisiologia cel·lular sota diferents condicions de cultiu, la qual pot ser utilitzada per al desenvolupament de noves estratègies d’enginyeria genètica. S’ha observat que els nivells d’expressió d’un fragment d’anticòs humà produït en el llevat metilotròfic Pichia pastoris augmenten significativament quan aquest és cultivat en nivells de baixa disponibilitat d’oxigen. Anàlisis transcriptòmics mostren que hi ha una regulació important dels gens involucrats en el metabolisme de lípids i la resposta al mal plegament de proteïnes (UPR), destacant la l’augment de transcrits provinents de gens involucrats en les rutes de biosíntesi de l’ergosterol i esfingolípids. A més, s’ha observat que la presència en el medi de cultiu de fluconazol, un agent antifúngic que inhibeix específicament l’activitat de la esterol C14α-demetilasa (Erg11p) en la ruta de biosíntesi de l’ergosterol, resulta en una disminució dels nivells d’ergosterol en les membranes cel·lulars, millorant els nivells de proteïna recombinant secretada al medi de cultiu. Finalment, el factor de transcripció Hac1, amb un paper important en la regulació de la UPR, també es troba involucrat en la regulació de la síntesi de lípids. En el present estudi, la soca de referència, P. pastoris que produeix el fragment d’anticòs 2F5 de manera recombinant, s’ha modificat genèticament per tal de canviar la seva composició lipídica. S’ha generat una bateria de soques que presenten alguns gens de la ruta de biosíntesi d’esfingolípids delecionats (DES1, SUR2), o bé sobreexpressats (DES1). Al mateix temps, s’ha alterat la ruta de síntesi de l’ergosterol de la soca de referència mitjançant la sobreexpressió del gen ERG11 o tractant les cèl·lules amb fluconazol. Finalment, també es va sobreexpressar HAC1. Les cèl·lules es van cultivar en cultius en continu sota condicions d’oxigen normals (normoxia), i baixos (hipòxia), i les soques van ser caracteritzades en quant a nivells de Fab produïts, la seva distribució intra/extracel·lular, morfologia a partir d’estudis de microscòpia electrònica (TEM), i el seu contingut lipídic, quantificant els nivells d’àcids grassos, fosfolípids, esterols, lípids neutres i esfingolípids. Amb tota aquesta informació es pretén comprendre com les cèl·lules s’adapten a canvis genètics i ambientals a través de canvis en el seu contingut lipídic. Els resultats obtinguts s’han combinat amb informació transcriptòmica prèviament publicada, demostrant que existeix una important remodelació del metabolisme lipídic quan les cèl·lules es troben en condicions d’hipòxia. / The increasing availability of omics databases provides an important knowledge base for the design of novel yeast engineering strategies, since they offer systems-level information on the physiology of the cells under diverse growth conditions and genetic backgrounds. In a previous study, a beneficial effect of low oxygen availability on the expression of a human Fab fragment in Pichia pastoris has been identified. Transcriptomic analyses pointed out important regulation of the Unfolded Protein Response (UPR) and lipid metabolism, with a significant transcriptional up-regulation of ergosterol and sphingolipid biosynthetic pathways. Furthermore, cells cultured in the presence of fluconazole, an antifungal agent that inhibits sterol C14α-demethylase (Erg11p) activity in the ergosterol biosynthetic pathway, showed a reduced amount of ergosterol in the plasma membrane, resulting in increased protein secretion levels. Moreover, it is known that the transcription factor Hac1, which plays a key role by regulating the UPR, regulates lipid biosynthesis In the present study, a reference strain of P. pastoris secreting the 2F5 Fab antibody fragment as a model recombinant protein was genetically modified in order to change its lipid composition. A set of strains harbouring either deleted (DES1, SUR2) or overexpressed (DES1) genes of the sphingolipid pathway were generated. In addition, a Fab producing strain overexpressing HAC1 or ERG11 were constructed and, as an alternative to the ergosterol pathway knockout, the reference strain was treated with fluconazole. The series of strains were cultivated in chemostat cultures under normoxic and hypoxic conditions. Strains were characterised in terms of Fab- productivity, intra/extracellular product distribution, cell morphology by transmission electron microscopy (TEM) and lipid content in terms of phospholipids, fatty acids, sterols, non-polar lipids and sphingolipids, in order to fully understand how cells adapt to genetic and environmental changes involving lipid changes. The obtained results were combined with previously published transcriptional data, allowing us to demonstrate an important remodelling of the lipid metabolism under limited oxygen availability.
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Sensibilización de la respuesta emocional y neuroendocrina al estrés: Contribución de las características de los estímulos estresantes y mecanismos implicados

Belda Poyato, Xavier 05 February 2016 (has links)
En animales de laboratorio, la exposición previa a estímulos estresantes de naturaleza emocional suele inducir una reducción de algunas respuestas de estrés cuando los animales son re-expuestos al mismo estímulo, mientras que generalmente da lugar a respuestas normales o acentuadas (sensibilización cruzada) frente a un estímulo estresante diferente (heterotípico). En las últimas décadas ha habido un creciente interés por los procesos de sensibilización ya que se postula que están en gran medida implicados en la aparición de un número considerable de alteraciones fisiológicas y psicopatologías, incluyendo desordenes gastrointestinales, dolor crónico, trastorno por estrés post-traumático (PTSD), psicosis o adicción, entre otras. La presente tesis se ha centrado en el estudio de las características de los estímulos estresantes que contribuyen a la inducción y la expresión de la sensibilización cruzada inducida por una única exposición al estrés, así como la exploración de posibles mecanismos implicados en el proceso. Para ello, hemos utilizado ratas macho adultas como sujetos experimentales y se ha valorado la actividad del eje hipotalámico-hipofisario-adrenal (HPA) y aspectos conductuales relacionados con actividad/exploración y ansiedad. Nuestros resultados muestran que una sola exposición a un estímulo estresante de elevada intensidad (inmovilización en planchas, IMO) induce una sensibilización de la respuesta del eje HPA a ambientes nuevos y un incremento en la ansiedad, evaluada mediante el laberinto elevado en cruz (EPM), que son observables durante la semana posterior a la IMO pero no a los diez días. No obstante, la sobreimposición de una sesión breve de choques eléctricos (FS) justo antes del EPM incrementa notablemente la ansiedad en los animales previamente expuestos a una IMO diez días antes, sin afectar a los animales sin experiencia previa con la IMO. Estos datos indican que una sola IMO causa un estado de sensibilización endocrina y conductual a nuevas situaciones de estrés, siendo el efecto más duradero a nivel conductual. Ni la inhibición de la síntesis de glucocorticoides, ni la administración de antagonistas de los receptores de glucocorticoides o del receptor CRHR1 antes de la IMO afectaron a los efectos de la IMO sobre la conducta o a la sensibilización del eje HPA en respuesta a un ambiente nuevo al día siguiente, sugiriendo que ni los glucocorticoides ni los CRHR1 juegan un papel relevante. La comparación de la exposición a la IMO con la exposición a otros estímulos que difieren en intensidad (choques eléctricos y natación forzada), pone de manifiesto que la sensibilización del eje HPA en respuesta a un ambiente nuevo es directamente proporcional a la intensidad del estímulo inductor. Aunque una breve exposición a la IMO es suficiente para inducir sensibilización cruzada del eje HPA, el grado de sensibilización es mayor y más duradero cuanto más prolongada es la exposición a la IMO. Finalmente, demostramos que la sensibilización cruzada del eje HPA tras una exposición previa a la IMO es más evidente cuando el estímulo estresante heterotípico es de menos intensidad, aunque es mucho más crítica la duración de la exposición al estímulo heterotípico, de tal manera que ésta es máxima con 5 min de exposición para desaparecer tras una exposición de 30 min. En conjunto, los datos experimentales presentados en esta tesis, apoyados por el artículo de revisión, permiten delimitar las características de la sensibilización cruzada del eje HPA inducida por la exposición aguda a distintas situaciones de estrés y su relación con la sensibilización conductual. La importancia de la intensidad y duración de los estímulos estresantes tanto respecto a la inducción como a la expresión de la sensibilización aportan luz sobre muchas de las discrepancias que aparecen en la literatura. / In laboratory animals, prior exposure to emotional stressors usually induces a reduction of some stress responses when animals are re-exposed to the same stimulus, while exposure to a different stressor (heterotypic) generally results in normal or enhanced responses (cross-sensitization). In the last decades, a growing interest for the processes of sensitization has been generated because it is postulated they are heavily involved in the development of a large number of physiological alterations and psychopathologies, including gastrointestinal disorders, chronic pain, post-traumatic stress disorder (PTSD), psychosis and addiction, among others. This thesis has focused on the study of the characteristics of the stressors that contribute to the induction and expression of cross-sensitization induced by a single prior exposure to stress, as well as on the exploration of mechanisms likely to be involved in this process. To this end, we have used adult male rats as experimental subjects, and the activity of hypothalamic-pituitary-adrenal axis (HPA) and some behavioral aspects related to activity/exploration and anxiety have been assessed. Our results show that a single exposure to a severe stressor (immobilization on boards, IMO) induces cross-sensitization of the HPA response to novel environments and increased anxiety, as assessed by the elevated plus maze (EPM). These effects are noted during the week following IMO but not ten days after. However, a brief exposure to foot-shocks just before the EPM markedly enhances anxiety in rats previously exposed to IMO, without altering behavior in animals having no previous experience with IMO. These data indicate that a single IMO causes a state of endocrine and behavioral sensitization to new stressors, being the latter longer-lasting. Neither glucocorticoid synthesis inhibition nor administrations of antagonists for glucocorticoid or CRHR1 receptors before IMO were able to alter behavioral consequences of IMO or HPA cross-sensitization after exposure to the open field (OF) the day after. These data suggest that neither glucocorticoids nor CRHR1 play an important role in these cross-sensitization processes. Comparing IMO with other stressors that differ in intensity (foot-shock or forced swim), indicates cross-sensitization after response to the OF is directly proportional to the intensity of the triggering (inductive) stressor. Although brief exposure to IMO is enough to induce HPA cross-sensitization, the degree of cross-sensitization is greater and longer-lasting after more prolonged exposure to IMO. Finally, we demonstrate that HPA cross-sensitization after a previous exposure to IMO is more evident when the heterotypic stressor is of low intensity. Nevertheless, the length of exposure to the heterotypic stressor is much more critical, so that HPA cross-sensitization is highest with 5 min exposure and disappears after 30 min exposure. Overall, the experimental data presented in this thesis, supported by the review article, allows defining the characteristics of HPA cross-sensitization induced by an acute exposure to different emotional stressors and its relationship with the behavioral sensitization. The relevance of the intensity of stressors and length of exposure regarding both the induction and the expression of cross-sensitization can explain many of the discrepancies observed in the literature.
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Intestinal anastomosis wound healing after platelet-rich plasma (PRP) application on pigs. Macroscopic, microscopic and breaking strength evaluations

Rafael Bambo, Otilia 19 June 2009 (has links)
La enterectomía es un procedimiento quirúrgico que consiste en suturar dos segmentos intestinales, la mayor complicación que aparece es la pérdida por las suturas y las dehiscencias y que están asociadas a una alta morbilidad y mortalidad. En pequeños animales las complicaciones en las anastomosis del intestino delgado tienen una incidencia 7-16%, y cerca 74-80% de estos pacientes mueren. Se han realizado diversos procedimientos para asegurar la impermeabilidad de la anastomoses: Omentoplastia, parches de serosa, endotubos, anillos ajustables internos y entre otros. También se han buscado nuevas innovadoras alternativas quirúrgicas, que incluyeron el uso de sustancias adhesivas, fibrinas elaboradas por moléculas (fibrinógeno y trombina). Desde hace varios años, los estudios relacionados con la regeneración se han dirigido a investigar cuál es el efecto de los factores de crecimiento sobre los tejidos. Gran parte de los estudios se han realizado in vitro, utilizando factores recombinantes, es decir, factores de crecimiento elaborados en el laboratorio. Pero la desventaja de estas sustancias incluye el alto coste económico para su obtención. Y poco se sabe de sus efectos secundarios.Actualmente, el estudio del proceso de la cicatrización se centra en la aceleración de este proceso a nivel celular con el uso de plasma rico en plaquetas (PRP). En el presente estudio se han incluido 35 cerdos de raza Large White, sexo indiferente con un peso medio de 55±5 Kg. En cada animal, se realizaron 2 enterectomías, en una de ellas se le aplicó PRP en el lugar de la incisión, mientras que en la otra no, sirviéndonos como control. Para el examen histológico se realizaron 5 grupos de 3 animales cada uno. Los cerdos se eutanasiaron a las 24h, 48h, 72h, 96h y 7 días, respectivamente, tras la cirugía. Para la evaluación de la resistencia de la anastomosis, se emplearon 2 grupos de 10 animales cada uno. El grupo A se eutanasió a los 3 días tras la cirugía, mientras que el grupo B se eutanasió a los 7 días. A nivel histológico en todas las muestras de las 24h y 48h, tanto en las muestras control como PRP, mostraron una creciente inflamación que finalmente, a las 72h y 96h fue substituida por un tejido de granulación inmaduro. La presencia de tejido de granulación fue más abundante en las muestras PRP. En la determinación de la fuerza de rotura no se obtuvieron diferencias significativas en la resistencia de la anastomosis entre el grupo control y el PRP, para ninguno de los 2 días (3 y 7 días). Sin embargo, aunque los resultados no sean significativos, las mayores fuerzas de rotura obtenidas corresponden a las anastomosis con PRP.Para la determinación de la activación plaquetar evaluamos los valores del componente plaquetar medio (MPC) en la sangre y PRP obtenidos durante el recuento (ADVIA 120). Los valores del MPC obtenidos en la sangre (21,3±1,58 g/dL) y en el PRP (20,3±1,39 g/dL), no mostraron diferencias significativas. Este hecho sugiere que el protocolo de preparación de PRP no produce una activación significativa de las plaquetas. Para la determinación de factores de crecimiento usamos el test (ELISA). Los niveles del TGF- &#946;1 han sido determinados en distintas fracciones que se obtenien durante la preparación del PRP: en el PRP (24312 pg/mL) y PRP gel, activado con cloruro cálcico (15504 pg/mL) y en el plasma pobre en plaquetas (PPP) - obtenido después de la segunda centrifugación (3715 pg/mL). En resumen con el protocolo de obtención de PRP utilizado en este estudio se obtuvo una elevada concentración e integridad plaquetar demostrado en los valores del MPC y los niveles de TGF-&#946;1. Palabras clave: anastomosis intestinal, cerdo, plaquetas, plasma rico en plaquetas, factores de crecimiento. / The principle of performing an intestinal anastomosis consists of apposing the proximal and distal edges of the segments and suturing. Compromised healing may lead to dehiscence and leakage, which is attended by high morbidity and mortality. In small animals the reported incidence of small intestinal dehiscence rates 7-16%, with 74 -80% of those patients dying. Attempts to enhance anastomotic healing have included the use of various surgical techniques and materials: quality of suture threads, use of staples; mechanical protection (endoluminal latex prosthesis, biofragmental ring) and local application of fibrin bioadhesive, fibrin and collagen patches, omental flaps with the most promising results.One of the most significant advances in the field of modern molecular biology and biochemistry in the last three decades are certainly growth factors and cytokines. Growth factors are biologically active polypeptides influencing growth, differentiation and metabolism of target cells through specific receptors. In the last several years a number of authors investigated the use of various recombinant growth factors (local or systemic) in order to enhance some of the phases of wound healing process.The disadvantage of these recombinant growth factors is that they are expensive and concerns exist about their safety in human administration. Alternatively, platelet-rich plasma (PRP), which is a volume of autogenous plasma that has a platelet concentration above baseline, is a proven source of growth factors. Recently, attention has been focused on cellular acceleration of the wound healing process by the use of platelet-rich plasma (PRP). This study determined the effects of PRP application on intestinal healing. Autologous PRP was obtained in 35 Large White breed pigs, males and females, weighting 55±5 Kg, which were submitted to two intestinal anastomosis procedures. Activated PRP was applied in one of the anastomosis sites, while the other site served as control. After 24 h, 48 h, 72 h, 96 h and 7 days, histology was performed, and after 72 h and 7 days breaking strength was also measured. After 24-48 h of PRP and control anastomosis, increasing inflammation was observed, followed by immature granulation tissue at 72-96 h. In PRP samples, the granulation tissue was more abundant. Although breaking strength in PRP samples was higher than in control samples, differences were not statistically significant. Although differences were subtle, PRP application on intestinal anastomosis seemed to slightly improve the anastomotic resistance due to an increase of inflammatory infiltrates and fibrosis.In this study we also determinate the platelet activation using a mean platelet component (MPC), we monitored MPC values on citrated whole blood and on PRP in all (47) animals used in this study obtained on (ADVIA 120) (a decrease in the MPC value occurs when platelets are activated and degranulated in vitro). The MPC values were not statistically significantly different (p<0.05) on citrated whole blood (21,3±1,58 g/dL) when compared to PRP (20,3±1,39 g/dL) values. In our opinion, this finding might be the result of the non significant platelets activation during PRP preparation process.We analyzed the amount of TGF-&#946;1 by enzyme-linked immunosorbent sandwich assay (ELISA) on PRP (obtained after double spin centrifugation), PPP (supernatant after second centrifugation) and PRP gel (obtained by mixing fresh PRP and calcium chloride). In our study, concentrations of TGF-&#946;1 on PRP fractions were different. The concentration of TGF-&#946;1 on PRP (24312 pg/mL) was significantly increased compared to PPP (3715 pg/mL). This supposes that the protocol for PRP obtention using a double spin centrifugation procedure employed in this study results in a high platelet concentrate and maintains a high quality biological product as measured by MPC values and TGF-&#946;1 levels.Keywords: intestinal anastomosis, pig, platelets, platelet-rich plasma, growth factors.
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Contribución del sistema nervioso simpático en la génesis y manteniniento de las alteraciones hemodinámicas de la hipertensión portal

Ezkurdia Garmendia, Nahia 10 July 2013 (has links)
Estudios previos de nuestro grupo demostraron que la hipertensión portal causa una importante inhibición de RNA mensajeros y proteínas implicadas en neurotransmisión adrenérgica, acompañada de una marcada atrofia simpática de los nervios que rodean la vasculatura mesentérica. Esta atrofia simpática local podría estar contribuyendo a la vasodilatación arterial esplácnica de la hipertensión portal. La hipótesis que se estableció a partir de los resultados obtenidos asumía que durante la hipertensión portal, los cambios de presión detectados en la vasculatura esplácnica podrían promover una señal a través de la vía sensitiva aferente hasta los núcleos de regulación cardiovascular del tronco cerebral, donde se desencadenaría una respuesta eferente responsable de provocar la atrofia simpática. Los resultados de la primera parte del trabajo confirman esta hipótesis y apoyan el papel de la atrofia simpática en la vasodilatación arterial esplácnica de la hipertensión portal, demostrando que mediante el bloqueo de la señal aferente con la neurotoxina capsaicina, de ratas con ligadura de la vena porta (PVL), se consigue evitar la atrofia simpática y las alteraciones hemodinámicas simultáneamente. Además, en ratas PVL, en el ganglio mesentérico superior (SMG) que contiene los somas de las neuronas adrenérgicas que inervan el mesenterio, se demostró un aumento en la expresión de neuromoduladores tales como el factor de crecimiento neuronal NGF y su precusor proNGF y la molécula quimiorepelente Semaforina 3A (Sema3A). Sema3A se localizó en el espacio interneuronal, alrededor de las neuronas adrenérgicas colocalizando con fibras positivas a VAChT. Este aumento en la expresión de moduladores neuronales también se evitó en ratas PVL tratadas con capsaicina. En la segunda parte del trabajo, con el objetivo de confirmar la vía neuronal en la hipertensión portal, se estudiaron dos estructuras intermediarias: el ganglio nodoso donde se confirmó un aumento de la señal aferente sensitiva, vía el nervio vago en animales con hipertensión portal y las neuronas simpáticas colinérgicas preganglionares del núcleo intermediolateral de la médula espinal donde se observó presencia de Sema3A, sugiriendo el origen del aumento de la expresión de Sema3A del SMG en las neuronas colinérgicas preganglionares. Por otro lado, se profundizó en el estudio de alteraciones en la expresión de neuromoduladores implicados en las vías de crecimiento/regresión axonal y supervivencia/muerte neuronal en el SMG de ratas PVL. La expresión de la forma activa del receptor de NGF, la tirosina quinasa A (TrkA), que conduce a la activación de las vías de supervivencia y crecimiento neuronal, se reveló disminuida en ratas PVL comparando con sham. Sin embargo, las vías de apoptosis y de retracción axonal se encontraron estimuladas en ratas PVL, exhibiendo una sobreexpresión significativa de Sema3A y de su receptor Neuropilina1, junto con un aumento en la expresión del receptor de proNGF, el receptor de neurotrofinas p75, la caspasa7 activa, la poli(ADP-ribosa) polimerasa inactiva y Rho kinasa. Finalmente, se probó la administración de un agonista de TrkA, la amida gambógica, en ratas PVL con el fin de estimular la vía de crecimiento y proliferación en detrimento de la vía apoptótica. Los resultados mostraron una mejora de las alteraciones hemodinámicas y de la atrofia simpática, a través de la activación de las vías de supervivencia y la inhibición de la cascada apoptótica y regresión axonal mediada por Rho kinasa. En conclusión, estos resultados indican que la alteración adrenérgica y la atrofia simpática en la vasculatura mesentérica durante la hipertensión portal tiene su origen en alteraciones de la neuromodulación que conducen a regresión simpática post-ganglionar y a apoptosis que contribuyen a la vasodilatación esplácnica. / We have previously demonstrated that portal hypertension causes an important inhibition of messenger RNA and proteins implicated in adrenergic neurotransmission and a marked atrophy in the sympathetic nerves surrounding mesenteric vasculature. This sympathetic atrophy could be contributing to the splanchnic vasodilation of portal hypertension. Our hypothesis assumed that during portal hypertension, pressure changes detected in the splanchnic vascular área could promote a signal through the visceral afferent sensitive pathway to the cardiovascular regulatory nuclei of the brainstem, triggering from there an efferent response resulting in sympathetic atrophy. The present results confirm this hypothesis and support the role for sympathetic atrophy in splanchnic arterial vasodilation of portal hypertension, showing that by blocking the sensitive afferent signal with capsaicin, the splanchnic sympathetic atrophy can be prevented in those animals where, simultaneously, the hemodynamic alterations were normalized. Indeed, in the superior mesenteric ganglia (SMG) of PVL, which contains the somas of adrenergic neurons that innervate the mesenteric vasculature, an increase in neuronal modulators such as nerve growth factor (NGF), its precursor proNGF and the chimiorepelent Semaphorine 3A (Sema3A) molecule was demonstrated. Sema3A localized in the interneuronal space surrounding adrenergic neurons and colocalizing with VAChT positive fibers. This increment in neuronal modulators was also avoided in capsaicin treated PVL. In the second part of the study, the neural pathway of portal hypertension was confirmed through the analysis of two intermediate structures. An increase in neuronal afferent activity was demonstrated in the vagal nodose ganglia of PVL rats and presence of Sema3A in the cholinergic sympathetic preganglionic neurons of the intermediolateral nucleus of the spinal cord suggested that it was the origin of the increased expression of Sema3A in the SMG. We also investigated alterations on neuromodulators and signaling pathways that, in the SMG of PVL rats, lead to axonal regression or apoptosis. We found that the active form of tyrosine kinase receptor A (TrkA), leading to proliferation and survival signaling was decreased in PVL compared to sham rats. In contrast, the apoptotic and axonal retraction pathways were stimulated in PVL, demonstrated by a significant overexpression in Sema3A and its receptor Neuropilin1, together with an increase in the neurotrophic receptor p75, the active caspase7 and the inactive poly(ADP-ribose) polymerase kinase expression. Finally, we tested the administration of a TrkA agonist, gambogic amide, in PVL rats. Our results showed an amelioration of hemodynamic alterations and sympathetic atrophy, through the activation of survival pathways and the inhibition of the apoptotic cascade and axonal regression mediated by Rho kinase. In conclusion, these results suggest that the adrenergic alterations and sympathetic atrophy observed in mesenteric vessels during portal hypertension is caused by alterations on neuromodulation leading to postganglionic sympathetic regression and apoptosis contributing to splanchnic vasodilation.
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MHC i malalties autoimmunitàries: Contribució específica dels al∙lels de susceptibilitat

Guitart Marín, Carol 19 December 2014 (has links)
La susceptibilitat individual a l’autoimmunitat pot estar determinada per una combinació de polimorfismes específics de gens que codifiquen per a múltiples citocines, per al complex principal d'histocompatibilitat (MHC) , molècules d'adhesió i proteïnes cel·lulars. En aquest treball ens hem volgut centrar en l’associació d’al·lels del MHC amb les malalties immunitàries. L'explicació actual per a aquest tipus d'associacions proposa que les molècules del MHC que s'han trobat associades, uneixen de manera eficient als autoantígens lligats a la malaltia, la qual cosa dóna lloc a una resposta immune perifèrica contra els autoantígens. En aquest treball hem volgut aprofundir en la caracterització dels repertoris de pèptids presentats per molècules de classe II associades a autoimmunitat en humans i en ratolí, a partir dels pèptids naturals associats. Els mètodes de predicció de la unió d’un pèptid a un determinat MHC són importants per poder identificar aquells segments d’una proteïna que seran presentats a les cèl·lules T, i per tant ens poden ser útils a l’hora de generar vacunes peptídiques o pel desenvolupament de teràpies antigen-específiques. En humans, l’al·lel HLA-DR3 és conegut per la seva associació a malalties com la diabetis tipus 1 o la malaltia de Graves-Basedaw (GB) i en ratolíns el complexe H-2d s’associa a malalties tipus th2, entre elles també la malaltia GB, i diversos càncers. En aquest estudi s’ha fet servir el mètode establert al nostre laboratori basat en l’aïllament dels pèptids per immunoafinitat i l’anàlisi per espectròmetria de masses d’alta resolució. / SUMMARY: Individual susceptibility to autoimmunity may be determined by a combination of specific polymorphisms of genes encoding multiple cytokines by the major histocompatibility complex (MHC) proteins and cell adhesion molecules. In this study we wanted to focus the association of MHC alleles with immune diseases. The current explanation for these associations suggests that the MHC molecules that have been associated autoantigens bind efficiently linked to the disease, which leads to a peripheral immune response against those autoantigens. In this study, we wanted to characterize the repertoire of peptides presented by class II molecules associated with autoimmunity in humans and mice from natural peptides. The methods for predicting peptide binding to a particular MHC is important to identify those segments of a protein that will be presented to T cells, and therefore it can be useful in generating peptide vaccines or the development of antigen-specific therapies. In humans, the allele HLA-DR3 is known for its association with type 1 diabetes and Graves disease (GD) and the complex H-2d mice is associated with Th2 type disease as GD and various cancers. For this characterization, we used a method established in our laboratory based on the isolation of peptides by immunoafinity and analysis by high resolution mass spectrometry
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The diversity of dinoflagellates belonging to the gymnodiniales from the catalan coast (NW Mediterranean Sea)

Reñé Vicente, Albert 28 February 2014 (has links)
Dinoflagellates are one of the most abundant and diverse groups of microalgae. Many dinoflagellates are covered with cellulose plates, whereas others lack these plates and are hence referred to as athecate or unarmoured. Unarmoured species have been historically poorly characterized because they deform when fixed with traditional methods. Most unarmoured genera are included within the order Gymnodiniales and are differentiated by morphological characters, but the recent combination of morphological observations with phylogenetic data concludes that molecular phylogenies do not support the "classical" morphological criteria used to distinguish the genera. It is also known that the order Gymnodiniales is not monophyletic. Consequently, the taxonomy of dinoflagellates has shifted to a combination of morphology and molecular information. The widespread use of molecular techniques has enabled detailed studies on the systematics of a lot of groups. Although many dinoflagellates are not easily cultivable and cannot be sequenced by standard techniques, the single-cell PCR technique has allowed obtaining sequences from a single cell by taking advantage of the large copy number of the ribosomal genes. Extensive identifications of dinoflagellates present in the NW Mediterranean Sea were carried out between the 1960s and 1980s. However, the diversity of unarmoured dinoflagellates was not suitably characterized because of the use of fixed samples and the lack of molecular tools. This thesis studies the diversity of dinoflagellates belonging to the Gymnodiniales order from the Catalan coast, as a representative site of the NW Mediterranean Sea. This thesis presents a revision of their taxonomy by combining morphological studies of live specimens with the respective phylogenetic information. Given that the phylogeny of most of the studied organisms had not been previously determined and the evidence that Gymnodiniales is not monophyletic, a secondary objective was to study the phylogenetic relationships of species. The D1-D2 region of the LSU rDNA sequence was selected to conduct the SC-PCR, but SSU rDNA sequences were obtained when necessary. The combination of morphological and molecular data has led to the identification of 58 unarmoured species belonging to the order Gymnodiniales. Ten morphospecies are detected for the first time in the Mediterranean Sea, and eight, for the first time along the Catalan coast (Chapter 1 and 2). Additionally, the application of single-cell PCR has resulted in the sequencing of 43 unarmoured species, 25 of them for the first time (Chapters 1 and 2). It has also allowed the detection and characterization of species previously undescribed, resulting in the erection of two new species: Gymnodinium litoralis (Chapter 3) and Polykrikos tanit (Chapter 4). Additionally, the toxic species Cochlodinium polykrikoides was detected for the first time along the Catalan coast. Most populations formed a newly differentiated ribotype, but others were included within a previously known one, demonstrating their coexistence in the Mediterranean Sea (Chapter 5). Finally, a Ceratoperidinium specimen was sequenced for the first time and a new phylogenetic clade was obtained, along with other unarmoured dinoflagellates, including Ceratoperidinium margalefii, Gyrodinium falcatum, which was transferred to the genus Ceratoperidinium, three Cochlodinium species, and two Gymnodinium-like organisms. This resulted in the emendation of the Ceratoperidiniaceae family and the genus Ceratoperidinum (Chapter 6). The correct identification of the species has allowed to conclude that there is a high diversity of unarmoured dinoflagellates in the Catalan coast, and to discuss the implications on the distribution and biogeography of the species at a Mediterranean level, as C. polykrikoides (Chapter 5), or globally, as for Gyrodinium spirale (Chapter 2) / Les dinoflagel•lades són un dels grups més abundants i diversos de microalgues. Moltes espècies estan cobertes amb plaques de cel•lulosa, mentre que d’altres que no en tenen són conegudes com a atecades o nues. Les espècies atecades han estat generalment mal caracteritzades ja que es deformen quan són fixades amb mètodes tradicionals. La majoria de gèneres atecats s'inclouen dins l’ordre Gymnodinials i es distingeixen per caràcters morfològics, però la combinació recent d'observacions morfològiques amb dades filogenètiques conclou que les filogènies moleculars no suporten els criteris morfològics clàssics utilitzats per distingir els gèneres. També es coneix que l’ordre Gymnodinials no és monofilètic. Per tant, la correcta taxonomia de dinoflagel•lades requereix una combinació d’informació morfològica i molecular. L'ús generalitzat de tècniques moleculars ha permès estudis detallats sobre la sistemàtica de molts grups. Tot i que moltes dinoflagel•lades no són fàcilment cultivables i no es poden seqüenciar mitjançant tècniques estàndards, la tècnica de single-cell PCR ha permès obtenir seqüències a partir d'una sola cèl•lula, aprofitant el gran nombre de còpies dels gens ribosòmics que les dinoflagel•lades contenen. Entre els anys 1960 i 1980 es van dur a terme identificacions extensives de les dinoflagel•lades existents al litoral català. Tanmateix, no es va caracteritzar adequadament la diversitat de dinoflagel•lades atecades degut a l’ús de mostres fixades i la manca d'eines moleculars. Aquesta memòria presenta l'estudi de la diversitat d'espècies de l’ordre Gymnodinials a la costa catalana com a representativa del NO del Mar Mediterrani, entre els anys 2010-2013. L'estudi presenta una revisió de la seva taxonomia pel que s'han combinant estudis morfològics d’exemplars vius amb la corresponent informació filogenètica. Atès que la filogènia d’alguns dels organismes estudiats no s'havia determinat amb anterioritat i l'evidència que l’ordre Gymnodinials no és monofilètic, el segon objectiu ha estat estudiar les relacions filogenètiques de les espècies. Es va seleccionar la regió D1-D2 del 28s rDNA per dur a terme els anàlisis amb SC-PCR, però també es van obtenir seqüències del 18s rDNA quan ha estat necessari. La combinació de les dades morfològiques i moleculars ha permès la identificació inequívoca de 58 espècies atecades pertanyents a l’ordre Gymnodinials. D’aquestes, es detecten deu morfoespècies per primera vegada a la mar Mediterrània, i vuit per primera vegada al litoral català (Capítols 1 i 2). A més, l'aplicació de la SC-PCR ha permès seqüenciar 43 espècies atecades, 25 de les quals per primera vegada (Capítols 1 i 2). També ha permès la detecció i caracterització d’espècies no descrites prèviament, que ha resultat en la descripció de les noves espècies Gymnodinium litoralis (Capítol 3) i Polykrikos tanit (Capítol 4). A més, es va detectar per primera vegada l'espècie tòxica Cochlodinium polykrikoides al litoral català. La majoria d’aquests organismes pertanyien a un nou ribotip, però d’altres quedaren inclosos en un ribotip ja conegut, demostrant la seva coexistència al Mar Mediterrani (Capítol 5). Finalment, es va seqüenciar per primera vegada un espècimen del gènere Ceratoperidinium i es va obtenir un nou grup filogenètic, juntament amb d’altres dinoflagel•lades atecades, incloent Ceratoperidinium margalefii, Gyrodinium falcatum, que va ser transferit al gènere Ceratoperidinium, tres espècies de Cochlodinium, i dos organismes semblants a Gymnodinium. Això va donar lloc a l'esmena de la família Ceratoperidiniaceae i del gènere Ceratoperidinum (Capítol 6). La correcta identificació de les espècies ha permès concloure que la costa catalana presenta una gran diversitat de dinoflagel•lades atecades, i discutir les implicacions en la distribució i biogeografia de les espècies a nivell de la Mediterrània, com el cas de C. polykrikoides (Capítol 5), o global, com el cas de Gyrodinium spirale (Capítol 2)
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Assessment of prepubertal sheep oocyte competence for in vitro embryo production by the Brilliant Cresyl Blue test.

Gracia Catalá, Maria 03 May 2012 (has links)
La calidad de los oocitos es sinónimo de competencia oocitaria y se define como la capacidad de un oocito para reanudar la meiosis, dividirse después de la fertilización, desarrollarse hasta la etapa de blastocisto, inducir la preñez y conseguir el nacimiento de un animal sano. La selección de los oocitos más competentes es un punto clave en los programas de producción in vitro de embriones (PIVE). El test de Azul de Cresol Brillante (BCB) es un método no invasivo que separa los oocitos que han finalizado su crecimiento (BCB+: citoplasma azul) de los oocitos con la enzima G6PDH activa o oocitos en proceso de crecimiento (BCB-: citoplasma incoloro). En esta tesis, hemos llevado a cabo 3 estudios para probar la capacidad del BCB en seleccionar los oocitos más competentes para la producción in vitro de embriones utilizando corderas como donantes de oocitos. Además se estudiará la competencia oocitaria en relación con el citoplasma y factores moleculares, sus respuestas a las diferentes técnicas de fecundación y nuevos medios de maduración para mejorar la PIVE. En el Experimento 1, se analizaron diferentes concentraciones del BCB (13, 26, 39 y 52 µM) y los oocitos fueron MIV-FIV y CIV. Se evaluó: diámetro de los oocitos, actividad mitocondrial, actividad del factor promotor de la maduración (MPF), la expresión de genes relacionados con el metabolismo (ATP1A1 y COX1) y la función constitutiva de la célula (CPEB y S100A10) y el desarrollo hasta el estadio de blastocisto. Los resultados mostraron que 13 µM de BCB es una concentración adecuada que diferencia los oocitos más grandes (BCB+: 123,66 µm), competentes para desarrollar hasta blastocisto (21%) y con más células (69,71±6,19) que los BCB- (106,82 µm, 9% y 45,91±3,35, respectivamente). La actividad mitocondrial fue mayor en los BCB+ que en los BCB- (3369 y 1565 unidades arbitrarias, respectivamente) y también la actividad de MPF (1,479±0,09 y 1,184±0,05 densidad óptica, respectivamente). La expresión de genes no mostró correlación con la calidad de los oocitos. El objetivo del experimento 2 fue mejorar la producción in vitro de los oocitos BCB- mediante la adición de insulina transferrina selenio y ácido ascórbico durante 12 y 24 h de la MIV. El MPF y el contenido de ATP se midieron antes y después de la MIV. Los resultados no mostraron diferencias en la producción de blastocistos entre los oocitos BCB-. El MPF y el ATP aumentaron en todos los grupos (P <0,001) después de la MIV. En el Experimento 3 se estudiaron técnicas de fecundación como la FIV, ICSI y la activación partenogénetica (AP) en los oocitos BCB+ y BCB-. Se analizó el contenido del ATP intracelular. Los oocitos BCB+ tuvieron un desarrollo hasta blastocito significativamente mayor tras la FIV y la AP (31,7% y 20,5%, respectivamente) que los BCB- (6,7% y 8,8%, respectivamente). Sin embargo los oocitos inyectados (ICSI) no mostraron diferencias en los blastocistos producidos entre los BCB+ y BCB- (14,3% vs 11,8%, respectivamente). Los oocitos BCB+ mostraron tener mayor concentración de ATP que los BCB-. Finalmente podemos concluir que el test del BCB es una metodología fácil, rápida y adecuada para seleccionar los oocitos de corderas más competentes. Los oocitos BCB+ mostraron una mayor producción de blastocistos, actividad mitocondrial y del MPF y mayor contenido de ATP que los BCB-. El test de BCB es un método útil para ser incorporado en los protocolos de PIVE cuando se trabaja con un gran y heterogéneo número de oocitos. Sin embargo este test es menos interesante cuando se trabaja con un pequeño número de oocitos, como en laparoscópica o ICSI. / The oocyte quality is used as synonymous of oocyte competence defined as the ability of an oocyte to resume meiosis, cleave following fertilization, develop to the blastocyst stage, induce a pregnancy and bring the offspring to term in good health. The selection of more competent oocytes is an important point in in vitro embryo production programs. The Brilliant Cresyl Blue (BCB) test has been successfully used as a non invasive methodology to classify oocytes according to their cytoplasm coloration as grown (BCB+: blue cytoplasm) or growing (BCB-: colorless cytoplasm) oocytes. To our knowledge there are no previous reports using this test to select competent oocytes in sheep. We have carried out 3 studies to test the ability of the BCB to select the most competent prepubertal sheep oocytes for in vitro blastocyst embryo production. Furthermore, we pretend to improve the knowledge about oocyte competence related to their cytoplasmic and molecular performances, their responses to different techniques of fertilization and to test new maturation media to improve the blastocyst production. In Experiment 1, different concentrations of the BCB test (13, 26, 39 and 52 µM) were analyzed. After BCB culture all of oocytes were IVM-IVF and IVC. The parameters assessed in this study were: oocyte diameter, mitochondrial activity, maturation-promoting factor (MPF) activity, mRNA relative expression (RE) of genes related to metabolism (ATP1A1 and COX1) and constitutive function of the cell (CPEB and S100A10) and the blastocyst development. The results showed that 13 µM BCB during 60 min could be a suitable concentration to differentiate largest (BCB+, 123.66 µm) and most competent oocytes to develop to the blastocyst stage (21%) and with a higher number of cells (69.71±6.19 S.E.M.) compared with non-stained BCB- oocytes (106.82 µm, 9% and 45.91±3.35 S.E.M., respectively). Mitochondrial activity, assessed by MitoTracker Orange CMTMRos probe, was significantly higher in BCB+ than in BCB- oocytes after in vitro maturation (3369 and 1565 Arbitrary Units, respectively) and the MPF activity, assessed by CDC2 kinase activity assay, showed significantly higher activity at metaphase II stage in BCB+ than in BCB- oocytes (1.479±0.09 and 1.184±0.05 optical density, respectively). The mRNA RE of the different genes analyzed in this work did not show a correlation with the oocyte quality. In Experiment 2, the objective was to improve blastocyst production of small (BCB-) oocytes by addition of Insulin Transferrin Selenium and Ascorbic Acid during 12 and 24 h of IVM. MPF and ATP content were measure before and after IVM. Results showed no differences in blastocyst production between BCB oocytes. The MPF and ATP increased in all groups (P<0.001) after the IVM. In Experiment 3, the aim was to test the blastocyst production after IVF, ICSI and PA of BCB+ and BCB- oocytes. ATP content was analyzed. BCB+ oocytes developed significantly higher up to the blastocyst stage after IVF and PA (31.7% and 20.5%, respectively) than BCB- (6.7% and 8.8%, respectively) oocytes. However, ICSI treated oocytes did not show these differences between BCB+ and BCB- oocytes (14.3% vs 11.8%, respectively). BCB+ oocytes had significantly more ATP content than BCB- oocytes. Finally we can conclude that the BCB test is an easy, fast and suitable methodology to select the more competent sheep oocytes. Good quality oocytes (BCB+) showed higher blastocyst production, mitochondrial and MPF activity and ATP content than BCB- oocytes. The BCB test is a useful method to be incorporated in the embryo production protocol where a large and heterogeneous number of oocytes are use to be in vitro fertilized. However, BCB test is less interesting when working with a small number of oocytes such as in Laparoscopic Ovum Pick Up (LOPU) or ICSI.

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