Target of rapamycin est une large kinase conservée chez la plupart des eucaryotes. Elle est au centre d’une voie de signalisation régulant la croissance, le métabolisme en fonction de l’environnement et a été largement étudiée chez l’homme du fait de son implication dans des maladies telles que le cancer. Chez les plantes, son étude est moins avancée mais le développement d’inhibiteurs ATP compétitifs chez l’homme a offert de nouvelles possibilités pour la recherche en biologie végétale. En effet, l’utilisation d’un inhibiteur de TOR nous a permis de réaliser le criblage d’une banque de mutants ethyl méthansulfonate et de découvrir une nouvelle cible de TOR : YAK1. Cette dernière régule la croissance en inhibant la prolifération. Le criblage de mutants a également permis de découvrir des mutations dans TOR affectant sa sensibilité ou son affinité pour l’inhibiteur. Ceci offre un nouvel outil pour étudier la fonction de TOR de plantes. / Target of rapamycin is a large kinase existing in most eucaryots such as plants and animals. It is at the center of a signaling pathway regulating growth and metabolism in response to environmental changes, which has been the subject of many studies in humans because of its implication in diseases like cancer. However in plants, the exploration of this pathway is less advanced but the development of ATP competitive inhibitors in humans has offered new possibilities for plant research. Indeed, the use of a TOR inhibitor has allowed us to screen an ethyl methansulfonate mutant bank and discover a new target of TOR: YAK1. The latter regulates growth by inhibiting proliferation notably through cyclin-dependant kinase inhibitors. The screen also allowed us to uncover TOR mutations which potentially affect TOR activity and/or affinity to the inhibitor. This offers a new tool for the study of TOR function in plants.

L’activité RNase P est l'activité essentielle qui élimine les séquences 5' supplémentaires des précurseurs d'ARN de transfert. "PRORP" (PROteinaceous RNase P) définit une nouvelle catégorie de RNase P uniquement protéique. Avant la caractérisation de PRORP, on pensait que les enzymes RNase P étaient universellement conservées sous forme de ribonucléoprotéines (RNP). La caractérisation de PRORP a révélé une enzyme avec deux domaines principaux, un domaine N-terminal contenant plusieurs motifs PPR et un domaine NYN C-terminal portant l’activité catalytique. Nous avons utilisé une combinaison d'approches biochimiques et biophysiques pour caractériser le complexe PRORP / ARNt. La structure du complexe en solution a été déterminée par diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS) et les Kd des interactions de différents mutants de PRORP avec l’ARNt ont été déterminées par ultracentrifugation analytique. Notre analyse révèle un cas intéressant d'évolution convergente. Il suggère que PRORP a développé un processus de reconnaissance de l'ARN similaire à celui des RNase P RNP. Par ailleurs, nous avons mis en place une approche de co-immunoprécipitation de PRORP avec l’ARN afin de définir le spectre de substrats des RNase P protéiques. / RNase P is the essential activity that removes 5'-leader sequences from transfer RNA precursors. “PRORP” (PROteinaceous RNase P) defines a novel category of protein only RNase P. Before the characterization of PRORP, RNase P enzymes were thought to occur universally as ribonucleoproteins (RNP). The characterization of PRORP revealed an enzyme with two main domains, an N-terminal domain containing multiple PPR motifs and a C-terminal NYN domain holding catalytic activity. We used a combination of biochemical and biophysical approaches to characterize the PRORP / tRNA complex. The structure of the complex in solution was determined by small angle X-ray scattering and Kd values of the PRORP / tRNA interaction were determined by analytical ultracentrifugation. We also analyzed direct interaction of a collection of PPR mutants with tRNA in order to determine the relative importance of individual PPR motifs for RNA binding. This reveals to what extent PRORP target recognition process conforms to the mode of action of PPR proteins interacting with linear RNA. Altogether, our analysis reveals an interesting case of convergent evolution. It suggests that PRORP has evolved an RNA recognition process similar to that of RNP RNase P. Moreover, we also implemented a PRORP-RNA co-immunoprecipitation approach to determine the full extent of PRORP substrates.

Chez les plantes comme chez les animaux, les protéines du groupe Polycomb (PcG) jouent des rôles essentiels dans les processus développementaux par la répression de l'expression des gènes. Ces protéines fonctionnent en complexes multi-protéiques; dont les mieux caractérisés sont Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1) et PRC2. Bien que PRC2 a été étudié extensivement chez Arabidopsis, ce n’est que récemment que des composants de PRC1 ont été identifiés chez les plantes et leur mécanisme de fonctionnement reste peu conclusif. Dans mes travaux de thèse, j’ai caractérisé AtRING1, un sous-unité essentiel du PRC1, et AtZRF1, une protéine proposée comme lecteur de l’histone H2A monoubiquitinée (H2Aub1) en aval du fonctionnement du PRC1. Mes résultats montrent qu’une perte-de-fonction totale de AtRING1A, par ‘CRISPR/Cas9 gene-editing’, causes une létalité partielle embryonnaire et la dédifférenciation cellulaire de la plantule d’Arabidopsis. Les mutations du domaine RAWUL au C-terminal de AtRING1A sont plus tolérées mais induisent certains défauts sur la croissance végétative, la floraison, l’organogénèse, et la production des graines. Mes analyses moléculaires révèlent que ces mutations du domaine RAWUL réduisent H2Aub1 et augmentent l’expression de plusieurs gènes essentiels dans la régulation du développement de la plante. Ainsi, mes données ont permis à établir une fonction primordiale de AtRING1 et à attribuer un rôle de son domaine RAWUL dans la déposition de H2Aub1 et répression des gènes in vivo. Nos analyses sur AtZRF1 ont permis à détailler son rôle sur la division and différenciation cellulaire. / In plants as in animals, the Polycomb Group (PcG) proteins play key roles in diverse developmental processes by repressing the expression of genes. These proteins work in multi-protein complexes, among them the best characterized ones are Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1) and PRC2. Although PRC2 was extensively studied in Arabidopsis, it is only recently that components of PRC1 were identified in plants and their function mechanism remains largely elusive. My thesis work focused on the characterization of AtRING1A, one of the PRC1 core subunits, and of AtZRF1, a protein proposed as a reader of the histone H2A-monoubiquitin (H2Aub1) downstream to the PRC1 function. My results show that a total loss-of-function of AtRING1A, by CRISPR/Cas9 gene editing, leads to partial embryonic lethal and callus-formation of seedlings in Arabidopsis. Several mutations within the RAWUL domain at the C-terminus of AtRING1A are better tolerated and induce several defects in plant vegetative growth, flowering time, floral organ formation and seed production. My molecular data indicate a role of the RAWUL domain in H2Aub1 deposition in vivo and suppression of several key developmental genes. Our characterization of loss-of-function of AtZRF1 provides important detailed information about its function in the regulation of cell division and cell differentiation.

L’acide carnosique (CA) et le carnosol (CARN), deux diterpènes spécifiques des Lamiacées, sont en abondance dans le romarin. Le CA extrait de cette plante est largement utilisé dans l’industrie pour ses propriétés antioxydantes portées par le groupe catéchol. Malgré beaucoup d’applications, les rôles et les modes d'action de ces composés in planta n’ont reçu que peu d’attention. Des analyses par HPLC-UV et imagerie d’autoluminescence révèlent que le CA et le CARN protègent les lipides contre des oxydations in vitro par les ERO. Lors de la préservation des lipides, des analyses de MS indiquent que le CA est oxydé en une variété de dérivés alors que le CARN résiste. L’utilisation d’une sonde de spin et de la spectroscopie RPE montre que le CA est un piégeur chimique des ERO. L’action inhibitrice du CARN sur des oxydations de lipides induites in vitro ou in vivo indique que le CARN interfère avec le processus de peroxydation lipidique. Des études in vivo de deux variétés de romarin contrastées en CA exposées à un stress photooxydant montrent que le CA protège les lipides in planta. Une étude des variations de CA et de CARN en fonctions des facteurs abiotiques met en avant qu’une forte intensité lumineuse et des fluctuations de températures favorisent la réponse antioxydante du CA qui s’oxyde en CARN. Des analyses de RT-qPCR montrent que les facteurs abiotiques ne stimulent pas la voie de biosynthèse du CA. En condition de stress oxydant, le CA du romarin préserve les membranes par piégeage des ERO produisant des dérivés d’oxydation, dont le CARN, qui protègent aussi les membranes en bloquant la réaction en chaîne de la peroxydation lipidique. / Carnosic acid (CA) and carnosol (CARN), two diterpenes specific of the Lamiaceae, are highly abundant in rosemary species. CA extracted from rosemary is used by industries for its antioxidative features, endowed by it catechol group. Despite numerous applications, the role and the mode of action of CA in planta has received little attention. Analyses, using HPLC-UV and luminescence imaging revealed that CA and CARN protect lipids from in vitro oxidation by ROS. Upon ROS oxidation of lipids, MS analyses indicated that CA was oxidized into various derivatives while CARN resisted. Using spin probes and EPR detection, we confirmed that CA, rather than CARN, is a ROS quencher. The inhibitory effect of CARN on lipid peroxidation induced in vitro or in vivo indicated that CARN interferes with lipid peroxidation. In vivo studies of two rosemary varieties contrasted in their CA content exposed to photooxidative stress showed that CA protects lipids in planta. A study of CA and CARN variations in response to abiotic factors showed that high light and temperature fluctuations lead to CA oxidation into CARN. RT-qPCR analyses revealed that abiotic factors do not stimulate CA biosynthesis genes. Under oxidative stress condition, rosemary CA preserves biological membranes by ROS scavenging, hence producing a set of oxidative derivatives, including CARN, which protect biological membranes by blocking the lipid peroxidation chain reaction.

Des études chez les animaux ont montré que ZRF1 a une fonction lectrice au niveau de H2Aub1 dans la dérépression de gènes réprimés par polycomb. Deux gènes homologues au gène humain ZRF1 ont été identifiés dans le génome d'Arabidopsis, et ont par la suite été appelés AtZRF1 a etAtZRF1 b. La caractérisation fonctionnelle de ces gènes n'a pas encore été rapportée. Ma première objective était d'obtenir des connaissances générales sur AtZRF1 a et AtZRF1 b. Tous les deux sont exprimés dans des plantes d'Arabidopsis et la protéine AtZRF1 b est localisée dans le noyau et dans le cytoplasme. En plus, nous avons trouvé que la protéine AtZRF1 b lie H2Aub1 avec les mêmes caractéristiques que la protéine ZRF1 humaine. J'ai utilisé les outils génétiques puissants disponibles pour Arabidopsis pour étudier la fonction d'AtZRF1 a et AtZRF1 b. Plusieurs lignées d'insertion de T-DNA indépendantes ont été identifiées. A cause d'une rédondance fonctionelle,des mutants simples n'ont pas de défauts de développement évidents. C'est pourquoi j'ai étudié un mutant double qui montrent une perte de fonction pour les deux gènes AtZRF1 a et AtZRF1 b. Ce double mutant révèle des rôles importants pour ces gènes dans la croissance et le développement,qui vont de la prolifération cellulaire et la différenciation jusqu'au contrôle du temps de floraison. J'ai ensuite étudié les rôles d'AtZRF1 a et AtZRF1 b dans la régulation de la transcription et j'ai constaté que AtZRF1 a et AtZRF1 b ont une fonction similaire a PRC1. Finalement, j'ai étudié les niveaux de H3K4me3, H3K27me3 et H2Aub1 dans la chromatine de certains gènes dont l'expression est perturbée dans les doubles mutants. Les résultats montrent que la déubiquitination de H2Aubi1 n'est pas un événement majeur dans la régulation de la transcription chez Arabidopsis. / Studies in animais show that ZRF1 can read the histone H2AK119ub1 modification in the derepression of polycomb-repressed genes. Two homologs of human ZRF1 have been identified in the Arabidopsis genome, and here in after are named AtZRF1 a and AtZRF1 b. So far, their functional characterization had not been reported. My first objective was to acquire basic knowledge about AtZRF1 a and AtZRF1 b. Both are broadly expressed in Arabidopsis plants and the AtZRF1 b protein is localized in the nucleus and thecytoplasm. Moreover, we found that AtZRF1 b binds H2Aub1 with characteristics similar to those previously reported for the human ZRF1 protein. I subsequently used the powerful genetic tools available in Arabidopsis to investigate the AtZRF1 a and AtZRF1b function. Several independent T-DNA insertion Arabidopsis mutant lines were identified. Because of functional redundancy, single mutants have no obvious developmental defects. I therefore focused on double mutants displaying loss of function of both AtZRF1a and AtZRF1 b. The study of a double mutant revealed important roles for these genes in plant growth and development ranging from cell proliferation and differentiation to flowering time control.I then investigated the roles of AtZRF1 a and AtZRF1 b in gene transcription regulation and found that AtZRF1a and AtZRF1 b function in a way that is partially similar to PRC1 function. Lastly, I investigated H3K4me3, H3K27me3 and H2Aub1 levels in the chromatin regions of some expression-perturbed genes in double mutants. The results show that ZRF1-mediated deubiquitination of H2Aub1 is not a major event in transcription regulation in Arabidopsis.

Les plantes produisent une grande diversité de produits naturels parmi lesquels les isoprénoïdes prédominent. Ces molécules ont des fonctions essentielles pour la croissance et le développement : hormones végétales, régulateurs de croissance comme les brassinostéroïdes, pigments photosynthétiques, tous agissant sur des processus biologiques majeurs. Ainsi, la germination, la floraison, la tolérance aux stress thermiques et hydriques, ou la production de semences, sont contrôlées par l’action d’isoprénoïdes. Le but de mon projet est d’identifier par une sélection génétique les éléments régulateurs de l’homéostasie des isoprénoïdes. Pour cela, j’ai réalisé le criblage de suppresseurs de défaut de croissance dans deux mutants de biosynthèse d’isoprénoïdes chez Arabidopsis thaliana et un mutant de signalisation de brassinostéroïdes chez Hordeum vulgare. J’ai par ailleurs étudié la voie de biosynthèse de stérols spécifique ayant lieu dans un type cellulaire particulier, le tube pollinique en croissance. / Plants produce a great diversity of natural compounds, among which isoprenoids prevail. These molecules have essential functions for growth and development: plant hormones, growth regulators as brassinosteroids, photosynthetic pigments, acting on major biological processes. Thus, germination, flowering, heat and draught stress tolerance, or seed production are controlled by the action of isoprenoids. The aim of my project is to identify by genetic selection the regulators of isoprenoid homeostasis. For this, I carried out genetic screens for suppressors of growth defects in two isoprenoid biosynthesis deficient Arabidopsis thaliana mutants and a brassinosteroid signaling Hordeum vulgare mutant. The second part of my project was focused on the specific sterol biosynthetic pathway occurring in a specialized cell type, the germinating pollen tube.

Chez Arabidopsis thaliana, les protéines SIAMESE-RELATED (SIM/SMR1 à 13) forment une famille plante-spécifique d’Inhibiteurs de Kinase Cycline-dépendante (CKI), homologue des Kip-Related Proteins. SIM et SMR1 sont des régulateurs positifs de la transition du cycle mitotique vers l’endoréplication. L’expression des gènes SIM/SMR est induite en réponse àdes stress. L’un des stress abiotiques majeurs pour les plantes est la sécheresse. Les SIM/SMR pourraient être dégradées par la voie de la protéolyse spécifique de l’Ubiquitin Proteasome System (UPS). Les SIM/SMR sont de bons candidats pour relier l'activité du cycle cellulaire aux stimuli de l'environnement. Ce travail a démontré l’implication de la protéolyse UPS dans le contrôle posttraductionnel de tous membres SIM/SMR testés. Il démontre que SIM, SMR2 et SMR1 sont nécessaires à l’endoréplication des cellules foliaires. Lors d’un stress hydrique, l’expression des gènes SIM, SMR1, SMR3 et SMR5 est induite. Le profil spatio-temporel de ces inductions a mis en évidence deux groupes de gènes avec des fonctions distinctes. Les mutants sim, smr5 et sim.smr1.smr2 sont hypersensibles au stress hydrique. / In Arabidopsis thaliana, the SIAMESE-RELATED proteins (SIM/SMR1 to 13) are a plantspecific family of Cyclin-dependent Kinase Inhibitors (CKIs), homologous to the Kip-Related Proteins. SIM and SMR1 are positive regulators of the switch from mitotic cycle to endoreplication. The expression of SIM/SMRs genes is induced in response to stress. One of the major abiotic stress for plants is the drought stress. The SIM/SMRs could be degraded through the specific proteolysis of Ubiquitin Proteasome System (UPS). The SIM/SMRs proteins are good candidates to link cell cycle activity with environmental stimuli.This research work has shown the involvement of the UPS proteolysis in the posttranslational control of all the tested members of the SIM/SMR family. It also shows that SIM, SMR2 and mostly SMR1 are required in endoreplication of leaf cells. During drought stress, the expression of SIM, SMR1, SMR3 and SMR5 genes is induced. The spaciotemporal pattern of those inductions revealed two groups of genes with distinct functions. In addition, the sim, smr5 and sim.smr1.smr2 loss-of-function mutants tested are hypersensitive to drought stress.

Chez les plantes, le RNA silencing (RNAi) est le principal mécanisme de défense antivirale. Il est opéré par de petites molécules d’ARN (siRNA), de 21-22nt de long, générées à partir de l’ARN viral par DCL4 et DCL2, respectivement. Ces siRNA confèrent la séquence-spécificité des réactions de défense intracellulaire et peuvent se déplacer à longue distance pour immuniser les cellules saines. En conséquence, les virus ont développé des protéines (VSRs) capables de supprimer ces deux aspects du RNAi. Au cours de cette thèse, j’ai pu démontrer in vivo que la protéine P15 du Peanut clump virus (PCV) est capable de séquestrer les siRNA de 21 et 22nt et qu’elle bloque le mouvement de ces derniers plus efficacement que ceux de 21nt. Pour compenser cette faiblesse, au cours de l’infection par le PCV, P15 est transportée à l’intérieur des peroxisomes en association avec les siRNA qu’elle séquestre. Le confinement des siRNA mobiles de 21nt à l’intérieur de ces organelles conduit à une inhibition du RNAi systémique et stimule fortement la propagation du PCV à travers la plante. Ces travaux définissent une nouvelle stratégie de pathogénèse virale au cours de laquelle une organelle est utilisé pour neutraliser des molécules de défense produites par l’hôte. / In plants, RNA interference (RNAi) is the main antiviral defense mechanism. It is initiated through the processing of viral RNA into 21-22nt long siRNA by DCL4 and DCL2, respectively. These siRNA can mediate sequence-specific local defense reactions (cell-autonomous RNAi) or move to distant tissues to prime defenses in naive cells (systemic RNAi). Consequently, viruses have evolved proteins (VSRs) to suppress both aspects of RNAi. In this in vivo study, I show that P15, the VSR of Peanut clump virus (PCV), binds and sequesters both 21nt and 22nt siRNA. Importantly, it stops the movement of 22nt siRNA more efficiently than 21nt siRNA. During infection, P15 is shuttled into peroxisomes, and is able to « piggyback » siRNA into these organelles. By confining mobile DCL4-dependent antiviral 21nt siRNA within peroxisomes, P15 is able to shut down systemic RNAi and strongly promote PCV movement. This work describes a novel pathogenic strategy in which an organelle is used to neutralize host defensive molecules.

L'ADN mitochondrial des plantes est dynamique et son expression est complexe. Par la voie naturelle d'import d'ARN de transfert codés par le noyau, nous avons adressé dans les mitochondries d'Arabidopsis l'ARN orf77 caractéristique de la S-CMS du maïs et nous avons analysé les effets sur le transcriptome mitochondrial. Celui-ci s'est avéré strictement régulé durant le développement et fortement tamponné aux stades précoces. L'adressage mitochondrial de l'orf77 a aussi promu un cross-talk avec le noyau. D'autre part, la réplication et la réparation de l'ADN dans les mitochondries de plante impliquent une recombinaison active contrôlée par des facteurs codés par le noyau. Nous avons identifié l'exonucléase 5'-3' potentiellement responsable de la résection des extrémités de l'ADN dans la réparation par recombinaison des cassures double-brin. Nos résultats ouvrent des perspectives pour la génération de diversité génétique mitochondriale et la création de lignées CMS d'intérêt agronomique. / The mitochondrial DNA of plants is dynamic and its expression is complex. Using a strategy based on the natural import of nuclear-encoded transfer RNAs from the cytosol, we targeted to mitochondria in Arabidopsis thaliana the orf77 RNA characteristic for S-CMS in maize and we analyzed the effects on the transcriptome. The results showed that the mitochondrial transcriptome is tighly regulated during plant development and is strongly buffered at early stages. Mitochondrial targeting of orf77 also triggered a cross-talk with the nucleus. On the other hand, DNA replication and repair in plant mitochondria involve active recombination controled by nuclear-encoded factors. We identified a new member of this set of factors, the 5'-3' exonuclease potentially responsible for the resection of DNA ends in recombination-mediated repair of double-strand breaks. As a whole, the results open prospects for generating mitochondrial genetic diversity and creating CMS lines with agronomical interest.

La spécificité d'hôte est un concept fondamental pour comprendre les mécanismes évolutifs ayant abouti aux interactions étroites entre les bactéries et les plantes. Les études réalisées sur la coopération entre les bactéries rhizosphériques phytostimulatrices (PGPR) et les plantes suggèrent que la spécificité serait régie soit par une adaptation souchespécifique de la bactérie à des caractères aspécifiques de la plante, soit par une adaptation aspécifique de la bactérie à des propriétés spécifiques d'un génotype de plante. Ainsi, nous formulons l'hypothèse que ces adaptations se traduisent par la régulation de nombreux gènes indépendamment de leur implication directe dans l'effet phytobénéfique. Ces régulations pourraient dépendre de la combinaison souche bactérienne/génotype de plante considérée. L'objectif de ce travail est de mettre en évidence les gènes impliqués dans l'adaptation des partenaires l'un à l'autre et ceux impliqués dans la spécificité, au cours de la coopération PGPR-plantes. Pour cela, nous avons choisi comme modèle d'étude l'interaction entre Azospirillum lipoferum 4B et les céréales (blé, maïs, riz cultivars Cigalon et Nipponbare) avec un accent porté sur l'expression des gènes des deux partenaires de la coopération A. lipoferum 4B-riz. Les résultats de transcriptomique sur puce soulignent l'importance des mécanismes de réponse au stress oxydatif au cours de l'adaptation des partenaires l'un à l'autre ainsi que la mise en place de réseaux de régulation complexes. De nombreux gènes présentent un profil d'expression qui dépend de la combinaison souche/cultivar, suggérant que des mécanismes évolutifs ont conduit à une interaction préférentielle entre une souche et son cultivar d'origine / Host specificity is a fundamental concept in understanding evolutionary processes leading to intimate interactions between bacteria and plants. In the case of Plant Growth- Promoting Rhizobacteria (PGPR) specificity appears to be controlled either by a strainspecific bacterial adaptation to non-specific traits of the host plant or by non-specific bacterial adaptation to genotype-specific properties of the host plant. Thus, we hypothesize that these adaptations result in the regulation of a large number of genes, independently of their direct involvement in phytostimulation. These regulations may depend on the bacterial strain / plant genotype combination. This work aims at identifying genes involved in reciprocal adaptation of partners and those involved in host specificity in PGPR-plant cooperation. As a model, we studied the interaction between Azospirillum lipoferum 4B and cereals (wheat, corn, rice cultivars Nipponbare and Cigalon), with an emphasis on gene expression of both partners during A. lipoferum 4B-rice cooperation. Microarray transcriptomic results highlight the importance of mechanisms implicated in response to oxidative stress as well as a tight adjustment of regulatory networks during the adaptation of both partners to each other. Many genes display expression profile that depends on the strain/cultivar combination, suggesting that evolutionary processes have led to a preferential interaction between a strain and its original cultivar