The international scientific community has grown increasingly concerned that exposure to low levels of anthropogenic chemicals may disturb hormone function and/or sub lethal toxicity to other cells or organ systems in vertebrate and invertebrate species. This research programme was designed to develop, evaluate, and apply a range of biological and chemical indicators in the laboratory and/or field to assess the impact of sublethal toxicants including potential endocrine disaipting chemicals in the aquatic invertebrates, Asellus aquaticus (isopod) and Pacifasiacus leniiisciiius (decapod). Laboratory exposures of A. aquaticiis to environmentally realistic concentrations of known contaminants present within the river systems have demonstrated a link between health status and chemical exposure. Exposure to the organoiins, tributyltin and triphenyltin, and the pesticides, dichlorvos and endosulphan, demonstrated that adults were adversely affected at the biochemical (esterase activities) and physiological level (ventilation rates), as well as disrupting embryo development during in vitro investigations. Field studies demonstrated that cholinesierase and carboxyleslerase activities, ventilatory rates, growth, sex ratios, number of copulatory pairs and ovigerous females, fecundity, and embryonic growth, development and survival were all adversely affected to some extent in the isopod at sites downstream of industrial and domestic effluent discharges in comparison to control populations. Some links were established between the biological parameters measured and sediment faecal sterol content and/or water physico-chemical parameters and comparisons of multiple biomarkers did demonstrate differences between organisms collected at reference and contaminated sites which may be an indicator of environmental stress. A preliminary field investigation of P. lenittscultis collected from sites of mild sewage pollution indicated statistically significant changes in some responses at the cellular (cell viability), molecular (micronucleus formation), and physiological (heart rate) level. The significance of these changes at the population level was not determined, however, there is evidently a need to conduct laboratory exposures of P. leniusculits to sewage effiuent and its individual components to determine whether the responses observed in the field are indicative of sewage contamination. In the present study, the sublethal responses of A. aquaticits and P. len len leniusculus to a range of endocrine disrupting chemicals has been investigated in laboratory and field settings and although cause and effect could not be demonstrated conclusively, this study has gone some way in identifying possible causative agents of these adverse effects in invertebrate populations.

- / -

Τα ισόποδα αποτελούν τη μοναδική τάξη οργανισμών ανάμεσα σε όλα τα Καρκινοειδή που πέτυχε να εποικήσει όλους τους τύπους ενδιαιτημάτων, από τα βάθη των ωκεανών μέχρι τα βουνά, τις έρημους και τις τροπικές περιοχές. Παρόλα αυτά, οι φυλογενετικές σχέσεις εντός της τάξης των ισοπόδων παραμένουν σε πολλά σημεία ασαφείς. Η οικογένεια Tylidae, που περιλαμβάνει 27 αμφίβια είδη, ανήκει σύμφωνα με τη σημερινή συστηματική κατάταξη στην υπόταξη Oniscidea, τη μοναδική που περιλαμβάνει αντιπροσώπους με χερσαίο ή ημι-χερσαίο τύπο διαβίωσης. Αν και υπάρχουν αμφιβολίες ως προς τη μονοφυλετική προέλευση αρκετών από τις 9 υποτάξεις που περιλαμβάνουν θαλάσσιους αντιπροσώπους, η προέλευση των Oniscidea θεωρείται αδιαμφισβήτητα μονοφυλετική. Εντούτοις, δεν υπάρχει ακόμη συμφωνία ως προς την ακριβή τοποθέτηση του κλάδου των Tylidae στο φυλογενετικό δέντρο των Oniscidea. Ο βασικός στόχος της παρούσας εργασίας ήταν ο προσδιορισμός των φυλογενετικών σχέσεων των αμφιβίων ισοπόδων της οικογένειας Tylidae με τα υπόλοιπα ισόποδα, με έμφαση στις σχέσεις με τα υπόλοιπα Oniscidea. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν μοριακοί δείκτες από 14 γένη ισοπόδων, τα οποία αντιπροσωπεύουν όλους τους τύπους διαβίωσης, από τον αποκλειστικά θαλάσσιο έως τον αποκλειστικά χερσαίο. Η πειραματική προσέγγιση περιλάμβανε τον πολλαπλασιασμό αλληλουχιών του πυρηνικού γονίδιου 18s rDNA και των μιτοχονδριακών 16s rDNA και COI με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμέρασης (PCR), τον προσδιορισμό της αλληλουχίας τους και τη φυλογενετική ανάλυσή τους με μεθόδους μέγιστης φειδωλότητας, μέγιστης πιθανοφάνειας και μπεϊεσιανής συμπερασματολογίας. Οι μιτοχονδριακές αλληλουχίες εμφανίζουν πολύ υψηλά ποσοστά νουκλεοτιδικών υποκαταστάσεων, και σε συνδυασμό με τη χαμηλή αξιοπιστία των δέντρων που παράγονται φαίνεται πως έχουν απωλέσει εντελώς το φυλογενετικό τους σήμα. Η αλληλουχία του 18s rDNA έχει μήκος 2400-3400 bp και αποτελείται από 4 συντηρημένες περιοχές και 3 υπερ-μεταβλητές. Για τις φυλογενετικές αναλύσεις χρησιμοποιήθηκαν μόνο οι συντηρημένες περιοχές, που συνιστούν ένα σύνολο 1597 διακριτών χαρακτήρων. Στα αποτελέσματα από όλες τις υπολογιστικές μεθόδους η οικογένεια Tylidae τοποθετείται στο τελικό δέντρο σε αδελφό κλάδο του τάξου Crinochaeta της υπόταξης Oniscidea. Εντούτοις, παρατηρήθηκε πως η οικογένεια Ligiidae τοποθετείται σε κλάδο μη-συγγενικό προς τα υπόλοιπα χερσαία ισόποδα, υπονοώντας πως η υπόταξη Oniscidea δεν είναι μονοφυλετική. Για να ελέγξουμε αυτήν την υπόθεση, χωρίσαμε τα δεδομένα μας σε αλληλουχίες από θαλάσσιους και σε αλληλουχίες από χερσαίους αντιπροσώπους, πραγματοποιώντας ένα σύνολο από πρόσθετες αναλύσεις. Από τα αποτελέσματα φαίνεται πως η υπόταξη Oniscidea είναι μονοφυλετική και η αντίθετη αρχική υπόθεση οφείλεται σε ‘θόρυβο’ στο φυλογενετικό σήμα των συντηρητικών περιοχών του 18s rDNA. Τέλος, από τις πρόσθετες αναλύσεις προκύπτουν, με ισχυρή στατιστική στήριξη, φυλογενετικά δέντρα που υποστηρίζουν τη συστηματική κατάταξη που είχε προτείνει ο Erhard από τις μορφολογικές του μελέτες, τοποθετώντας τα Tylidae εντός του τάξου ‘Holoverticata’. / Isopods comprise a unique order among the Crustaceans that has settled effectively all possible habitats on the planet. The phylogenetic relationships, though, between the 10 suborders remain unresolved, as many of them might prove to be non-monophyletic taxa. The family Tylidae consists of 27 amphibian species and is traditionally classified in the suborder Oniscidea, which includes all the terrestrial and semi-terrestrial isopods and that is thought to be unambiguously monophyletic. However, the previous phylogenetic studies have proposed many hypotheses concerning the relations between the Tylidae and the other Oniscidea, lacking any plausible consensus. In order to resolve those phylogenetic relations, we used two mitochondrial sequences (16s, COI) and one nuclear (18s) from 14 genera of isopods. Our experimental approach included PCR amplification, sequencing and computational phylogenetic analyses by means of maximum parsimony, maximum likelihood and Bayesian inference. The mitochondrial sequences present extreme values of nucleotide substitutions and evident saturation, a fact that prohibits their use in further analyses. The 18s sequences vary significantly in size (2400-3400 bp) and consist of 4 conserved and 3 hyper-variable regions. Only the conserved regions were used for analysis, resulting to a dataset of 1597 discrete nucleotide characters. Regardless of the method used, the family Tylidae appeared as a sister-clade of the taxon Crinochaeta (suborder Oniscidea) in the cladograms. We noticed, though, that the taxon Diplochaeta (Oniscidea: Ligiidae) appeared (with low bootstrap values) in a distant clade of all the other Oniscidea, a result that does not support the monophyletic origin of the Oniscidea. In order to test the validity of this result, we splitted our dataset and conducted additional, separate analyses for the sequences of the marine isopods and those of the terrestrial isopods. Our results indicate that the suborder Oniscidea is monophyletic, so the initial opposite hypothesis was due to weak phylogenetic signal. Finally, our cladograms support, with significant confidence, the systematic classification that Erhard (1998) had proposed through his studies on morphological characters of the Oniscidea, placing together the family Tylidae and the taxon Crinochaeta under the name ‘Holoverticata’.

Το γένος Trachelipus περιλαμβάνει οργανισμούς σχετικά στενόοικους οι οποίοι ζουν είτε στην παρόχθια βλάστηση ρεμάτων και ποταμών είτε σε υγρά δάση. Στη χώρα μας έχουν καταγραφεί 8 από τα 50 είδη του γένους, 4 από τα οποία είναι ενδημικά της Ελλάδας. Το ένα από αυτά εξαπλώνεται από την Κρήτη μέχρι την Ήπειρο, ένα στα νησιά του κεντρικού Αιγαίου, ένα στην Κρήτη και ένα στο νότιο Ευβοϊκό. Η κατανομή κάθε είδους είναι ασυνεχής, είτε λόγω γεωγραφικών (νησιωτικοί πληθυσμοί κλπ) είτε λόγω ενδιαιτηματικών παραγόντων. Η διάκριση μεταξύ των ειδών έχει γίνει βάσει περιορισμένου αριθμού μορφολογικών χαρακτήρων και δεν είναι βέβαιο ότι αντανακλά τις πραγματικές φυλογενετικές σχέσεις τους. Από τα αποτελέσματα προηγούμενης μελέτης διαπιστώθηκε έντονη απόκλιση μεταξύ των προτύπων της γενετικής ποικιλότητας και εκείνης της τρέχουσας ταξινόμησης σε ορισμένες ομάδες πληθυσμών του γένους αυτού. Επιπλέον, φάνηκε σημαντικός βαθμός γενετικής απομόνωσης μεταξύ των πληθυσμών ενός είδους, ενισχύοντας την άποψη περί ισχυρής μεταπληθυσμιακής συγκρότησής τους. Στην παρούσα μελέτη, συλλέχθηκαν 47 πληθυσμοί στην ηπειρωτική Ελλάδα, οι οποίοι στη μεγάλη τους πλειοψηφία ανήκαν στο είδος Trachelipus kytherensis (σύμφωνα με την ισχύουσα ταξινόμηση). Σε αυτούς προστέθηκαν και τα δεδομένα των Parmakelis et al 2008 (16 πληθυσμοί) έτσι ώστε να είναι πιο ολοκληρωμένη η μελέτη και η εξαγωγή συμπερασμάτων για το γένος Trachelipus. Συνολικά μελετήθηκαν γενετικά 63 πληθυσμοί του γένους, χρησιμοποιώντας ως μοριακούς δείκτες τα μιτοχονδριακά γονίδια 16S rRNA και COI. Έπειτα από απομόνωση του DNA και τον πολλαπλασιασμό των συγκεκριμένων τμημάτων με PCR προσδιορίστηκε η αλληλουχία των βάσεων, και υπολογίστηκε η γενετική διαφοροποίηση εντός και μεταξύ των πληθυσμών. Για την ανάλυση των φυλογενετικών σχέσεων μεταξύ των πληθυσμών ή/και των ειδών χρησιμοποιήθηκαν οι μέθοδοι της Σύνδεσης Γειτόνων (Neighbor Joining-NJ), της Μέγιστης Φειδωλότητας (Maximum Parsimony-MP) και της Μπεϊεσιανής Συμπερασματολογίας (Bayesian Inference-BI). Το τελικό μήκος των αλληλουχιών μετά την επεξεργασία ήταν 386 θέσεις για το γενετικό τόπο 16S rRNA και 512 θέσεις για το γενετικό τόπο COI. Με τα δεδομένα αυτά δεδομένα πραγματοποιήθηκε τόσο ανεξάρτητη όσο και συνδυασμένη ανάλυση. Από τα αποτελέσματα φαίνονται πληθυσμοί οι οποίοι παρα το ότι είναι πολύ κοντινοί γεωγραφικά, και μέχρι σήμερα θεωρείται πως ανήκουν στο ίδιο είδος (Trachelipus kytherensis), εμφανίζουν μεγάλες γενετικές αποστάσεις μεταξύ τους και ομαδοποιούνται σε διαφορετικούς και αρκετά απομακρυσμένους κλάδους των δένδρων σε όλες τις αναλύσεις (NJ, MP, BI). Η τοπολογία των κλάδων, καθώς και η απουσία σαφούς γεωγραφικού προτύπου στην ομαδοποίηση των πληθυσμών του T. kytherensis, καταδεικνύει ότι πιθανότατα δεν έχουμε να κάνουμε με ένα μόνο είδος, αλλά με περισσότερα που είναι δύσκολο να διακριθούν μορφολογικά, τουλάχιστον με τους μέχρι σήμερα χρησιμοποιούμενους ταξινομικούς διαγνωστικούς χαρακτήρες. Αυτό ενισχύεται και από τις γενετικές αποστάσεις που καταγράφηκαν στην παρούσα μελέτη και εμφανίζονται ιδιαίτερα αυξημένες (μέγιστες παρατηρηθείσες γενετικές απόστασεις: 27,3% COI, 17,6% 16S rRNA) ακόμα και σε σχέση με αυτές που έχουν αναφερθεί σε άλλες έρευνες για τη διάκριση ειδών ισοπόδων. Επισημαίνεται η ιδιαίτερα μεγάλη γενετική διαφοροποίηση μεταξύ των αντιπροσώπων του γένους. Επιπλέον καταδεικνύεται πως η Πελοπόννησος φιλοξενεί τα είδη Trachelipus ‘kytherensis’ και T. aegaeus (τουλάχιστον στη χερσόνησο της Αργολίδας) αλλά και πιθανόν μια τρίτη μορφή στα βόρεια (νέο είδος;) η οποία εμφανίζεται ευρύτερα στην ηπειρωτική Ελλάδα. Θα είχε ιδιαίτερο ενδιαφέρον λοιπόν να μελετηθούν αυτές οι πιθανές «ζώνες επαφής» ως προς τη γονιδιακή τους ροή, ώστε να εκτιμηθεί το ποσοστό απομόνωσης των πληθυσμών και, κατ’ επέκταση, του κάθε είδους. / The phylogenetic relationships among terrestrial isopod species are still largely unknown because robust analyses have started to appear only relatively recently. Species-level taxonomy has been based mainly on a few secondary sexual characters of males, although recent analyses based on molecular markers have indicated that species definitions based on morphology may underestimate the true levels of divergence among populations. Furthermore, within several genera or species groups, morphological characters do not provide clear-cut taxonomic resolution, so that many changes in the interpretation of nominal species have appeared in the literature. The genus Trachelipus comprises of relatively stenoecious animals living in habitats generally threatened by human activities, such as humid forest sites and riparian habitats. It includes some 50 species distributed around the Palaearctic, with 8 species recorded from Greece, 4 endemic to the country. The distribution of species is discontinuous due to the increasing fragmentation of its habitats and the expansion of agricultural land and dry woodland. Projected climatic change will restrict further gene flow between Trachelipus populations, as dry habitats are expected to expand in Greece. Species–level taxonomy has been based on a few morphological characters, mainly the secondary sexual characters of males, exhibiting significant variation, and is controversial. Very high intraspecific genetic divergence among several populations has been documented. In this study we attempt a phylogeographic analysis among the Greek endemic species of the genus. We sampled 47 populations from several sites in mainland Greece. In our analyses we incorporated data from previous work (16 populations) in order to better estimate possible geographic structure in the patterns of divergence among populations, and to throw new light in the systematics of the species. Overall, 63 populations were considered. After total DNA extraction, we sequenced the two PCR amplified mtDNA gene fragments, namely 16S rRNA and cytochrome oxidase subunit I (COI), and calculated the genetic divergence within and among the populations studied, as well as their phylogenetic relationships. The methods for phylogenetic reconstruction used were Neighbor Joining (NJ), Maximum Parsimony (MP) and Bayesian Inference (BI) for each mtDNA sequence data and the concatenated dataset. The phylogenetic trees obtained from the molecular data – from all three phylogenetic methods (NJ, MP, BI) - produced trees with quite congruent topologies. Some populations that are considered conspecific exhibit large genetic distances and cluster in different clades. The highly-structured phylogenetic tree and the lack of an overall geographic pattern in the clustering of Trachelipus populations indicates that very probably we are not dealing with a single species, but rather with a number of cryptic species, hardly distinguished by means of currently used morphological characters. This is further corroborated by the genetic distances separating the clades hosting nominal T. kytherensis populations (max_dCOI=27.3% and max_d16S rRNA=17.6%). In general, it can be argued that the genetic distances recorded in the present study are quite large compared with those reported for different species and even genera in other studies of terrestrial isopods. Furthermore, it is evident than there are two species present in the Peloponnese, i.e. Trachelipus ‘kytherensis’ and T. aegaeus (in Argolis peninsula). In northern Peloponnese, a third form is also present (new species?) that occurs throughout the central and northern part of mainland Greece. These ‘contact zones’ should be further investigated in terms of genetic flow and isolation of the populations and/or species. Both the phylogeny presented here and the genetic distances separating populations appear to justify the necessity of further investigation into the phylogeny of the Greek Trachelipus species using a population by population approach. It is likely that morphology inadequately describes real variation inside and among species; hence, diagnoses based on the morphological characters used so far for the delineation of Trachelipus species should be reconsidered under the light of more extensive molecular phylogenetic analyses.

Τα ισόποδα αποτελούν τα πιο ποικίλα σε δομή και τα πλουσιότερα σε είδη Καρκινοειδή της υπέρταξης των Περακαρίδων. Πρόκειται για κοινούς κατοίκους όλων σχεδόν των οικοσυστημάτων. Η οικογένεια Sphaeromatidae (Latreille, 1825) ανήκει στην υπόταξη Flabellifera (μια από τις 10 υποτάξεις των ισοπόδων). Δύο εκπρόσωποι της οικογένειας αυτής είναι τα είδη Sphaeroma serratum (Fabricius, 1787) και Lekanesphaera hookeri (Leach, 1814), που είναι κοσμοπολιτικά, εντοπίζονται σε πολλές περιοχές της Ελλάδας και αποτέλεσαν τα πειραματόζωα στην παρούσα μελέτη. Οι φυλογενετικές μελέτες στον ελλαδικό χώρο περιορίζονται κυρίως στη μελέτη ειδών χερσαίων ισοπόδων, κυρίως λόγω των πολλών ενδημικών ειδών. Ωστόσο εντοπίζονται και άλλα είδη, τα οποία διαβιούν τόσο στη θάλασσα όσο και σε περιοχές με γλυκά και υφάλμυρα νερά, τα οποία δεν έχουν μελετηθεί ακόμη, αν και θα μπορούσαν να δώσουν απαντήσεις σε ερωτήματα σχετικά με τους μηχανισμούς απομόνωσης των πληθυσμών αλλά και την οικολογία, καθώς και την παλαιογεωγραφία της περιοχής. Η παρούσα εργασία αποτελεί την πρώτη απόπειρα μελέτης των φυλογενετικών σχέσεων των δύο αυτών ειδών τόσο στον ελλαδικό όσο και στον ευρωπαϊκό χώρο γενικότερα. Ο σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν ο προσδιορισμός της γενετικής δομής και των φυλογενετικών σχέσεων ειδών της οικογένειας Sphaeromatidae. Για τη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν μοριακοί δείκτες από 18 πληθυσμούς του είδους Sphaeroma serratum και 2 πληθυσμούς του είδους Lekanesphaera hookeri (ως εξωομάδα). Η πειραματική προσέγγιση περιελάμβανε τον πολλαπλασιασμό αλληλουχιών των μιτοχονδριακών γονιδιακών τόπων 16S rDNA και COI (δείκτες που χρησιμοποιούνται ευρέως για μελέτες σε επίπεδο πληθυσμών και ειδών) με τη μέθοδο της PCR, τον προσδιορισμό των αλληλουχιών αυτών και, ακολούθως, τη στατιστική και φυλογενετική τους ανάλυση με τις μεθόδους της Σύνδεσης Γειτόνων (Neighbor Joining), της Μέγιστης Φειδωλότητας (Maximum Parsimony) και της Μπεϊεσιανής Συμπερασματολογίας (Bayesian Inference). Το τελικό μήκος των αλληλουχιών μετά την επεξεργασία ήταν 396 θέσεις για το γενετικό τόπο 16S και 500 θέσεις για το γενετικό τόπο COI. Τα δεδομένα από τους δύο γενετικούς τόπους ήταν δυνατό να συνδυαστούν, επομένως πραγματοποιήθηκε τόσο ανεξάρτητη όσο και συνδυασμένη ανάλυση. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν από τη χρήση των μιτοχονδριακών μοριακών δεικτών και την εφαρμογή των φυλογενετικών μεθόδων που προαναφέρθηκαν, τόσο όσον αφορά τις νουκλεοτιδικές αποκλίσεις όσο και τα φυλογενετικά δέντρα που προέκυψαν, επιβεβαιώνουν τη μεγάλη γενετική διαφοροποίηση μεταξύ των δύο ειδών και αναγνωρίζουν επίσης μεγάλη γενετική διαφοροποίηση μεταξύ των πληθυσμών του είδους Sphaeroma serratum. Η διαφοροποίηση αυτή δεν ακολουθεί κάποιο σαφές γεωγραφικό πρότυπο, ωστόσο φαίνεται να συνδέεται με τα διαφορετικά επίπεδα αλατότητας που παρατηρούνται στις διάφορες περιοχές συλλογής. Οδηγούμαστε συνεπώς στην υπόθεση ότι είναι πιθανή η ύπαρξη κρυπτικών ειδών μέσα στους πληθυσμούς του είδους. / Isopods, the most diverse in form and the most species-rich crustaceans of the superorder Peracarida, have successfully settled all possible habitats. The family Sphaeromatidae (Latreille, 1825) is classified in the suborder Flabellifera (one of the 10 suborders of isopods). Two representatives of this family are the species Sphaeroma serratum (Fabricius, 1787) and Lekanesphaera hookeri (Leach, 1814). They are both cosmopolitan species and have colonized widely the Greek marine shorelines and lagoons. The phylogenetic relations studies in Greece regard only terrestrial isopods, due to the large variety of endemic species. However, there are also non terrestrial species that haven’t been studied yet. This type of studies could give answers to questions about the isolation mechanisms of the populations, about ecological factors and the palaeogeography of Greece. The present study is the first attempt to resolve the phylogenetic relations of the two species mentioned above, in Greece and generally in Europe. In order to resolve those relations, we used two mitochondrial markers (16S rDNA and COI) from 18 populations of Sphaeroma serratum and 2 populations of Lekanesphaera hookeri (outgroup). Our experimental approach included PCR amplification, sequencing and computational statistic and phylogenetic analyses using Neighbor Joining, Maximum Parsimony and Bayesian Inference methods. Regardless of the method used, the results verify the great genetic divergence between the two species and also indicate great divergence among the populations of Sphaeroma serratum. Divergence patterns do not show any clear geographic structure, although they seam to be related somehow with the different salinity levels observed in the sampling regions, implicating the existence of cryptic species.