La relevancia de los receptores de esteroides tanto en la próstata normal como en las diferentes patologías prostáticas es bien reconocida, pero la distribución específica de algunos de ellos en los tejidos en los diferentes compartimientos celulares de la glándula prostática canina no ha sido completamente caracterizada. Nosotros analizamos la expresión inmunohistoquímica del receptor de andrógenos (AR), receptor de estrógenos alfa (ER?), receptor de estrógenos beta (ER?) y receptor de progesterona (PR) en los diferentes tipos de células de la glándula prostática canina tanto normal como con diferentes condiciones patológicas (Hiperplasia, prostatitis, carcinoma). La expresión de AR fue del 100% tanto en tejido hiperplásico como normal, 74% en prostatitis y 65% en carcinomas. La expresión de ER? fue del 85% en casos normales, 35% en casos de hiperplasia, 22% en prostatitis y sólo 12% en glándulas neoplásicas. La expresión de ER? fue del 85% en casos normales y alrededor del 70% en todas las condiciones patológicas estudiadas. Por otro lado, la expresión de PR fue débil y menos común en el tejido normal (44%) cuando la comparamos a la hiperplasia y otras enfermedades. En resumen podemos decir que la expresión de AR, ER? y ER? fue más alta en las glándulas normales y disminuyó en hiperplasia, prostatitis y cáncer. En perros, la administración combinada de estrógenos y andrógenos incrementa de forma sinérgica el peso de la próstata y un tratamiento continuado da lugar al desarrollo de hiperplasia glandular. El objetivo del presente estudio fue examinar la expresión inmunohistoquímica de AR, ER?, ER? y PR en un modelo de hiperplasia prostática canina inducido experimentalmente. Cinco perros machos de raza Beagle fueron castrados y tratados con 25 mg de androstanediol y 0,25 mg de 17? estradiol durante 30 semanas. Se obtuvieron mediante cirugía biopsias de próstata cada seis semanas en el grupo experimental (estadios experimentales M0 a M6). El grupo experimental consistió en tres perros no castrados y tratados únicamente con el vehículo utilizado para disolver las hormonas aplicadas al grupo experimental y a los cuales sólo se les tomaron cuatro biopsias (M0, M1, M4 y M6). Los resultados de inmunohistoquímica revelaron una alta expresión de AR y ER? en el núcleo de las células epiteliales y estromales de todas las biopsias tanto del grupo experimental como del grupo control. La supresión del tratamiento hormonal se tradujo en una reducción significativa en la expresión de ambos receptores. Por el contrario la expresión de ER? sólo se observó en el núcleo de las células epiteliales y no hubo diferencias significativas en el porcentaje de núcleos teñidos entre el grupo control y el grupo tratado con hormonas o las próstatas atróficas. Débil tinción para PR fue observada en una pequeña proporción del núcleo de células epiteliales, pero no en células estromales. Los resultados indican que AR, ER?, ER? y PR son diferencialmente expresados en el tejido prostático canino. Además, el presente estudio también ha comparado los hallazgos ultraestructurales observados en este modelo de hiperplasia canina inducida experimentalmente con los cambios desarrollados espontáneamente en los perros no tratados. En las células luminales se observó apelotonamiento con abundantes proyecciones papilares, ramificación de microvellosidades, y la presencia de compartimentación de los gránulos de secreción. El cambio más llamativo, no reportado anteriormente, fue el hallazgo de caveolas en las células basales. El compartimiento de las células basales contiene la población de células epiteliales transitoriamente amplificante y podemos concebir que dichas células desempeñen un rol en el desarrollo de la BPH. Otro propósito del presente estudio fue determinar mediante morfometría ultraestructural si el número de caveolas estaba relacionado con los estadios de la hiperplasia benigna de próstata inducida hormonalmente. Un incremento en el número de caveolas en las células basales fue notado de M0 a M5. La diferencia entre estos cuatro estadios y el inicial fue estadísticamente significativa (p? 0.05). En el estadio M6, después de retirar el tratamiento hormonal, las caveolas disminuyeron drásticamente en número (18,4%). Por tanto el hallazgo más notable en este modelo de BPH experimental fue el incremento significativo en el número de caveolas en las células basales a través de los estadios del tratamiento hormonal y la dramática reducción después de retirar el tratamiento. Estos hallazgos sugieren que las células basales podrían ser el blanco primario o ser inducidas por el estímulo hormonal. Finalmente, también hemos evaluado el análisis de expresión de genes asociado con el inicio de la BPH. El análisis microarray específico para caninos de Affymetrix fue realizado en las biopsias secuenciales obtenidas en este modelo dinámico del perro del beagle y caracterizó un número de genes alterados durante BPH. Palabras clave: Hiperplasia prostática, perro, inmunohistoquímica, receptores hormonales. / The relevance of steroid receptors in both normal prostate and in prostatic pathology is well recognized, but tissue-specific distribution of some of them in the different cell compartments of the canine prostate gland is not completely characterized. We analysed the immunohistochemical expression of androgen (AR), oestrogen ? (ER?) and ? (ER?) and progesterone (PR) receptors in the different cell types of the canine prostate gland, either normal or with different pathologic conditions (hyperplasia, prostatitis, carcinoma). AR labelling was 100% in the epithelial cells of normal and hyperplastic tissue, 74% in prostatitis, and 65% in carcinomas. ER? was 85% in normal cases, 35% in hyperplastic cases, 22% in inflamed cases, and 12% in neoplastic glands. ER? expression was 85% in normal cases and around 70% in all of the pathological conditions. On the other hand, PR expression was weak and less common in normal tissue (44%), when compared to hyperplasia and other diseases. Overall, the expression of AR, ER? and ER? was highest in normal glands, and decreased in hyperplasia, prostatitis, and cancer. In dogs, the combined administration of oestrogen and androgens synergistically increases prostate weight, and continued treatment leads to the development of glandular hyperplasia. The aim of the present study was to examine the immunohistochemical expression of AR, ER?, ER? and PR in a model of experimentally induced canine prostatic hyperplasia. Five male Beagle dogs were castrated and treated with 25 mg of 5?-androstane-3?, 17?-diol and 0.25 mg 17?-estradiol for 30 weeks. Prostate specimens were surgically obtained every 6 weeks (experimental stages M0 to M6). The control group consisted of three non-castrated dogs treated with vehicle, from which specimens were only taken at the time points M0, M1, M4 and M6. Immunohistochemical data revealed high AR and ER? expression in the epithelial and stromal cell nuclei of all the experimental and control specimens. The suspension of hormone treatment led to a significant reduction in the expression of both receptors. On the contrary, ER? was only expressed in epithelial cell nuclei, with no significant differences in the percentages of stained nuclei between control and hormonally treated or atrophic prostates. Weak staining for PR was observed in a small proportion of epithelial cell nuclei but not in stromal cells. Results indicate that AR, ER?, ER? and PR are differently expressed in canine prostate tissue. In addition, the present study has been to compare the ultrastructural findings in this model of experimentally induced canine prostatic hyperplasia with those of the spontaneously developed changes in untreated dogs. Changes in the control groups were similar but of lower intensity compared to those of the experimental groups. In luminal cells, crowding with papillary projections, prominent, branching microvilli, and abundant, often compartmentalized granules were observed. The most striking change was the previously unreported finding of caveolae in basal cells. The basal cell compartment contains the transient amplifying sub-population of epithelial cells. It is therefore conceivable that it plays a role in the development of BPH. Other purpose of the present study was to determine, by means of ultrastructural morphometry, if the number of caveolae was related to the stages of hormonally induced BPH. An increase in the number of caveolae in basal cells was noted from M0 even M5. The difference between these four stages and the initial ones was statistically significant (p<.05). At M6 stage, after hormonal treatment withdrawal, caveolae diminished dramatically in number (18.4%). The most remarkable finding in this model of experimental BPH was the significant increase in the number of caveolae in basal cells throughout the stages of hormonal treatment, and the dramatic reduction after hormonal withdrawal. This finding suggests that basal cells are either a primary target of or are induced by the hormonal stimuli. Finally also we have evaluated the analysis of gene expression associated with BPH. Canine specific Affymetrix microarray analysis performed on sequential biopsies obtained in a beagle dog dynamic model, characterized a number of genes altered during BPH. Transcriptome analysis performed on a dynamic animal model that accurately mimics the human clinics, permitted us to characterize a gene expression pattern associated with the onset of BPH.Key words: Prostatic hyperplasia, dog, immunohistochemistry, caveolae.

La Enfermedad Inflamatoria Intestinal (IBD) hace referencia a un grupo de enfermedades de prevalencia creciente que carecen de tratamiento eficaz. Se cree que está causada por pérdida de tolerancia hacia la microbiota en individuos predispuestos genéticamente, resultando en activación de células T, infiltración leucocitaria y producción de mediadores proinflamatorios. En este escenario, la aproximación terapéutica más obvia mediante el uso de terapias biológicas debería ser incrementar la expresión de genes inmunoreguladores, como la IL-10, o bien bloquear los efectos de mediadores pro-inflamatorios, como el TNFα. Ambas aproximaciones podrían ser capaces de limitar la cronificación y empeoramiento de estas patologías. Un gran número de estrategias anti-TNFα se usan actualmente para tratar la IBD, pero ninguna de ellas está libre de efectos adversos y refractariedad. La introducción de ácidos nucleicos en células diana con la intención de aumentar o disminuir la expresión de un gen específico durante un periodo de tiempo prolongado, así como el desarrollo de vectores de terapia génica, eficaces y seguros, se vislumbran como objetivos prioritarios para alcanzar eficacia terapéutica en este tipo de patologías. En este trabajo se analizó el potencial terapéutico de varias estrategias diferentes de terapia génica: por un lado, empleando adenovirus (Ad) defectivos o plásmidos CpG-free, ambos codificantes del gen de la IL-10 y administrados por vía intravenosa (capítulo 1); por otro lado, se emplearon siRNA’s, modificados químicamente o no, para silenciar la citocina proinflamatoria TNFα y administrados por vía intrarectal (capítulo 4). Ambas intervenciones fueron diseñadas para tratar de forma independiente la colitis por DSS en ratones C57BL/6. Además, se estudió la respuesta inmune celular y humoral generada en ratones tras la reexposición a diferentes Ad portadores de transgenes inmunomoduladores (IL-10) o no inmunomoduladores (GFP) (capítulo 2). Asimismo, con el objetivo de encontrar un vector con distribución específica hacia el colon que pudiera ser utilizado para alterar de forma selectiva la expresión génica en éste órgano, analizamos la biodistribución y bioseguridad de diversos adenovirus quiméricos obtenidos de la combinación de elementos del Ad5 -con tropismo hepático- y del Ad40 -con tropismo entérico- (capítulo 3). Estos estudios nos han permitido contrastar la eficacia terapéutica de la sobreexpresión sistémica de IL-10 mediante dos vectores de terapia génica totalmente distintos, y de poner de manifiesto el potencial de las estrategias basadas en la silenciación de TNFα a nivel local como alternativa al bloqueo sistémico de dicha citocina mediante la administración de anticuerpos o receptores solubles. El plásmido CpG-free codificante de la IL-10 fue capaz de producir un importante beneficio terapéutico a corto y medio plazo, sin generar efectos tóxicos, mientras que la toxicidad tardía del Ad5IL-10 administrado por vía sistémica causó un aumento significativo de la mortalidad siendo, por tanto, un gran hándicap para su uso en clínica. El siRNA TNF78 (siTNF78) con la doble modificación O-Metil y propandiol fue capaz de generar una mejora fenotípica en los ratones colíticos, mayor que la de los demás siRNA’s ensayados, en consonancia con su mayor efecto silenciador in vitro e in vivo y con ausencia de efectos inespecíficos (off-target). Paralelamente, nuestro grupo consolidado junto con otros grupos integrantes de IBDnet ha conseguido generar un vector quimérico con tropismo selectivo hacia el colon mediante el reemplazo de proteínas fiber de la cápside del Ad5 por la fiber corta del Ad40. Tras caracterizar la potente respuesta inmune generada in vivo por la administración reiterada del Ad5 y evidenciar el efecto inmunomodulador atribuible a la IL-10 sobre dichas respuestas, proponemos que el uso de IL-10 como transgén en un vector de distribución local (i.e., Ad5/40S) podría ser una alternativa valiosa para el tratamiento de enfermedades intestinales crónicas como la IBD. / Inflammatory bowel disease (IBD) is an increasingly prevalent disorder for which a suitable treatment is still lacking. IBD is thought to be caused by a loss of tolerance to resident enteric bacteria in genetically prone individuals resulting in T cell activation, leukocyte infiltration, and production of pro-inflammatory mediators. In this scenario the most obvious approach of the -so called- biological therapies should be either to increase the expression of immunoregulatory genes, such as IL-10, or to block the effects of proinflammatory mediators, such as TNFα. Both approaches should help overcome the spreading, chronification and worsening of the inflammation. A number of anti-TNFα-based strategies are currently in use for IBD treatment, but any of them is entirely devoid of adverse reactions and refractoriness. The introduction of nucleic acid into target cells in order to increase or decrease the expression of a specific gene during a sustained period of time, as well as the development of efficacious and safe gene therapy vectors are sought as primary objectives to reach therapeutic efficacy in such diseases. The aim of this work was to assess the therapeutic potential of different gene therapy strategies: in one hand, employing a defective adenovirus (Ad) or CpG-free plasmids, both encoding the murine IL-10 cytokine and given by the intravenous route (chapter 1); in the other hand, employing chemically modified or not modified siRNAs to silence the proinflammatory TNFα cytokine and given by the intrarectal route (chapter 4). Both interventions were designed to treat the murine DSS colitis in C57BL/6 mice, independently. Also, the cellular and humoral immune responses generated after repetitive administrations of different Ad encoding immunoregulatory (IL-10) or not immunoregulatory (GFP) transgenes were studied in mice (chapter 2). In order to find a vector with specific colonic biodistribution to selectively alter the gene expression in this tissue, we analyzed the biodistribution and biosafety of several chimeric Ad obtained from combinations of Ad5 -with hepatic tropism- and Ad40 -with enteric tropism- elements (chapter 3). These studies allowed us to compare the therapeutic efficacy of systemic IL-10 up-regulation obtained with two totally different gene therapy vectors, and to evidence the potential of local TNFα-silencing strategies as an alternative to the systemic blockade of this cytokine after administration of monoclonal antibodies or soluble receptors. The CpG-free plasmid encoding the IL-10 gene was able to produce an important therapeutic efficacy without adverse effects at short- and mid-term time points. On the contrary, late toxicity generated after i.v. Ad5IL-10 administration caused a significant increase in the mortality rate, being therefore a short-coming for its clinical application. The siRNA TNF78 (siTNF78) with the double O-Methyl and propanediol modifications was able to induce an important phenotypic amelioration in colitic mice, higher than that of the rest of siRNAs assayed, accordingly with its increased silencing potential both in vitro and in vivo and with the absence of unwanted unspecific off-target effects. The change of the Ad5 fiber with the Ad40 short fiber has allowed our consolidated group and other members of IBDnet to generate a chimeric Ad5/40S with selective tropism for the colon. After the characterization of the potent immune response generated after repetitive administration of Ad5 in vivo as well as the confirmation of the immunomodulatory effects exerted by the IL-10 transgene in these responses, we suggest the use of IL-10 as transgene in a gene therapy vector with local biodistribution (i.e., Ad5/40S) as a promising alternative for the treatment of chronic intestinal diseases such as IBD.

El dolor neuropàtic es causat per una lesió o malaltia del sistema nerviós somatosensiorial, i es caracteritza per la presencia d'alodínia e hiperalgèsia. Actualment el seu tractament es basa en la teràpia amb opioids, però són necessàries altes dosis per alleujar el símptomes, les quals van acompanyades de nombrosos efectes secundaris. Aleshores es necessari investigar noves dianes així com nous mecanismes per tal de millorar els tractaments amb opioids a fi d’evitar l’administració de dosis altes i els efectes no desitjats. En aquest estudi hem investigat el paper que juguen dos dels principals neurotransmissors gasosos, l'òxid nítric (NO) i el monòxid de carboni (CO) en el desenvolupament del dolor neuropàtic, així com dels seus efectes en les teràpies mediades per receptors opioids mu (MOR) i delta (DOR), i cannabinoids tipus 2 (CB2). D'aquesta manera, utilitzant la constricció crònica del nervi ciàtic com a model de dolor neuropàtic hem demostrat que: I) la via de senyalització perifèrica de l'NO-sGC-PKG, activada per NOS1 i NOS2, juga un paper essencial en el desenvolupament i l’expressió dels principals símptomes del dolor neuropàtic, II) els efectes antinociceptius perifèrics, però no sistèmics, dels agonistes MOR durant el dolor neuropàtic, es produeixen per activació de la via de senyalització de HO1/NOS1/NOS2-sGC-PKG-K+ATP, i que l'NO, sintetitzat per NOS1 i NOS2, esta implicat en la disminuïda expressió del MOR, III) els efectes antinociceptius perifèrics dels agonistes dels receptors DOR i CB2 durant el dolor neuropàtic es poden incrementar a través de l' inhibició de la via de senyalització de NOS1/NOS2-sGC-PKG. A més, l'NO sintetitzat per NOS1, es un dels responsables de la disminuïda i augmentada expressió perifèrica dels receptors DOR i CB2 respectivament durant el dolor neuropàtic, IV) la inhibició de la via de senyalització de NO-sGC-PKG-JNK evita l'aparició de tolerància als efectes antialodínics perifèrics produïts per la morfina durant el dolor neuropàtic, V) el CO, sintetitzat per HO1, inhibeix la simptomatologia del dolor neuropàtic mitjançant l'atenuació de la sobrepressió de NOS1 i NOS2 així com de l'activació microglial produïdes per la lesió nerviosa, i finalment VI) el tractament amb CO, administrat exògenament o sintetitzat endògenament per HO1, potencia els efectes antinociceptius perifèrics dels agonistes MOR, a través d'una sobrepressió perifèrica dels seus receptors i inhibint l'activació microglial. En resum, tant NO com CO tenen un paper essencial durant l’expressió del dolor neuropàtic, i tots dos son capaços de modular els efectes i l'expressió dels receptors MOR, DOR i CB2 durant el dolor neuropàtic, no obstant, mentre que els agonistes MOR produeix els seus efectes antinociceptius perifèrics a través de l'activació de la via de senyalització de HO1/NOS-sGC-PKG-K+ATP, els agonistes DOR i CB2 no utilitzen aquesta via per produir els seus efectes. Finalment, malgrat en aquest estudi es mostren diferents possibilitats d’augmentar l’acció antinociceptiva local produïda per opioids i cannabinoids i evitar el desenvolupament de tolerància durant el dolor neuropàtic, la investigació dels mecanismes d’acció d’aquests fàrmacs es indispensable per millorar la seva acció terapèutica durant el dolor neuropàtic. / Neuropathic pain is caused by a lesion or disease of the somatosensory nervous system, and is characterized by the presence of allodynia and hyperalgesia. Nowadays, its treatment is based upon opioids, but high doses are necessary to alleviate symptoms and they have several undesirable side effects. Therefore, it is important to investigate new targets and mechanisms to improve the current opioid treatments in order to reduce dosage and avoid side effects. In this study, we investigated the role played by the two main gaseous neurotransmitters, nitric oxide (NO) and carbon monoxide (CO) in the development of neuropathic pain, as well as their effects in the mu (MOR) and delta (DOR) opioid, and cannabinoid 2 (CB2) receptors mediated therapies. Indeed, by using the chronic constriction of the sciatic nerve, as a mouse model of neuropathic pain, we demonstrated that: I) the peripheral NO-sGC-PKG signaling pathway, triggered by NOS1 and NOS2, plays a key role in the development and expression of the main symptoms of neuropathic pain, II) the peripheral, but not systemic, antinociceptive effects of MOR agonists during neuropathic pain are produced through the activation of the HO1/NOS1/NOS2-sGC-PKG-K+ATP signaling pathway, and the NO, synthesized by NOS1 and NOS2, is implicated in the peripheral down regulation of MOR, III) the peripheral antinociceptive effects of DOR and CB2 receptor agonists during neuropathic pain can be increased by the inactivation of the NOS1/NOS2-sGC-PKG signaling pathway. Moreover the NO, synthesized by NOS1, is implicated in the peripheral down- and up-regulation of DOR and CB2 receptor during neuropathic pain, IV) the inhibition of the NO-sGC-PKG-JNK signaling pathway avoids the development of tolerance to the local antiallodynic effects produced by morphine during neuropathic pain, V) CO, synthesized by HO1, inhibits neuropathic pain by the attenuation of NOS1/NOS2 overexpression and microglial activation induced by nerve injury, and VI) the treatment with CO, exogenously deliberated or endogenously synthesized by HO1, enhances the peripheral antinociceptive effects of MOR agonists by up-regulating the peripheral expression of MOR and inhibiting the microglial activation. In summary, both NO and CO systems have an essential role in the expression of neuropathic pain and both modulate the effects and expression of MOR, DOR and CB2 receptors after sciatic nerve injury, but while MOR elicits its peripheral antinociceptive effects through the activation of the HO1/NOS-sGC-PKG-K+ATP signaling pathway, DOR or CB2 receptor do not use this pathway to produce their effects. Finally, although this study shows different strategies to increase the local antinociceptive effects produced by opioids and cannabinoids and avoid the development of tolerance during neuropathic pain, the investigation of new mechanisms of action of these drugs is essential to improve their therapeutic actions in neuropathic pain.

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Los biosensores son elementos clave en el desarrollo de sistemas de diagnóstico in-vitro y permiten la fabricación de dispositivos biomédicos miniaturizados para un diagnóstico más rápido y fiable de muchas enfermedades. Con ellos se podrán analizar rápidamente analitos presentes en la sangre, orina, tejidos o saliva y nos informarán de la concentración de determinados componentes (biomarcadores, drogas, antibióticos, virus, etc). Los biosensores también pueden ser aplicados en otros campos, como la alimentación, agricultura, monitorización de procesos industriales y control medio ambiental. Por tanto, el desarrollo de biosensores de bajo coste, pequeños, sensibles y fáciles de usar, repercutirá en el control de enfermedades, la detección de elementos contaminados y toxinas, o la mejora de la producción y control de procesos. La tecnología de los biosensores consiste en sistemas compactos de análisis, compuestos de un elemento de reconocimiento biológico (ADN, anticuerpo, etc.) que detecta un analito (glucosa, antígeno, etc.) y un elemento transductor de esa detección que permite cuantificar la cantidad de analito. En este trabajo, se han producido biosensores electroquímicos explotando, por un lado, su miniaturización e integración en dispositivos Lab on a Chip (LOC) y, por otro lado, mejorando su sensibilidad mediante el uso de micro-nanomateriales que permiten obtener microsensores electroquímicos avanzados. De este modo, se ha desarrollado un sistema de detección electroquímica (SDE) portable que se integra en un dispositivo LOC. Este SDE se compone principalmente de un potenciostato y un cartucho microfluídico que contiene un sensor integrado. El funcionamiento de este dispositivo se ha demostrado principalmente en medidas de ADN. Los resultados obtenidos muestran que la respuesta y sensibilidad del potenciostato es comparable a la que se obtiene en un sistema comercial como el Autolab PGSTAT. Además, como la superficie de sensor no requiere de una modificación previa de la sonda de ADN, el dispositivo microfluídico desarrollado puede ser utilizado para detectar cualquier otro analito de interés, como se ha demostrado en las medidas de detección de ácido úrico en solución. La mejora en la sensibilidad de las medidas electroquímicas, se ha obtenido mediante el atrapamiento magnético de nanotubos de carbono (NTC) sobre la superficie del electrodo de trabajo del sensor usando partículas magnéticas (PMs). Esto permite, por un lado, la obtención rápida y sencilla de superficies nanoestructuradas que mejoran las prestaciones del electrodo y, por otro, sensar la superficie de las PMs de manera eficiente tras la captura del analito de interés de la solución. Este procedimiento de nanoestructuración, que ha resultado aplicable tanto a electrodos serigrafiados como de capa fina, se ha aplicado con éxito a ensayos de biosensado directo de moléculas electroactivas y no electroactivas, y de marcadores y dianas enzimáticos. En el primer caso, se ha realizado la detección de dopamina, obteniéndose un límite de detección (LOD) lo suficientemente sensible para realizar la estimación de la concentración de dopamina endógena en orina. En el segundo caso, para la detección de analitos no electroactivos (como anticuerpos y detergente), se han usado marcadores no enzimáticos (nanocristales de Cd y ferroceno). Para ello se ha ensayado tanto la detección en formato de sándwich como por “sombreado superficial”, un novedoso procedimiento de detección en que la captura de analito interfiere en la detección de un marcador previamente incorporado sobre las PM. Por último, se ha realizado el biosensado de marcadores enzimáticos (mieloperoxidasa). El LOD obtenido en estas medidas es suficientemente bajo para la aplicación del protocolo al estudio de muestras de suero sanguíneo. La combinación de las superficies nanoestructuradas y del SDE portable ha resultado en el desarrollo de un dispositivo LOC con electrodos nanoestructurados, para la detección sensible, rápida, portable y potencialmente automatizable de analitos. / Biosensors are key elements in the development of in-vitro diagnostic systems and they permit the fabrication of miniaturized biomedical devices which enable a faster and more reliable diagnostic of various diseases. These will facilitate a fast analysis of analytes present in blood, urine, membranes or saliva and will report the concentration of certain components (biomarkers, drugs, antibiotics, viruses, etc.). Biosensors can also be applied in other fields such as, food, agriculture, monitoring of industrial processes and environmental control. Therefore, the development of low cost, small, sensitive and easy to use biosensors will facilitate the control of diseases, the detection of pollutants and toxins, or the improvement in the production and control of industrial processes. Biosensors are often defined as compact analytical systems, containing a biological recognition element (DNA, antibodies, etc.) that detects a certain analyte (glucose, antigen, etc.) and a transducer that accomplishes the translation of the binding event into a measurable signal for analyte quantification. In this work, electrochemical biosensors have been developed taking advantage of the miniaturization and integration of Lab on a Chip (LOC) devices and of the improvement in sensitivity provided by the use of micro-nanomaterials that enable the production of advanced electrochemical microsensors. Thereby, a portable electrochemical detection system (EDS), which is integrated in a LOC device, has been developed. This EDS, consist of a potentiostat and a microfluidic cartridge with a sensor included in it. Here, the operation of this EDS has been mainly demonstrated for DNA measurements. The results obtained show that the response and sensitivity of the EDS are comparable to those obtained using a commercial potentiostat. Besides, since for DNA measurements, which were performed in solution, the sensor surface is not previously modified, this cartridge could be used for the detection of other analytes of clinical interest, as it is demonstrated for uric acid detection. With respect to the improvement in sensitivity obtained in the electrochemical measurements, this has been achieved by carbon nanotube (CNT) wiring of magnetic particles (MP) on the surface of the sensor’s working electrode. This enables, on the one hand, the simple and fast acquisition of nanostructured electrode surfaces of improved performance and, on the other hand, the efficient sensing of the MP surface after analyte capture and concentration from the solution. As it is shown in this work, this nanostructuration procedure is applicable to either screen printed or thin film electrodes. Furthermore, CNT wiring of the MP surface has been successfully applied to both the direct biosensing of electroactive and non electroactive molecules, and the enhanced detection of enzymatic markers and targets. In the first case, dopamine detection has been accomplished, obtaining a limit of detection (LOD) low enough to permit the estimation of endogenous dopamine concentration in urine. In the case of the detection of non electroactive analytes (such as antibodies and surfactant), non enzymatic markers have been used (Cd nanocrystals and ferrocene). For these detections, a sandwich assay and a novel detection assay format based on “surface-shadowing” have been exploited, respectively. This latter novel methodology consists in the capture of the analyte, which then interferes in subsequent CNT wiring and electrochemical detection of an electroactive marker that has been previously incorporated to the MP surface. At last, the biosensing of enzymatic targets (myeloperoxidase) has been performed. The LOD obtained in this case was lower than the numbers obtained without using CNT wiring and was appropriate for the study of human serum samples. The combination of nanostructured electrode surfaces and a portable EDS has resulted in the development of a LOC device with nanostructured electrodes, applicable to sensitive, fast, portable and potentially automatizable analyte detection.

La majoria dels cultius alimentaris, i en particular els cereals com el blat de moro són deficients en vitamines claus. Les plantes transgèniques podrien ser una solució per mitigar les deficiències de vitamines. No obstant això, en les plantes són limitats els coneixements dels mecanismes que regulen l’acumulació de determinades vitamines, com la vitamina C (àcid ascòrbic, AsA).Per aquesta raó, he investigat el contingut en vitamina C i el mecanisme genètic de les rutes metaboliques que controlen l’acumulació de vitamina C en les plantes de panís i he generat blat de moro transgènic que conté diferents combinacions de gens de la ruta metabòlica de la vitamina C i així, trobar una estratègia per augmentar el contingut d`aquesta vitamina en el endosperm de la llavor del blat de moro. A més a més, com a primer pas, he generat plantes de panís transgèniques que contenen múltiples gens derivats de la bactèria Bacillus thuringiensis amb activitat insecticida. Aquest després serán creaudes amb blat de moro trangénic que conté grans quantitats de vitamines. / Most staple food crops, particularly the major cereals, such as maize are deficient in key vitamins. Transgenic approaches hold great promising promise in alleviating, to a major extend such vitamins deficiencies. However, there is a limited understanding of the regulatory mechanisms that control the accumulation of specific vitamins in plants, such as vitamin C (Ascorbic acid, AsA). For that reason, I analyzed the AsA metabolism and the genetic mechanism of L-galactose biosynthesis pathway controlling ascorbic acid accumulation in corn plants and I also established a combinatorial transgenic corn population comprising different combinations of genes related to AsA metabolism, aiming to provide insight into the interactions among alternative AsA biosynthetic pathways and help in the development of strategies to boost the accumulation of AsA in the endosperm. In addition, I generated transgenic corn plants engineered with multiple insecticidal genes derived from the bacterium Bacillus thuringiensis as a first step in developing corn plants with durable resistance to insect pests. / La mayoría de los cultivos alimentarios, y en particular los cereals como el maíz son deficientes en las vitaminas básicas. Las plantas transgénicas pueden ser una solución muy prometedora para mitigar las deficiencias de vitaminas. Sin embargo, el conocimiento de los mecanismos que regulan la acumulación de determinadas vitaminas en las plantas, es limitado, como por ejemplo la vitamina C (ácido ascórbico, AsA).Para aumentar los conocimientos de la ruta metabolica de la vitamina C en maíz, he analizado el contenido de vitamina C y el mecanismo genético de las rutas metabólicas que controlan la acumulación de está en las plantas de maíz y he generado maíz transgénico que contiene diferentes genes de la ruta metabólica de la vitamina C ya que nos proporcionará una estrategia para augmentar el contenido de esta vitamina en el endospermo de maíz. Además, he generado plantas transgénicas que contienen multiples genes con actividad insecticida derivados de la bacteria Bacillus thuringiensis como primer paso, para obtener plantas resistentes a plagas que más tarde serán cruzadas con maíz nutricionalmente modificado.

"Stereoselective Synthesis of 2-Deoxyglycosides. Approach to the synthesis of Digitoxine"2-Deoxy and 2,6-dideoxy-glycosides are important structural units in many natural products including antitumor drugs (anthracyclines, aureolic acids, calicheamicin, esperamicin), antibiotics active against Gram-positive bacteria (erythromycins, orthosomycins), antibiotics inhibiting platelet aggregation (angucyclines), drugs used in the treatment of cardiac insufficiency (cardiac glycosides), antiparasitic agents (avermectins).The stereocontrolled formation of the glycosidic linkage in 2-deoxy-oligosaccharides has been found to be one of the most challenging tasks in glycosylation reactions. This could be solved using C-2 substituents (I, SeR, SR) in order to aid stereocontrol in the glycosylation step. These groups can be then easily removed under mild conditions after stereocontrol has been achieved. On the other hand, one of the most important intermediates in the synthesis of 2 deoxycarbohydrates are 1,2-unsaturated glycosides, commonly called glycals.The aim of the study reported in this thesis was to develop a new method for the stereoselective synthesis of 2-deoxyoligosaccharides and precursors such as glycals. Moreover, an approach to the synthesis of digitoxine was also reported. Thus, in a preliminary introduction, previous reported methods for the synthesis of deoxysugars were discussed. In chapter 1, we developed a new procedure for synthesizing phenyl 2-deoxy-2-iodo-1-thio-glycosides and their use as glycosyl donors for the stereocontrolled synthesis of 2-deoxy-2-iodo-oligosaccarides. The key step for the synthesis of 2-deoxy-2-iodo-1-thio-glycosides is a regio- and stereoselective 6-endo cyclization of alkenols induced by iodine electrophiles. In chapter 2, Deoxy-2-iodopyranosides were synthesized from sulfanyl alkenes using a "one pot" consecutive cyclization-glycosylation process. The "one pot" procedure was also applied to the synthesis of a 2,6-dideoxy-2-iodo-glycoside, which was successfully deiodinated to afford the 2,6-dideoxyglycoside. In chapter 3, it is showed that pyranoid glycals of all configurations can be obtained from pentoses through an olefination-cyclization-elimination sequence. This method provides access to non conventional glycals having C3-alkoxy substituent in axial configuration, such as D-allal and D gullal, which are difficult to synthesize by usual methods. Furthermore, other functionalized glycals such as 2 phenylselenenyl or 2 iodoglycals can be synthesized starting from enolthioethers by direct selenium-mediated elimination or through dehydrative reaction of 2-iodolactols, respectively. Finally, Starting from a common precursor such as D-ribonolactone, we have explored a new approach to the synthesis of digitoxine and other cardiac glycosides as application of the previous methodology developed.Títol: "Stereoselective Synthesis of 2-Deoxyglycosides. Approach to the synthesis of Digitoxine"Paraules Clau: Síntesi estereoselectiva, 2-desoxi i 2,6-didesoxiglicòsids, glicósids cardiacs, glicals i iodoglicals, síntesi "one-pot", ciclació (electròfila), digitoxina. / Informe Preceptiu sobre la Tesi doctoral "Estereoselective Synthesis of 2 Deoxyglycosides. Approach to the síntesis of Digitoxine" presentada per Miguel Àngel Rodríguez Gómez.La tesi s'emmarca dins el camp de la síntesis de carbohidrats i glicoconjugats amb estructures que presenten posicions on una o més de les funcions hidroxil característiques del sacàrids no hi estan presents. El treball realitzat ha tingut com objectiu final la síntesis estereoselectiva de 2-desoxi i 2,6-didesoxiglicòsids ja que són part constituent de moltes substàncies biològicament actives i/o productes naturals com antitumorals, antibiòtics, agents antiparasitaris, cardiotònics...i a més a més són difícils d'obtenir a partir de carbohidrats naturals. D'aquesta forma en aquesta tesi s'aborda la síntesis de 2-desoxi-2-iodo-1-tiopiranósids com a nous dadors de glicosil i la seva aplicació en la síntesis estereoselectiva d'oligosacàrids i glicòsids. Aquest dadors de glicosil es caracteritzen per la presència d'un grup fenilsulfanil com a grup sortint en la posició anomèrica (C1) i un grup iodo en el C2 que actua com element de control en la reacció de glicosilació. Aquests dos grups funcionals donen, a més a més, moltes possibilitats de derivatització i una variada reactivitat.La memòria s'ha organitzat en una introducció general sobre la biologia i la química dels 2-desoxi i 2,6-didesoxiglicòsids, un objectius, quatre capítols on es s'exposen i discuteixen els resultats obtinguts amb les seves corresponents conclusions i un annex amb els espectres dels productes seleccionats.La introducció tracta sobre la importància i el variat paper biològic dels 2-desoxi i 2,6-didesoxicarbohidrats a la vegada que parla de la dificultat i els especials problemes que comporta la síntesis química d'aquests tipus de compostos. D'aquesta forma es fa una revisió dels mètodes desenvolupats fins avui per la síntesis d'aquest glicòsids. Lligat amb aquests mètodes anteriors, en els objectius es posa de manifest la necessitat d'arribar a un nou mètode de síntesis de 2-desoxicarbohidrats que permeti assolir totes les configuracions de piranòsids possibles. En el primer capítol es desenvolupa el nou mètode d'obtenció de 2-desoxi-2 iodo-1-tioglicòsids que després es faran servir com a dadors de glicosil. D'aquesta forma, partint de pentoses de totes les configuracions i diferentment protegides es van olefinar per diversos mètodes, obtenint polihidroxihexenilsulfurs. El mètode més convenient per aquesta reacció en termes de rendiment i estereoselectivitat fou la olefinació amb oxid de fosfina (Wittig-Horner-WH). Aquests alquenols es van ciclar amb electrofils de iode, conduint de forma regioselectiva als 2-desoxi-2-iodo-1 tiopiranòsids. Aquest dadors de glicosil es van fer reaccionar amb colesterol com a model d'aglicona de diferents compostos bioactius i amb un glucosid com a model de síntesi d'oligosacàrid.En el segon capítol s'aborda la síntesis dels mateixos compostos del capítol primer aprofitant la semblança de les condicions de ciclació i de glicosilació, que permet en una sola etapa la glicosilació de diversos compostos partint de l'alquenol, un precursor acíclic molt més estable i fàcil de sintetizar que el 2-desoxi-2-iodo-tioglicòsid corresponent. Aquest procediment "one-pot" es mostra igual en diasteroselectivitat i superior en termes de rendiment i de facilitat de manipulació que la síntesi per passos del capítol 1. A més es va sintetizar un 2,6-didesoxicarbohidrat model del supressor de l'apetit P57AS3.En el tercer capítol s'exposa la síntesi de glicals a partir del 1-tio-2-desoxi-2 iodo-piranosids. El glicals són compostos molt versàtils i útils en la síntesis de carbohidrats i amb el procediment desenvolupat en aquest capítol s'arribà a obtenir glicals de configuracions difícils d'obtenir per altres mètodes, com el D-allal i el D gullal. A més, en una segona part del capítol tercer, aplicant un procediment de glicosilació estàndar per a com el de Gin ("dehydrative glycosylation") s'obtenen a partir de 2 iodolactols diversos compostos com a 2 iodoglicals, glicals o 1,1'-disacàrids.En el quart capítol tots els anteriors procediments s'apliquen en la aproximació a la síntesis d'un glicósid cardíac, la digitoxina, molt utilitzat en el tractament de la insuficiència cardíaca. D'aquesta forma es realitzà la síntesi dels alquenols precursors dels 2,6-dideoxiglicòsids que formen part de l'estructura d'aquest fàrmac (unitats de digitoxosa) i es va unir a la aglicona obtenint el monosacàrid de la digitoxigenina. A més a més es van obtenir altres intermedis valuosos, tals com el corresponents 2 iodolactols o els trichloroacetimidats, en el camí cap a la síntesis de la digitoxina i/o anàlegs.Amb el treball d'aquesta tesi els objectius inicialment proposats de desenvolupament d'un nou mètode de glicosilació per la síntesi de 2-desoxiglicòsids i han estat ampliament assolits i a més a més, s'han desenvolupat vies alternatives (glicals, lactols, 2-iodoglicals,...) que amplien els procediments sintètics inicials, ampliant les vies de síntesis dels 2-desoxiglicòsids.

En esta tesis doctoral se han estudiado procesos fundamentales de reacciones de transferencia de carga en películas mesoporosas de dióxido de titanio sensitivizado con puntos cuánticos, en películas finas de mezclas polímero:puntos cuánticos y en dispositivos completos de mezclas del polímero PCPDTBT y puntos cuánticos de CdSe en operaciones de trabajo reales. Los resultados obtenidos permiten abordar la fabricación de dispositivos fotovoltaicos con un conocimiento de los procesos de recombinación que limitan la eficiencia de las celdas más amplio. Y por tanto, se demuestra la posibilidad de fabricar celdas solares basadas en puntos cuánticos con eficiencias iguales o superiores a los dispositivos fotovoltaicos orgánicos. / The fundamental processes of the charge transfer reactions between titania dioxide mesoporous films and quantum dots, in blend films of the semiconductor polymer P3HT and CdSe quantum dots and in complete devices fabricated with the polymer PDPCTBT and CdSe quantum dots in working conditions have been studied in this doctoral thesis. The obtained results allow the fabrication of photovoltaic devices with a deeper and wider knowledge of the recombination processes that limit the device efficiency. Therefore, it is demonstrated the possibility of fabrication of quantum dot based solar cells with efficiencies similar or higher than the organic photovoltaic devices.

En aquesta tesi hem desenvolupat materials microestructurats basats en silici macroporós, centrant-nos en la producció de microestructures per la seva aplicació en biomedicina. El silici macroporós es forma per atac electroquímic de silici en electròlits basats en àcid fluorhídric. Es fabriquen mostres de silici macroporós ordenat i aleatori. Amb un procés litogràfic, es pot crear un patró predisenyat en el silici, i així definir els punts de nucleació i aconseguir porus amb un creixement ordenat i un diàmetre uniforme. L’oxidació tèrmica del silici macroporós permet la formació de noves estructures, com micropilars de SiO2. El SiO2 es normalment acceptat com un material biocompatible. Tot i això, utilitzem l’espectroscòpia infraroja per realitzar una caracterització exhaustiva i una modificació adequada de la química de superfície orientada cap a la conjugació de biomolècules. La peculiar arquitectura d’aquests substrats va permetre la creació de partícules multifuncionals amb una doble funcionalització selectiva en les cares interior i exterior. Aquestes microestructures van ser concebudes com a materials per al transport de fàrmacs. Així doncs, aquestes micropartícules de SiO2 van ser proposades com a sistemes d’alliberament de fàrmacs per control de pH quan es combinen amb polielectròlits sensibles al pH. Finalment, la doble funcionalització va ser explotada per crear micropartícules multifuncionals per l’alliberament de fàrmacs dirigida cap a cèl•lules diana. La viabilitat del sistema va ser provada amb cèl•lules cancerígenes in vitro. / En esta tesis hemos desarrollado materiales microestructurados basados en silicio macroporoso, centrándonos en la producción de plataformas y partículas para su aplicación en biomedicina. El silicio macroporoso se forma por ataque electroquímico de silicio en electrolitos basados en ácido fluorhídrico. Se fabricaron muestras de silicio macroporoso ordenado y aleatorio. Con un proceso litográfico, se puede crear un patrón prediseñado en el silicio, y así definir los puntos de nucleación y conseguir poros con un crecimiento ordenado y un diámetro uniforme. La óxidación térmica del silicio macroporoso permite la formación de nuevas estructuras, como micropilares de SiO2. El SiO2 es normalmente aceptado como un material biocompatible. A pesar de esto, utilizamos la espectroscopía infraroja para realizar una caracterización exhaustiva y una modificación adecuada de la química de superficie orientada hacia la conjugación de biomoleculas. La peculiar arquitectura de estos sustratos permitió la creación de partículas multifuncionales con una doble functionalización selectiva en las caras interior y exterior. Estas microestructuras fueron concebidas como materiales para el transporte de fármacos. Así pues, estas micropartículas de SiO2 fueron propuestas como sistemas de liberación de fármacos por control de pH cuando se combinan con polielectrolitos sensibles al pH. Finalmente, la doble funcionalización fue explotada para crear micropartículas multifunctionales para la liberación de fármacos dirigida hacia células diana. La viabilidad del sistema fue probada con células cancerígenas in vitro. / This thesis has explored the fabrication of silicon oxide (SiO2) microstructures based on macroporous silicon (macro-pSi), with a focus on producing suitable platforms and particles for application in biomedicine. Macroporous silicon was formed by the electrochemical etching of low doped p-type silicon in hydrofluoric acid based solutions. Both random and ordered structures were fabricated. A patterning lithography prior etching led to an ordered pore nucleation and consequently tubular structures of uniform size were produced. Thermal oxidation of macro-pSi allowed the formation of novel structures such as SiO2 micropillars, with identical arrangement and dimensions of those in the preceding macro-pSi. SiO2 is generally accepted as a biocompatible material; nevertheless, a methodical study of the surface chemistry and its modification was performed by infrared (IR) spectroscopy to generate surfaces capable of interfacing with living cells. The particular architecture of these substrates allowed creating multifunctional particles with a selective dual functionality in nanometrically separated internal and external sides. We also foresaw these microstuctured materials as drug carriers. Thus, SiO2 microparticles were proposed as pH-controlled drug delivery system when they are combined with pH-responsive polyelectrolytes. Finally, a dual-functionalization of the inner/outer sides was employed for creating multifunctional microparticles, which were demonstrated to be cancer-targeted in in vitro tests.

El objeto de esta tesis está representado por las repeticiones de palabras parciales, palabras que, además de las letras regulares, pueden tener un número de símbolos desconocidos,llamados símbolos "agujeros" o "no sé qué". Más concretamente, se presenta y se resuelve una extensión de la noción de repetición establecida por Axel Thue. Investigamos las palabras parciales con un número infinito de agujeros que cumplen estas propiedades y, también las palabras parciales que conservan las propiedades después de la inserción de un número arbitrario de agujeros, posiblemente infinito. Luego, hacemos un recuento del número máximo de 2-repeticiones distintas compatibles con los factores de una palabra parcial. Se demuestra que el problema en el caso general es difícil, y estudiamos el problema en el caso de un agujero. Al final, se estudian algunas propiedades de las palabras parciales sin fronteras y primitivas (palabras sin repeticiones) y se da una caracterización del lenguaje de palabras parciales con una factorización crítica.