Il existe plus de 100 formes de pathologies hépatiques causées par divers facteurs et touchant une grande quantité de personnes. Mais, le seul traitement pour les maladies du foie en phase terminale est la greffe du foie. Cependant, la greffe de foie échoue souvent à cause du déficit en donneurs hépatiques. Récemment, une nouvelle alternative innovante pour traiter les maladies du foie apparaît : les organes auto-construits. En ingénierie tissulaire du foie, la source de cellules, l’échafaudage décellularisé du foie et les bioréacteurs, sont des facteurs à prendre en compte. L’objectif de ce travail de thèse est d’étudier deux étapes nécessaires au développement d’un foie artificiel : les cellules et la décellularisation de l’organe. Tout d’abord, nous avons prélevé et caractérisé les cellules souches mésenchymateuses de la gelée de wharton (CSMs-GW) CSMs-GW et nous avons étudié leur potentiel de différenciation en hépatocytes. La deuxième étape du travail est consacrée à la décellularisation du foie. Nous avons obtenu des scaffolds acellulaires par la perfusion continue avec du SDS 1% et triton-X100 1%. En conclusion, cette étude montre la capacité de CSM-GW de se différencier en hépatocytes et la faisabilité de la décellularisation du foie. Ceci ouvre des perspectives intéressantes pour le développement d’un foie artificiel et le traitement des pathologies hépatiques / There are over 100 forms of liver diseases caused by various factors and affecting a lot of people. Unfortunately, the only treatment of a terminal liver disease is liver transplantation. However, liver transplantation often fails because of the deficit in human liver donors. Recently, a new innovative alternative for treating end-stage liver disease appears: self-built organ. In liver tissue engineering the source of cells, the decellularized liver scaffold and circular culture bioreactor, are essential factors to be taken into account. The objective of this thesis is to study two steps needed for the development of an artificial liver : cells and organ decellularization. In the first stage, we collected and characterize Wharton’s-Jelly mesenchymal stem cells (WJ-MSCs), and their differentiation potential into hepatocytes. In the second stage of the work, we developed a method for liver decellularization. We were able to get acellular scaffolds by continuous perfusion with 1% SDS and Triton X100 1%. In conclusion, this study shows the capability of WJ-MSC to be differentiated into hepatocytes and the feasibility to obtain acellular livers. That open perspectives toward the development of an artificial liver and the treatment of liver diseases

Les cellules stromales/souches mésenchymateuses de la gelée de Wharton humaines (CSM-WJ) représentent une source abondante et intéressante de cellules souches pour des applications en ingénierie cellulaire et tissulaire. Leur origine fœtale leur confère des caractéristiques spécifiques par rapport aux cellules stromales/souches mésenchymateuses isolées à partir de moelle osseuse humaine (CSM-MO). Tout d'abord, le but de ce travail est d'optimiser les conditions de culture des CSM-GW pour leur utilisation clinique ultérieure. Nous nous concentrons sur l'influence de la concentration en oxygène lors de l'expansion en monocouche de P1 à P7 sur plusieurs paramètres permettant de caractériser les CSM. Les résultats obtenus sont comparés à ceux obtenus avec les CSM-MO. Notre travail a montré des différences entre les deux sources cellulaires en termes de prolifération et de différenciation adipocytaire. D’après nos résultats, l'hypoxie, au cours de l'expansion, est un paramètre important à prendre en compte en ce qui concerne la prolifération et le potentiel de différenciation chondrocytaire. L'influence des facteurs obstétricaux sur les caractéristiques des CSM-GW est également explorée. Cette étude se situant également dans le cadre de l’ingénierie tissulaire du cartilage, la seconde phase du projet consiste à induire la différenciation des cellules en chondrocytes en ensemençant ces dernières dans un biomatériau à base d’alginate et d’acide hyaluronique, et sur une cinétique de 28 jours. Les résultats obtenus sont comparés à ceux obtenus avec les CSM-MO. Après 4 semaines de culture, les CSM-GW sont capables de s'adapter à leur environnement et d’exprimer des gènes et des protéines matriciels spécifiques du cartilage tels que le collagène de type 2, qui se trouve plus exprimé après différenciation à partir des CSM-GW qu’à partir de CSM-MO / Mesenchymal Stromal/Stem Cells from human Wharton’s jelly (WJ-MSC) are an abundant and interesting source of stem cells for applications in cell and tissue engineering. Their fetal origin confers specific characteristics compared to Mesenchymal Stromal/Stem Cells isolated from human bone marrow (BM-MSC). First, the aim of this work is to optimize WJ-MSC culture conditions for their subsequent clinical use. We focus on the influence of oxygen concentration during monolayer expansion on several parameters to characterize MSC. The results are compared to those obtained with BM-MSC. Our work distinguishes WJ-MSC from BM-MSC in terms of proliferation and adipogenic differentiation. Considering our results, hypoxia during cell expansion is an important parameter to take into account regarding proliferation potential but also chondrogenic differentiation potential. The influence of obstetric factors on WJ-MSC characteristics is also explored. In cartilage tissue engineering context, the second phase of the project is to induce cell differentiation into chondrocytes by seeding them in Alginate/Hyaluronic Acid hydrogel scaffold, and during 28 days. The results obtained are compared to those obtained with BM-MSC. After 4 weeks of culture, WJ-MSC are able to adapt to their environment and express specific cartilage-Related genes and matrix proteins such as type 2 collagen, which is found more expressed after differentiation fromWJ-MSC, than from BM-MSC

Les pathologies musculo-squelettiques affectant les os et les articulations demeurent un défi pour la médecine régénératrice. Les difficultés retrouvées sont liées aux besoins d’une vascularisation tissulaire optimale pour les substituts osseux et à l’obtention d’un cartilage de qualité pour les substituts articulaires. Les objectifs de ces travaux de thèse étaient de parvenir à différencier des cellules souches mésenchymateuses (CSM) ombilicales humaines – outil de choix en médecine régénérative - vers un phénotype vasculaire et un phénotype chondrogénique articulaire pour répondre aux besoins de l’ingénierie tissulaire musculo-squelettique. La différenciation de CSM ombilicales en cellules musculaires lisses vasculaires a été montrée après 12 jours de stimulation par des facteurs solubles comme le transforming growth factor (TGF)-beta1 et l’acide ascorbique. Face aux limites des supports de culture en deux dimensions in vitro, un modèle de culture tridimensionnel a été mis en place à l’aide de CSM cultivées en “pellets” en présence ou non d’une solution matrice extracellulaire (MEC) ombilicale pour les expériences suivantes. Les facteurs solubles disposant d’une efficacité limitée et étant souvent onéreux, une transduction des “pellets” de CSM-GW a été réalisée à l’aide de virus adéno-associés recombinants (rAAV) permettant une synthèse de facteurs par les cellules à plus long terme. Ici, les pellets ont été transduits à l’aide de rAAV contenant le gène du facteur de transcription Sox9 afin d’induire une différenciation chondrogénique articulaire. Ces travaux démontrent l’intérêt d’associer la MEC et les CSM ombilicales humaines dans un modèle de culture en trois dimensions, ainsi que les outils de thérapie génique comme les rAAV pour constituer des implants utilisables pour régénérer les tissus musculo-squelettiques / Musculoskeletal conditions affecting bones and joints remain a challenge for regenerative medicine. The difficulties found are related to the needs of an optimal tissue vascularization for bone substitutes and to obtain a cartilage of quality for articular substitutes. The objectives of this PhD work were to differentiate human umbilical mesenchymal stem cells (MSC) - a tool of choice in regenerative medicine - towards a vascular phenotype and a joint chondrogenic phenotype to meet the needs of musculoskeletal tissue engineering. The differentiation of umbilical MSC into vascular smooth muscle cells was shown after 12 days of stimulation by soluble factors such as transforming growth factor (TGF)-beta1 and ascorbic acid. Facing the limits of two-dimensional culture supports in vitro, a three-dimensional culture model was set up using MSC cultured in pellets with or whitout an umbilical extracellular matrix (ECM) solution for the following experiences. Soluble factors have a limited efficacy and are often expensive, a transduction of MSC pellets was performed using recombinant adeno-associated viruses (rAAV) allowing a long term synthesis of factors by the cells. Here, the pellets were transduced using rAAV containing the Sox9 transcription factor gene to induce articular chondrogenic differentiation. This work demonstrates the interest of associating ECM and human umbilical MSC in a three-dimensional culture model, as well as gene therapy tools such as rAAVs to provide grafts that can be used to regenerate musculoskeletal tissues / Muskel- und Skeletterkrankungen an Knochen und Gelenken bleiben eine Herausforderung für die regenerative Medizin. Die Schwierigkeiten stehen im Zusammenhang mit den Ansprüchen einer optimalen Gewebevaskularisierung der Knochenersatzstoffe und damit, einen qualitativ hochwertigen Knorpel für den Gelenkersatz zu erhalten. Das Ziel dieser Doktorarbeit war es, humane mesenchymale Stammzellen (MSZ) aus der Nabelschnur, die das Werkzeug der Wahl in der regenerativen Medizin sind, in einen vaskulären und in einen chondrogenen Phänotyp zu differenzieren, um den Anforderungen des muskuloskeletalen Tissue Engineerings zu entsprechen. Die Differenzierung von Nabelschnur-MSZ in vaskuläre glatte Muskelzellen konnte durch Stimulation mit löslichen Faktoren wie dem Transforming Growth Factor (TGF)-beta1 und Ascorbinsäure nach 12 Tagen gezeigt werden. Angesichts der Grenzen einer zweidimensionalen Zellkultur in vitro, wurde ein dreidimensionales Kulturmodell, in dem MSZ in Pellets mit oder ohne extrazelluläre Matrix der Nabelschnur (EZM) kultiviert wurden, für die weiteren Versuche erstellt. Lösliche Faktoren haben eine limitierte Wirksamkeit und sind häufig teuer. Deshalb wurden die MSZ-Pellets mit rekombinanten Adeno-assoziierte Viren (rAAV) transduziert, was eine Synthese der Faktoren durch die Zellen über einen längeren Zeitraum ermöglicht. In unserem Fall wurden die Pellets mit rAAV, die das Transkriptionsgen Sox9 enthalten, tranzduziert, um eine artikuläre chondrogene Differenzierung zu induzieren. Diese Arbeit zeigt, dass es von Interesse ist EZMs und humane Nabelschnur-MSZ in einem dreidimensionalen Kulturmodell zu vereinen. Auch wird gezeigt, dass Werkzeuge der Gentherapie wie rAAVs, die den Transplantaten zugeführt werden, helfen können muskuloskeletales Gewebe zu regenerieren

Le cartilage articulaire est un tissu avasculaire et non innervé, ce qui lui confère des capacités de réparation très limitées. Les traitements chirurgicaux actuels ne permettent pas d’obtenir un tissu de réparation similaire au cartilage natif. Les recherches s’orientent depuis de nombreuses années vers l’ingénierie cellulaire et tissulaire du cartilage selon le type de lésions à traiter, focale ou diffuse. Les cellules souches mésenchymateuses (CSMs) constituent une source cellulaire intéressante pour l’ingénierie du cartilage. Elles sont facilement accessibles et ont des potentialités de différenciation chondrogénique. Les CSMs issues de la moelle osseuse sont les plus étudiées et constituent la référence. D’autres sources de CSMs sont également très prometteuses. Notre choix s’est porté sur les CSMs issues de la membrane et du liquide synovial. Ces deux tissus articulaires présentent l’avantage de pouvoir être prélevés facilement lors d’un examen arthroscopique et leurs CSMs sont adaptées au microenvironnement (hypoxie, inflammation) de l’articulation. Ce travail a porté sur l’étude de deux sources cellulaires d’origine synoviale dans le traitement des lésions focales et diffuses du cartilage. Ces CSMs d’origine synoviale ont d’abord été caractérisées selon leurs phénotypes et leurs capacités de différenciation vers les voies ostéogénique, adipogénique et chondrogénique, par rapport aux CSMs issues de la moelle osseuse. Ensuite, les capacités chondrogéniques de ces CSMs synoviales destinées à produire un substitut cartilagineux consacré aux traitements des lésions focales du cartilage articulaire ont été étudiées. Les CSMs ont été ensemencées dans un biomatériau collagénique et différentes conditions environnementales (facteurs de croissance et oxymétrie) ont été évaluées afin de définir les conditions de culture les plus appropriées. La chondrogenèse a été induite avec succès par l’utilisation de facteurs de croissance tels que TGF-1 et TGF-3 seuls ou en association avec la BMP-2. L’hypoxie n’a pas montré d’effet bénéfique sur la synthèse matricielle au sein des substituts cartilagineux. Enfin, nous avons évalué les capacités des CSMs issues du liquide synovial à traiter les lésions diffuses du cartilage induites par un modèle de section du ligament croisé antérieur chez le rat athymique. Les deux injections intra-articulaires de CSMs issues du liquide synovial à 1 et 2 semaines après chirurgie n’ont pas permis de prévenir les lésions arthrosiques. / Joint cartilage is avascular and not innervated, which gives it very limited repair capabilities. Current surgical treatments do not provide repair tissue similar to native cartilage. For many years, research has been focused on cellular and tissue engineering of cartilage depending on the type of lesions to be treated, focal or diffuse. Mesenchymal stem cells (MSCs) are an interesting cellular source for cartilage engineering. They are easily accessible and have the potential for chondrogenic differentiation. MSCs from bone marrow are the most studied and are the gold-standard. Other MSCs sources of are also very promising. We chose MSCs from the synovial membrane and synovial fluid. These both joint tissues have the advantage of being easily retrievable during arthroscopic examination and their MSCs are adapted to the microenvironment (hypoxia, inflammation) of the joint. This thesis work focused on the study of two cellular sources of synovial origin in the treatment of focal and diffuse cartilage lesions. These synovial-derived MSCs were first characterized according to their phenotypes and their ability to differentiate to the osteogenic, adipogenic and chondrogenic pathways, compared to bone marrow derived MSCs. Then, the chondrogenic capacities of these synovial MSCs to produce a cartilage substitute for the treatment of focal lesions of joint cartilage were studied. The MSCs were seeded in a collagenic biomaterial and different environmental conditions (growth factors and oximetry) were evaluated to define the most appropriate culture conditions. Chondrogenesis has been induced with success by the use of growth factors such as TGF-β1 or TGF-β3 alone or in combination with BMP-2. Hypoxia has not exerted a beneficial effect on matrix synthesis in cartilage substitutes.Finally, we evaluated the ability of CSMs from human synovial fluid to treat diffuse cartilage lesions induced by an anterior cruciate ligament section model in athymic rats. The two intra-articular injections of synovial fluid MSCs, 1 and 2 weeks after surgery did not prevent osteoarthritic lesions.

L'ingénierie tissulaire du ligament constitue une approche prometteuse pour réparer ou remplacer un ligament endommagé. Les trois piliers essentiels de l'ingénierie tissulaire ligamentaire sont la matrice de support (aussi appelée scaffold), la source cellulaire, ainsi que l'apport de stimulations biomécaniques/biochimiques : ces trois piliers ont été partiellement étudiés par le passé dans le but de s’orienter vers une régénération ligamentaire. Dans la présente étude, le polymère synthétique poly (L-lactide-co-ε-caprolactone) (PLCL) et la soie ont été proposés et comparés comme de potentiels candidats pour la constitution d’une matrice de support. Une série de matrices tressées multicouches à base de PLCL et de soie, ainsi qu'un nouveau composite soie/PLCL ont été développés et comparés. Les caractérisations physico-chimiques et biologiques ont démontré que le PLCL et la soie constituent des candidats pertinents, tant sur les plans mécaniques que biologiques, pour la constitution d’une matrice de support. De plus, nous avons montré que le composite soie/PLCL offrait des propriétés mécaniques et une biocompatibilité accrue par rapport aux autres matrice testées, et constituait probablement le candidat le plus approprié pour l'ingénierie tissulaire du ligament. Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) de la gelée de Wharton (WJ-MSCs) ainsi que les cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse (BM-MSCs) ont été évaluées et comparées en tant que sources cellulaires potentielles pour la régénération ligamentaire. Les caractéristiques biologiques de ces cellules incluent l’adhésion cellulaire, la prolifération, la migration et la synthèse de matrice extracellulaire. Ces deux types de cellules ont montré une bonne biocompatibilité dans leurs interactions avec les matrices de support en PLCL et en soie. Aucune différence significative n'a été observée entre les WJ-MSCs et les BM-MSCs. Enfin, l'effet de la stimulation biomécanique sur la différentiation des CSM en tissu ligamentaire a été évalué par le biais d’un bioréacteur de traction-torsion. Bien que peu de cellules aient été détectées la matrice après 7 jours de stimulation, des CSM de forme allongée le long des fibres ont été détectées, ce qui permet de penser qu'il est possible de promouvoir la différenciation des biosubstituts matrice-cellules grâce à la stimulation mécanique en bioréacteur. En conclusion, cette étude démontre le potentiel prometteur de l’association de cellules souches mésenchymateuses issues de la gelée de Wharton ou de la moelle osseuse avec une matrice de support composite soie/PLCL pour la régénération ligamentaire dans le futur. / Ligament tissue engineering offers a potential approach to recover or replace injured ligament. The three essential elements that have been investigated towards ligament regeneration consist in a suitable scaffold, an adapted cell source, and the supply of biomechanical/biochemical stimulations. In the current study, synthetic polymer poly (L-lactide-co-ε-caprolactone) (PLCL) and silk have been evaluated as suitable candidates to constitute an adapted scaffold. A series of multilayer braided scaffolds based on PLCL and silk, as well as an original silk/PLCL composite scaffold, have been developed and compared. The conducted physicochemical and biological characterizations have demonstrated that both PLCL and silk constitute adapted candidate material to form ligament scaffolds from the mechanical and biological points of view. Moreover, it has been observed that silk/PLCL composite scaffold resulted in adequate mechanical properties and biocompatibility, and therefore could constitute suitable candidate scaffolds for ligament tissue engineering. Both Wharton’s Jelly mesenchymal stem cells (WJ-MSCs) and Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSCs) have been evaluated to be cell source for ligament regeneration. MSCs behaviors including cell attachment, proliferation, migration and extracellular matrix synthesis have been investigated. In the present study, both MSCS showed a good biocompatibility to interact with PLCL and silk scaffolds. No significant differences have been detected between WJ-MSCs and BM-MSCs. Finally, the effect of biomechanical stimulation on MSCs differentiation towards ligament tissue has been carried out with a tension-torsion bioreactor. Although few cells were detected on scaffold after 7 days of stimulation, MSCs were observed to exhibit an elongated shape along the longitudinal direction of fibers, which may indicate that an adapted mechanical stimulation could promote MSC-scaffold constructs differentiation towards ligamentous tissue. As a conclusion, this study demonstrates the potential of WJ-MSCs and BM-MSCs combined with a new silk/PLCL composite scaffold towards ligament regeneration.