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6-Thioguanine (6-TG) incorporation into DNA is an inevitable consequence of treatment with the immunosuppressive drug Azathioprine (Aza). On administration, Aza is chemically cleaved to form 6-mercaptopurine which, after further metabolism, results in the accumulation of DNA 6-TG. Unlike the standard DNA bases, 6-TG absorbs strongly in the UVA region of the electromagnetic spectrum. I have shown that 6-TG and UVA interact in solution to form two major photoproducts. These have been identified as guanine-6-thioguanine (G-S-G) and guanine-6-sulfonate (G-6-SO3). These photoproducts are formed via singlet oxygen generated by 6-TG acting as a Type II photosensitiser. G-6-SO3 is also formed by UVA irradiation of the 6-TG deoxyribonucleoside as well as from 6-TG in both single- and double-stranded DNA. A significant level of DNA 6-TG has been measured in a number of human cell lines following growth in medium containing 6-TG. This DNA 6-TG sensitises the cells to killing by low doses of UVA. Cytotoxicity is not influenced by mismatch repair or nucleotide excision repair status. Sub-lethal combinations of 6-TG and UVA are synergistically mutagenic. I show that the 6-TG/UVA mutation spectrum differs from spontaneous and UVA spectra, and contains a high number of G to C and A to C transversions. 6-TG/UVA treatment of cells generates measurable levels of potentially mutagenic reactive oxygen species, a significant fraction of which is produced in DNA itself. 6-TG/UVA inhibits replication in cells. In response, PCNA becomes mono- ubiquitinated, suggesting possible translesion synthesis at the photochemical DNA lesions. Strikingly, 6-TG/UVA also causes covalent crosslinking of PCNA at the replication fork. This may also reflect reactions of singlet oxygen. DNA 6-TG has been quantified in skin biopsies from Aza treated patients. An investigation into the possible role of 6-TG/UVA-induced mutagenic DNA damage in the development of basal cell carcinoma in Aza patients has been initiated.

Therapeutic antibodies are highly versatile macromolecules that can be engineered to bind and inhibit a target with high specificity. Unfortunately, the cell membrane is impenetrable to antibody reagents, thus limiting their use almost entirely to extracellular targets. Expanding the application of therapeutic antibodies to intracellular targets is an exciting concept that could have a huge impact on how intracellular protein-protein interactions involved in diseases can be modulated. The modification of therapeutic antibodies with Cell Penetrating Peptides (CPPs) can enable cellular penetration, however, no general approach to modifying antibodies with CPPs has been developed that allows for systematic optimisation of both the in vivo and cell penetrating properties. In this study, neutralising single-chain variable fragment antibodies (scFvs) have been isolated from naïve scFv libraries using antibody phage display that are specific to the model intracellular targets Bcl-2 and Bcl-xL. Lead scFvs showed potent inhibition of these proteins in an in vitro assay with IC50 values of <10 nM being calculated, which is superior to the small molecule Bcl-2/xL inhibitor ABT-737. The lead anti-Bcl-xL scFv was conjugated to the CPPs octa-arginine, HIV Tat49-57 or Antp52-58. These peptides were synthesised to possess either an N-isobutyryl cysteinyl or N-maleimidopropionyl moiety and a C-terminal lysine residue, allowing for site-specific conjugation to an unpaired cysteine residue introduced to the scFv construct and regioselective introduction of 5-carboxyfluorescein to the CPP, respectively. Live-cell confocal microscopy showed that the scFv-octa-arginine conjugate possessed superior cell entry capabilities compared to the scFv-Tat49-57 and scFv-Antp52-58 conjugates. Further studies using a panel of cancer cell lines are required to determine if the anti-Bcl-xL scFv-octa-arginine conjugate can induce apoptosis through inhibition of cellular Bcl-xL. Additonally, a novel approach to controlling the cell penetrating properties of the CPP octa-arginine has been developed. It was demonstrated that carbamate protection of octa-arginine’s guanidine functionality effectively inhibited its cell entry capabilities. Moreover, esterase-labile acyloxymethyl carbonyl (AM) protecting groups were utilised to protect the guanidine functionality of octa-arginine, inhibiting its cell entry capabilities. In a HPLC based assay it was demonstrated that the AM protected octa-arginine was deprotected by pig liver esterase, suggesting that in vivo deprotection could be achieved by serum esterases. The controlled unmasking of octa-arginine is predicted to increase its circulation time and reduce non-specific tissue uptake in vivo, potentially making this CPP more suitable for in vivo applications. The methodologies utilised for the preparation of scFv-CPP conjugates and developed for the controlled unmasking of octa-arginine in this study will allow for optimisation of the cell penetrating and in vivo properties of this promising class of macromolecular therapeutic, thus providing a gateway to unlocking the immense potential of therapeutic intracellular antibodies.  .

Στόχος της παρούσας ερευνητικής εργασίας είναι να διερευνηθεί η επίδραση της ιμικουϊμόδης, ενός τοπικώς εφαρμοζόμενου στο δέρμα αγωνιστού των Toll-like 7 υποδοχέων (Τoll-like receptors, ΤLRs), στην συστηματική ανοσία σε ασθενείς με δερματικές HSV και HPV λοιμώξεις. Πιο αναλυτικά θέλουμε να διερευνήσουμε μήπως η τοπική χορήγηση ιμικουϊμόδης μπορεί να επηρεάσει τις κυτταροκίνες που συμμετέχουν στους μηχανισμούς φυσικής και επίκτητης ανοσίας και τους κυτταρικούς πληθυσμούς και όπως είναι τα Τ κύτταρα (βοηθητικά, κυτταροτοξικά, παρθενικά, μνήμης, ενεργοποιημένα και ρυθμιστικά), τα Β κύτταρα και τα φυσικά φονικά κύτταρα (ΝΚ). Οι TLRs είναι ο συνδετικός κρίκος μεταξύ φυσικής και επίκτητης ανοσίας εφόσον είναι οι υποδοχείς που αναγνωρίζουν και προσδένουν μοριακές δομές των παθογόνων (pathogen associated molecular patterns-PAMPs). Η έκφραση TLRs έχει εντοπιστεί σε πολλούς κυτταρικούς όπως ουδετερόφιλα, μακροφάγα, δεντριτικά κύτταρα, ενδοθηλιακά κύτταρα της δερμίδας, επιθηλιακά κύτταρα των βλεννογόνων, Β και Τ κύτταρα. Η ενεργοποίηση των TLRs οδηγεί σε έκκριση κυτταροκινών και χημειοκινών που έχουν σαν στόχο την ενεργοποίηση της φυσικής ανοσίας, που προκαλεί τελικά την δημιουργία της επίκτητης ανοσίας. Οι ιμιδαζοκινολίνες συνιστούν μία κατηγορία νουκλεοσιδικών αναλόγων που αναπτύχθηκαν σαν αντιϊκοί παράγοντες. Η ιμικουϊμόδη είναι ένας εκπρόσωπος των ιμιδαζοκινολινών που χρησιμοποιείται για την θεραπεία των κονδυλωμάτων και των επιθηλιακών καρκίνων του δέρματος. Η ιμικουϊμόδη (imiquimod) είναι προσδέτης των TLRs - πιο ειδικά του TLR-7 και χορηγείται τοπικά υπό την μορφή αλοιφής. Έχει χαρακτηριστεί σαν ανοσορρυθμιστικός παράγοντας, γιατί μέσω της πρόσδεσης της στον TLR-7 προκαλεί ένα σύνολο αντιδράσεων όπως η αύξηση της κυτταροτοξικότητας των φυσικών φονικών κυττάρων (ΝΚ), η ενεργοποίηση των μακροφάγων να εκκρίνουν κυτταροκίνες, η ενεργοποίηση και η μετανάστευση των κυττάρων του Langerhans από το δέρμα στους λεμφαδένες και η επαγωγή του πολλαπλασιασμού και της διαφοροποίησης των Τ και Β κυττάρων. Επί του παρόντος παραμένει άγνωστο αν η τοπικώς εφαρμοζόμενη ιμικουϊμόδη είναι σε θέση να εξασκεί επιπλέον της τοπικής και συστηματική ανοσοτροποποιητική δράση. Για τον λόγο αυτό στην παρούσα εργασία μελετήσαμε την επίδραση της ιμικουϊμόδης στο ανοσοποιητικό σύστημα υγιών μαρτύρων και ασθενών με HSV και HPV λοιμώξεις τόσο σε επίπεδο κυτταροκινών με την μέθοδο Cytometric bead array (CBA) όσο και σε επίπεδο κυκλοφορούντων κυτταρικών πληθυσμών στο περιφερειακό αίμα με κυτταρομετρία ροής (FACS). Τα αποτελέσματα μας υποδεικνύουν ότι η τοπική εφαρμογή της ιμικουϊμόδης είναι ικανή να προκαλέσει συστηματική ανοσοτροποποίηση και αυτό αποτελεί μια νέα και αποτελεσματική εναλλακτική θεραπεία. / In this study we investigate the influence of imiquimod, a topical applicable agonist of Toll-like receptor 7 (TLR7) in skin, on systemic immunity of patients with herpes simplex virus (HSV) and human papilloma virus (HPV) infections. We investigated whether the topical application of imiquimod affects cytokines which participate in mechanisms of innate and adaptive immune responses and cell populations, such as T-cells (helper, cytotoxic, naïve, memory, activated and regulatory), B-cells and natural killer cells (NK cells). TLRs help to bridge the gap between innate and adaptive immunity, since they recognize and bind pathogen associated molecular patterns of pathogens. The expression of TLRs has been detected on neutrophils, macrophages, dendritic cells, dermal endothelial cells, mucosal epithelial cells, T and B cells. Activation of TLRs mediates the release of cytokines and chemokines that recruit innate immune responses, which lead to the formation of adaptive immunity. Imidazoquinolines represent a group of nucleoside analogues that have been used as antiviral agents. Imiquimod belongs to imidazoquinolines and it has been used for the treatment of genital warts (caused by HPV) and cutaneous cancers. Imiquimod is a ligand of TLR7 and a patient-applied cream. It has been characterized as an immune response modifier, because through its binding to TLR7 it generates a cascade of reactions such as upregulation of cytotoxicity in NK cells, activation of macrophages to secrete cytokines, activation and migration of Langerhans cells from skin to lymph nodes and induction of proliferation and differentiation of T and B cells. Currently it is unknown if the topical application of imiquimod is able to exert, apart from a local, also a systemic immunomodulatory action. For this reason we tried to elucidate the effects of imiquimod on the immune system of patients with HSV and HPV infections at two levels. First we have measured the circulating cell populations in whole blood using flow cytometry and secondly we have determined the serum levels of IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-α, IFN-α and IFN-γ with cytometric bead array. The results demonstrate that our hypothesis is correct and imiquimod could be an alternative and effective treatment of cutaneous HSV and HPV infections.

L’énorme diversité des immunoglobulines (IG) permet la reconnaissance spécifique d’un nombre presqu’infini d’antigènes, et assure à l’organisme une protection à long-terme envers les pathogènes déjà rencontrés. La région déterminant de la complémentarité 3 (CDR3) de la chaine lourde des IG est le principal déterminant de la spécificité de l’IG. A l’aide des technologies de séquençage à haut débit, nous avons évalué si une vaccination peut conduire à la production d’IG antigène-spécifiques et partagées entre individus (réponse humorale publique), en nous intéressant particulièrement à la région CDR3. Ces «signatures» antigène-spécifiques peuvent potentiellement être utilisées pour reconstruire a posteriori l’histoire immunitaire d’un individu. Pour tester cette hypothèse, des rats transgéniques produisant des anticorps humains (OmniRatTM) ont été vaccinés avec divers antigènes, en particulier du virus de la rougeole (souche vaccinale et sauvage). Une forte réponse immunitaire publique a été observée au sein de différents groupes de rats, caractérisée par des séquences CDR3 partagées entre les animaux ayant reçu le même vaccin. Ces groupes de CDR3s constituent des signatures complexes antigène-spécifiques. De futures études de suivi vaccinal et d’infection devraient nous permettre de déterminer si les signatures identifiées se retrouvent également chez l’humain. Ces outils pourront se révéler précieux dans le cadre de la campagne de l'Organisation mondiale de la Santé en vue de l’éradication de la rougeole, en permettant de distinguer entre les individus vaccinés et infectés / The enormous diversity of immunoglobulins (IG) allows the specific recognition of an almost infinite number of antigens, and ensure a long-term protection against pathogens previously encountered by the organism. The complementarity-determining region 3 (CDR3) of the immunoglobulin heavy chain (IGH) is the major antigen binding domain and determinant of antigen-specificity of the antibody molecule. Using next-generation sequencing, we tested whether immunization resulted in the generation and accumulation of similar IGH CDR3 sequences that are antigen-specific and shared across individuals, i.e. public IGH CDR3s. Such public "antigen-specific signatures" can potentially be used to retrospectively reconstruct past antigenic challenges. To test this hypothesis, transgenic rats with fully functional human Ig heavy and light chain loci (OmniRatTM) have been immunized with diverse antigens, and particularly measles virus (MV)-derived antigen. We demonstrated a strong public immune response within the different groups of rats characterized by convergent IGH CDR3 amino acid sequences in the animals that received the same vaccine. These clusters of CDR3s represent complex antigen-specific IGH CDR3 signatures. We are now transposing this concept to human studies by performing infection and vaccination follow ups to test whether similar CDR3 signatures can also be found in peripheral blood B cells. In the context of the MV eradication campaign of the World Health Organization, new epidemiological tools that enable to distinguish between immunized and infected individuals would be valuable assets

Acteur clé de la symbiose hôte-microbiote, les IgA sécrétoires modulent le microbiote et participe à l'homéostasie intestinale. Chez la souris, les IgA sont polyréactives, en reconnaissent diverses bactéries, elles régulent la composition du microbiote et réduisent l'inflammation intestinale. Ces observations ouvrent des perspectives thérapeutiques intéressantes. Cependant, les caractéristiques des IgA et leurs spécificités restent mal connues chez l'homme. L'objectif de ce travail a donc été d'étudier la spécificité de la réponse IgA, en distinguant IgA1 et IgA2. La mise au point d'une technique de production in vitro d'IgA monoclonales 100% humaines issues de l'intestin nous a permis de montrer le profil de polyréactivité des IgA. Chaque IgA interagit avec un spectre large mais défini de bactéries commensales. Par ailleurs, les IgA1 et les IgA2 ciblent la même fraction du microbiote. Les réponses IgA1 et IgA2 convergent aussi au niveau des épitopes polysaccharidiques reconnus. Si les IgA sécrétoires contribuent largement à l’homéostasie intestinale, des IgG sériques anti-microbiote jouent un rôle dans la relation symbiotique hôte-microbiote. Leur présence n’ayant pas encore été démontrée chez l’homme en condition physiologique, ce travail a eu pour objectif secondaire de les explorer. Le développement d’une technique de cytométrie bactérienne nous a permis de détecter des IgG ciblant les bactéries commensales dans le sérum des individus sains. Ces IgG anti-microbiote sont dirigées vers les bactéries déjà reconnues par les IgA sécrétoires, elles présentent des spécificités propres à chaque individu. / IgA, the dominant immunoglobulin produced in the gut, plays diverse roles ranging from toxin neutralization, immune functions regulation, intestinal homeostasis maintenance. It is now well established that polyreactive IgA, which target multiple bacteria, can modulate gut microbiota composition and have promising therapeutic effects. However, IgA features remain elusive in humans. We therefore determined the reactivity profile of native monoclonal antibodies from human colon and compared IgA1 and IgA2. We found that IgA are polyreactive and bind a diverse but restricted subset of gut commensals. Most commensals were dually coated by IgA1 and IgA2, yet IgA2 alone coated a distinct fraction of colonic bacteria. Besides their common microbial targets, IgA1 and IgA2 exhibited overlapping anti-carbohydrate repertoires. An essential link between IgA and IgG responses against microbiota has been recently demonstrated in mice. Nevertheless, it remains unclear whether symbiotic bacteria could induce systemic IgG under homeostatic conditions in humans. Hence, we characterized anti-microbiota IgG in serum of healthy donors by bacterial flow cytometry. We found that each individual harbored a diverse and private panel of anti-commensals IgG that converge with secretory IgA to cover a restricted fraction of the gut microbiota. Patients with IgA deficiency or common variable immunodeficiency (CVID) exhibited a distinct set of anti-commensals IgG suggesting that IgA replacement in addition to polyvalent IgG might be beneficial to treat gastro-intestinal symptoms in these patients.

L’immunoglobuline A (IgA) est l’immunoglobuline la plus abondamment synthétisée chez les mammifères. Ses propriétés ambivalentes l’impliquent non seulement dans des fonctions de protection contre les agents pathogènes mais aussi dans des phénomènes de tolérance immunitaire vis-à-vis des germes commensaux du microbiote. Toutefois, les IgA peuvent développer des propriétés pathogènes. Dans la première partie de mon travail de thèse, nous avons étudié les effets pathogènes de l’IgA. Les dépôts d’IgA sur le mésangium sont la caractéristique de l’IgAN. La physiopathologie de cette maladie est mal connue. L’hypothèse d’un défaut de glycosylation de l’IgA est souvent retenue ; ce défaut peut être la cause de sa polymérisation et de son antigénicité, il peut aussi favoriser le clivage du récepteur CD89. Nous avons analysé l’effet du défaut d’affinité de la région variable des IgA, de la substitution de la chaîne légère ainsi que de l’association des IgA à leur récepteur, le CD89 sur l’induction des lésions et le dysfonctionnement rénal chez quatre modèles murins différents générés au laboratoire et suivis pendant 12 mois. Nous avons également étudié les propriétés physico-chimiques des IgA de 28 patients ayant une dysglobulinémie et de 28 IgA produites par des hybridomes ; la relation entre ces propriétés et la capacité des IgA à se déposer a été observée. Dans une seconde partie, nous avons étudié l’aspect immunomodulateur et les propriétés antiinflammatoires conférées par l’IgA humaine surexprimée chez un modèle murin de lupus systémique (souris MRL/lpr). Dans la dernière partie du travail, nous avons contribué à la caractérisation d’un modèle de souris transgénique exprimant l’IgA de classe 2 et à l’étude de l’effet de signalisation médiée par cette IgA2 sur le développement des populations lymphocytaires. L’ensemble de ces travaux a montré l’effet pathogène des IgA naturelles ayant une faible affinité sur le développement de la néphropathie à IgA ; ainsi les analyses des IgA des patients et des hybridomes montrent que c’est la stabilité moléculaire de préférence au profil de glycosylation qui joue un rôle crucial dans leur capacité de dépôt. L’expression des IgA humaines chez les souris lupiques a considérablement prolongé leur durée de vie et a ralenti la survenue de l’auto-immunité et de l’atteinte rénale ce qui témoigne du rôle anti-inflammatoire des IgA. L’étude du modèle murin exprimant l’IgA2 humaine a montré que la signalisation via l’IgA2 joue un rôle inhibiteur sur le développement précoce de certaines sous-populations de cellules B. L’ensemble de ces résultats montrent la multitude d’effets de l’IgA lui permettant d’intervenir d’une part dans la pathogenèse d’une maladie complexe (l’IgAN) et d’autre part dans la protection de l’auto-immunité, témoignant de la complexité des interactions mises en jeu et du caractère régulateur de cette immunoglobuline. / Immunoglobulin A (IgA) is the most synthetized immunoglobulin in mammals. IgA has ambivalent properties: it is implicated in the mechanisms of defense against pathogens but also in the immune tolerance of commensal microbiota. However, IgA can develop pathogenic properties. In the first part of my thesis, we studied the pathogenic effects of IgA. IgA deposits are the main characteristic of IgA nephropathy (IgAN). IgAN physiopathology is not yet clearly understood. The hypothesis of a glycosylation defect is strongly adapted. This defect can be due to IgA polymerization or antigenicity. It can also induce shedding of CD89 (IgA Fc receptor) or other factors. We studied the effect of variable region altered affinity, the light chain substitution and the association of IgA with CD89 on the development of kidney lesions and impairment of kidney function in four mouse models followed up during 12 months. In addition, we studied the physico-chemical properties of 28 IgA purified from patients with dysglobulinaemia and 28 chimeric IgA produced by hybridomas. The effect of these properties on the propensity of IgA for mesangial deposition was explored. In the second part, we studied the immunomodulatory and anti-inflammatory properties conferred by the overexpression of human IgA in a mouse model with systemic lupus (MRL/lpr model). In the last part, we contributed to the characterization of a transgenic mouse model producing IgA class 2 and to the study of the effect of IgA2-mediated signaling on B lymphocyte development. Altogether, obtained results show the pathogenic effect of low affinity-IgA on the development of IgA nephropathy. In addition, different analyses showed that molecular stability but not glycosylation profile is the determining factor for IgA deposition. On the other hand, IgA expression in lupus-prone mice extended their survival, delayed the onset of auto-immunity and ameliorated kidney functions in these animals which supports IgA anti-inflammatory properties. The study of IgA2-mediated signaling in the transgenic model showed the inhibitory effect of IgA2 on the early development of several B cell sub-populations. All of these results show the multiple effects of IgA which contribute on one hand to the pathogenesis of a complex disease (IgAN) and on the other hand to protection from autoimmunity, demonstrating the complexity of interactions and the regulatory character of this immunoglobulin.

Les ISCR constituent une famille de séquences d’insertions bactériennes décrits récemment dans des contextes cliniques et d’antibiorésistance. Les transposases codées par ces IS appartiennent à la famille des HUH transposases qui transposent selon un mécanisme en cercle roulant. Néanmoins, aucune donnée expérimentale n’existe à ce jour. La famille ISCR compte 19 membres mais ont été peu caractérisés. C’est pourquoi, nous avons fait une mise à jour des informations sur ces éléments en analysant in silico les principales caractéristiques par une étude in silico. Nous nous sommes ensuite intéressés à l’implication de l’élément ISCR1 dans l’expression de la région variable en aval. Cet élément contient deux promoteurs orientés vers l’extérieur (POUT) dans sa région en 3’. Après une analyse de la diversité des gènes, nous avons remarqué que la plupart des gènes en aval étaient orientés dans le même sens que ces POUT et qu’ils pouvaient être exprimés à partir des deux promoteurs. Nous avons montré que pour deux gènes de résistance dfrA19 et blaCTX-M-9, ces promoteurs augmentent le niveau d’expression. De plus, la région contenant les deux promoteurs est nécessaire pour que l’expression de blaCTX-M-9 confère un phénotype de résistance. En parallèle, nous avons déterminé la régulation du promoteur du gène de la transposase de ISCR1. Nous avons identifié des motifs de régulation pour les régulateurs LexA et OmpR et déterminé expérimentalement que le promoteur du gène de la transposase de ISCR1 était régulé de façon négative par la protéine LexA, régulateur majeur de la réponse SOS et de façon positive par la protéine OmpR en conditions hypo-osmotiques. Nous proposons donc un modèle selon lequel ISCR1 est un élément dont la mobilité serait conditionnée par des facteurs environnementaux et en même temps, assurerait l’expression constitutive de gènes en aval, notamment impliqués dans l’antibiorésistance. / ISCR are a bacterial insertion sequences, recently described in clinical settings, frequently related to antibiotic resistance. These ISCR-encoded transposases belong to the well-known HUH transposases family, which transpose by rolling-circle replication. However, the transposition mechanism of ISCR transposases has not been shown experimentally. ISCR family includes 19 members and has not been well characterized yet. Therefore, we updated in silico already known characteristics for each ISCR element. Then, we investigated the involvement of ISCR1 in the expression of the downstream genes. Indeed, ISCR1 carries two outward-oriented promoters called POUT. By analyzing the diversity of the downstream region, we found that most of genes were in the same orientation as POUT promoters, suggesting these downstream genes are expressed from POUT. It thus showed that these two promoters are able to express two antibiotic resistance genes (dfrA19 and blaCTX-M-9 ). Moreover, the region containing POUT is essential to provide an ESBL-resistance phenotype for blaCTX-M-9 gene. Moreover, we also wanted to analyze the regulatory network involved in the expression of the ISCR1 transposase, RCR1. We experimentally determined that two regulatory proteins LexA and OmpR, involved in response to different stress (DNA damages and osmotic shock), control the activity of rcr1 promoter. LexA protein represses Prcr1 whereas OmpR activates Prcr1 in hypo-osmotic conditions. Here, we propose a model in which ISCR1 transposition would be the control of environmental stresses and at the same time, insured the expression of downstream antibiotic resistance genes.

La thérapie génique peut être définie comme le transfert du gène thérapeutique dans le tissue d’intérêt à l’aide d’un vecteur. A ce jour, les vecteurs dérivés du virus adéno-associés (AAV) représentent les vecteurs de choix pour le transfert de gène in vivo. Cependant, les réponses immunitaires dirigées contre la capside AAV représentent l’obstacle majeur à l’efficacité du transfert de gène médié par le vecteur AAV. Ce travail de thèse a eu pour objectifs de prévenir et d’inhiber la réponse humorale dirigée contre le vecteur AAV. En administrant des nanoparticules contenant de la rapamycine (ou SVP[Rapa]) avec le vecteur AAV, nous avons démontré une inhibition spécifique des réponses humorale et cellulaire dirigées contre la capside AAV. De plus, cette stratégie nous a permis de re-administrer efficacement le vecteur AAV dans des modèles murins et chez le singe. Nos données ont aussi démontré l’élimination des anticorps préexistants dirigés contre le vecteur AAV en administrant SVP[Rapa] avec le bortezomib. Au cours de travail de thèse, nous avons aussi développée et testée l’efficacité des vecteurs AAV associés aux vésicules extracellulaires (vecteurs exo-AAV) à améliorer l’efficacité des vecteurs AAV. En utilisant les vecteurs exo-AAV, nous avons démontré une expression stable et durable du transgène. De plus, les vecteurs exo-AAV ont montré une résistance aux anticorps neutralisants préexistants. Ainsi, au cours de ce projet de thèse des stratégies efficaces ont été développées afin de prévenir et de contrôler les réponses immunitaires dirigés contre le vecteur AAV, permettant ainsi une re-administration efficace du vecteur AAV. / Gene therapy aims to achieve sustained expression of the therapeutic transgene by the introduction of vector cargo into target tissue. To date, viral vectors based on adeno-associated virus (AAV) represent the leading gene delivery tools in vivo. However, immune responses against AAV vector represent the biggest challenge for the widespread use of AAV-based products. In this PhD project, we aimed at the inhibition and prevention of humoral immune responses to AAV capsid. Using nanoparticles containing rapamycin (SVP[Rapa]) given at the time of vector administration, we demonstrated complete abrogation of anti-capsid humoral and cellular immune responses in antigen-specific manner. Using this strategy, we further demonstrated successful vector re-administration in murine models and in non-human primates. Our data also demonstrated elimination of pre-existing antibodies to AAV vector using a combination of SVP[Rapa] and bortezomib. In this PhD thesis project, we also developed and tested the ability of AAV vectors associated with extracellular vesicles (exo-AAV vectors) to enhance AAV vector potency. Using exo-AAV vectors, we demonstrated higher and sustained transgene expression at low vector doses. Exo-AAV vectors also exhibited resistance to neutralization by pre-existing anti-capsid neutralizing antibodies. Thus in this PhD project, powerful strategies have been developed to prevent and control immune responses against AAV vectors, enabling successful AAV vector re-administration.

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