Το μεταβολικό σύνδρομο, αποτελεί ένα σύνολο διαταραχών, όπως η κοιλιακή παχυσαρκία, η υπεργλυκαιμία, η χαμηλή HDL χοληστερόλη (HDL-C), τα αυξημένα τριγλυκερίδια (ΤRG) και η υπέρταση. Αν και η συχνότητα του παρουσιάζεται συνεχώς αυξανόμενη παγκοσμίως, η παθογένειά του, καθώς και τα διαγνωστικά κριτήρια, παραμένουν όχι σαφώς προσδιορισμένα. Φαίνεται να σχετίζεται με τη δραστηριότητα του άξονα ΥΥΕ, όμως ο υποκείμενος μηχανισμός παραμένει ασαφής. Σκοπός της παρούσης μελέτης ήταν να διερευνήσουμε τη λειτουργία του άξονα ΥΥΕ σε ασθενείς με μεταβολικό σύνδρομο και να εξετάσουμε αν η δραστηριότητα του άξονα ΥΥΕ σχετίζεται με τα επί μέρους στοιχεία του μεταβολικού συνδρόμου. Υλικό και Μέθοδος: Μελετήθηκαν 159 συνολικά άτομα, τα οποία χωρίστηκαν σε δύο ομάδες. Η πρώτη ομάδα (ομάδα ατόμων με μεταβολικό σύνδρομο) περιελάμβανε 86 άτομα με μεταβολικό σύνδρομο, 48 άνδρες και 38 γυναίκες, μέσης ηλικίας 52.2±7.6 έτη, mean±SD, και με δείκτη σωματικής μάζας 30.5±5.35 kg/m², mean±SD. Η δεύτερη ομάδα (ομάδα ελέγχου) περιελάμβανε 73 υγιή άτομα (μάρτυρες), 19 άνδρες και 54 γυναίκες, μέσης ηλικίας 49.9±7.5 έτη, mean±SD, και με δείκτη μάζας σώματος 27.9±4.42 kg/m², mean±SD. Οι δύο ομάδες ήταν συγκρίσιμες ως προς την ηλικία. Όλα τα άτομα υπεβλήθησαν σε δοκιμασία ανοχής 75g γλυκόζης από το στόμα (OGTT) μετά από νηστεία 12 ωρών, και δείγματα αίματος ελήφθησαν για τον προσδιορισμό της ACTH, της κορτιζόλης, της ινσουλίνης, του C-πεπτιδίου και της γλυκόζης. Τα επίπεδα κορτιζόλης ορού μετά από δοκιμασία ολονύκτιας καταστολής με 1mg δεξαμεθαζόνης (DXM) μετρήθηκαν και στις δύο ομάδες. Αποτελέσματα: Οι ασθενείς με μεταβολικό σύνδρομο είχαν στατιστικώς σημαντικά υψηλότερα επίπεδα κορτιζόλης ορού μετά από ολονύκτια δοκιμασία καταστολής με δεξαμεθαζόνη σε σχέση με τους υγιείς μάρτυρες. Καθ’όλη τη διάρκεια της δοκιμασίας ΟGTT τα επίπεδα της ΑCTH πλάσματος ήταν υψηλότερα στην ομάδα με μεταβολικό σύνδρομο σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, ενώ τα επίπεδα κορτιζόλης ορού ήταν συγκρίσιμα μεταξύ των δύο ομάδων. Σε όλους τους χρόνους της δοκιμασίας OGTT τα επίπεδα της γλυκόζης, της ινσουλίνης και του C-πεπτιδίου ήταν στατιστικώς σημαντικά υψηλότερα στην ομάδα με μεταβολικό σύνδρομο σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Επίσης, η ΑCTH κατά τη δοκιμασία OGTT παρουσίασε στατιστικώς σημαντική θετική συσχέτιση με το μεταβολικό σύνδρομο και τα περισσότερα στοιχεία του, ενώ δεν βρέθηκε συσχέτιση μεταξύ της κορτιζόλης κατά τη διάρκεια της δοκιμασίας OGTT και του μεταβολικού συνδρόμου. Συμπεράσματα: Ο άξονας ΥΥΕ φαίνεται να είναι περισσότερο δραστήριος στους ασθενείς με μεταβολικό σύνδρομο, όπως αποδεικνύεται από τα υψηλότερα επίπεδα κορτιζόλης μετά από ολονύκτια δοκιμασία καταστολής με δεξαμεθαζόνη και τα αυξημένα επίπεδα ACTH κατά τη διάρκεια της δοκιμασίας OGTT. Το εύρημα αυτό ενισχύει την άποψη ότι υφίσταται «λειτουργική» υπερκορτιζολαιμία στην εκδήλωση του μεταβολικού συνδρόμου. / Metabolic syndrome (MetS) is correlated with the activity of Hypothalamic-Pituitary-Adrenal axis (HPA) but the underlying mechanism still remains elusive.The aim of this study was to investigate the HPA axis function in patients with MetS. Materials/Methods: This case-control study included 159 people. They were divided into 2 groups. The first group included 73 healthy volunteers (control group: 19 male, 54 female, mean±SD: 49.9±7.5 years old, with BMI: 27.9±4.42 kg/m2) and the second group included 86 patients with MetS (case group: 48 male, 38 female, mean±SD: 52.2±7.6 years old, with BMI: 30.5±5.35 kg/m2). An oral glucose tolerance test (OGTT) was performed for all subjects after a 12-h overnight fast, and blood samples were obtained for determination of ACTH, cortisol, insulin, C-peptide, and glucose levels. Serum cortisol after an overnight dexamethasone suppression test was determined in both groups. Results: Patients with MetS had serum cortisol levels after an overnight dexamethasone suppression test significantly higher than controls. During OGTT plasma ACTH levels were higher at all time points in patients with MetS compared to controls, whereas serum cortisol levels were comparable between the 2 groups. Plasma ACTH during OGTT was also correlated with most of the components of MetS. Conclusions: The HPA axis in patients with MetS seems to be more active as evidenced by the higher cortisol levels after the overnight dexamethasone suppression test and by the higher ACTH levels during OGTT. This functional hypercortisolism might be involved in the pathogenesis of the metabolic syndrome.

Φυσιολογικά επίπεδα της αγρίου τύπου απολιποπρωτεϊνης Ε (apoE) στο πλάσμα διαμεσολαβούν στην κάθαρση των αθηρογενετικών λιποπρωτεϊνών ενώ υψηλότερα επίπεδα από τα φυσιολογικά προκαλούν υπερτριγλυκεριδαιμία. Αυτή η ιδιότητα της αγρίου τύπου apoE μειώνει σημαντικά την θεραπευτική της αξία ως ένα πιθανό βιολογικό φάρμακο για την αντιμετώπιση της δυσλιπιδαιμίας. Πρόσφατα, έχει δημιουργηθεί και μελετηθεί μια μεταλλαγμένη μορφή της apoE, apoE4 [ L261A, W264A, F265A, L268A, V269A ] (apoE4mut1) με βελτιωμένες βιολογικές ιδιότητες. Συγκεκριμένα, αυτή η μεταλλαγμένη μορφή μπορεί να φέρει τα υψηλά επίπεδα χοληστερόλης σε φυσιολογικές τιμές χωρίς να προκαλέσει υπερτριγλυκεριδαιμία ακόμα και όταν υπερεκφράζεται. Στην παρούσα μελέτη, πραγματοποιήθηκε φαρμακοδυναμική και φαρμακοκινητική ανάλυση της apoE4mut1 σε πειραματόζωα. Με γονιδιακή μεταφορά μέσω ιού σε ποντίκια που είχαν έλλειψη στον LDL υποδοχέα (LDLr-/-) και σε ποντίκια που είχαν έλλειψη στην apoE (apoE-/-), δείχθηκε οτι η δράση της apoE4mut1 ( μείωση της χοληστερόλης ) εξαρτάται από την έκφραση ενός λειτουργικού κλασσικού LDL υποδοχέα. Εφάπαξ έγχυση της apoE4mut1 συνδεδεμένης με λιποσώματα σε apoE-/- ποντίκια που ήταν σε δίαιτα δυτικού τύπου για 6 εβδομάδες αποκάλυψε οτι η εξωγενώς συντιθέμενη apoE4mut1 διατηρεί άθικτη την ικανότητά της να κανονικοποιεί τα υψηλά επίπεδα χοληστερόλης αυτών των ποντικιών με μια μέγιστη φαρμακολογική απόκριση που παρατηρείται σε μόλις 10 ώρες μετά την έγχυση. Ενδιαφέρον παρουσίασε το γεγονός οτι τα επίπεδα χοληστερόλης του πλάσματος παρέμειναν σημαντικώς μειωμένα για τις επόμενες 24 ώρες μετά την έγχυση της apoE4mut1- λιποσώματα. Μετρήσεις συγκεντρώσεων της apoE έδειξαν οτι η apoE4mut1 στην μορφή των πρωτεολιποσωμάτων που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη έχει χρόνο ημίσειας ζωής 15.8 h. Τα δεδομένα αυτά οδηγούν στο συμπέρασμα οτι η καθαρή apoE4mut1 μπορεί να αποτελέσει ένα νέο υποψήφιο φάρμακο για την άμεση αντιμετώπιση της υπερχοληστερολαιμίας σε άτομα που εκφράζουν έναν λειτουργικό LDL υποδοχέα. / Physiological levels of wild-type (wt) apolipoprotein E (apoE) in plasma mediate the clearance of cholesterol-rich atherogenic lipoprotein remnants while higher than normal plasma apoE concentrations fail to do so and trigger hypertriglyceridemia. This property of wt apoE reduces significantly its therapeutic value as a potential biological drug for dyslipidemia. Recently, we reported the generation of a recombinant apoE variant, apoE4 [L261A, W264A, F265A, L268A, V269A] (apoE4mut1) with improved biological functions. Specifically, this variant can normalize high plasma cholesterol levels without triggering hypertriglyceridemia, even at supraphysiological levels of expression. In the present study we performed pharmacodynamic and pharmacokinetic analysis of apoE4mut1 in experimental mice. Using adenovirus-mediated gene transfer in LDL receptor deficient (LDLr-/-) and apoE deficient (apoE-/-) mice, we show that the cholesterol lowering potential of apoE4mut1 is dependent on the expression of a functional classical LDLr. Bolus infusion of apoE4mut1-containing proteoliposomes in apoE-/- mice fed western-type diet for 6 weeks indicated that exogenously synthesized apoE4mut1 maintains intact its ability to normalize the high cholesterol levels of these mice with a maximum pharmacological effect obtained at only 10 hours post-treatment. Interestingly, plasma cholesterol levels remained significantly reduced even 24 hours following intravenous infusion of apoE4mut1 proteoliposomes. Measurements of plasma apoE levels indicated that apoE4mut1 in the form of proteoliposomes used in the study has a half-life of 15.8 h. Our data suggest that purified apoE4mut1 may be an attractive new candidate for the acute correction of hypercholesterolemia in subjects expressing functional LDL receptor.

Le syndrome CHARGE (CS) est une maladie génétique rare caractérisée par de nombreuses anomalies congénitales, majoritairement causées par des altérations de novo du gène CHD7. Celui-ci code pour une protéine à chromodomaines, impliquée dans le remodelage ATP-dépendant de la chromatine. La grande majorité des altérations de CHD7 consiste en allèles nuls tels que des délétions, des substitutions non-sens ou des décalages du cadre de lecture. Nous avons réalisé le premier diagnostic moléculaire d’un patient Indonésien atteint du CS, en étudiant un panel de gènes (CHD7, EFTUD2, et HOXA1) par NGS (next-generation sequencing). Nous avons identifié une nouvelle mutation non-sens hétérozygote dans l’exon 34 du gène CHD7 (c.7234G>T ou p.Glu2412Ter). Par ailleurs, il n'existe pas d’analyse fonctionnelle qui permettrait de caractériser la pathogénicité des variants de la protéine CHD7 rencontrés chez des patients. C’est pourquoi l’objectif de ce travail est de mettre au point un test fonctionnel de la protéine CHD7, sous forme sauvage ou mutée. Pour cela, nous avons généré par mutagénèse dirigée des vecteurs codant pour trois variants faux-sens de CHD7 et le variant présentant une insertion de cinq acides aminés. Ensuite, les protéines CHD7, sous forme sauvage ou variante, ont été surexprimées dans la lignée HeLa. L’expression des protéines a été mise en évidence par western blot et par immunofluorescence. Pour étudier la fonctionnalité de CHD7, nous avons quantifié par RT-qPCR les transcrits de cinq gènes (l’ADNr 45S, SOX4, SOX10, MYRF, et ID2), dont la transcription est selon le littérature régulée par CHD7. Nous avons observé que l’expression de CHD7 sauvage entraînait une diminution significative et reproductible des quantités de transcrits correspondant à tous les gènes rapporteurs. Par contre, l’expression des quatre allèles variants de CHD7 n’avait aucun impact, ce qui suggère que ces variants ne sont pas fonctionnels. Par ailleurs, nous avons appliqué notre test biologique dans des cellules de la lignée SH-SY5Y, pour lesquelles nous avons introduit une mutation faux-sens dans le génome en utilisant la technique CRISPR/Cas9. Lorsque ce variant était exprimé, les niveaux de transcription des cinq gènes rapporteurs n’étaient pas significativement différents de ceux observés dans les cellules où les deux allèles de CHD7 avaient été invalidés. Par conséquent, les variants étudiés peuvent être répertoriés comme résultant de mutations causales du CS. / CHARGE syndrome (CS) is a rare genetic disease characterized by numerous congenital abnormalities, mainly caused by de novo alterations of the CHD7 gene. It encodes a chromodomain protein, involved in the ATP-dependent remodeling of chromatin. The vast majority of CHD7 alterations consists in null alleles like deletions, non-sense substitutions or frameshift-causing variations. We report the first molecular diagnosis of an Indonesian CS patient by a targeted NGS (next-generation sequencing) gene panel (CHD7, EFTUD2, and HOXA1). We identified a novel heterozygous nonsense mutation in exon 34 of CHD7 (c.7234G>T or p.Glu2412Ter). Functional analyses to confirm the pathogenicity of CHD7 variants are lacking and urgently needed. Therefore, the aim of this study was to establish a functional test for wild-type (WT) or variants of CHD7 protein found in CS patients. Using an expression vector encoding CHD7, three variants harboring an amino acid substitution and one variant with a five-amino acid insertion were generated via site-directed mutagenesis. Then CHD7 proteins, either wild-type (WT) or variants, were overexpressed in HeLa cell line. Protein expression was highlighted by western blot and immunofluorescence. We then used real-time RT-PCR to study CHD7 functionality by evaluating the transcript amounts of five genes whose expression is regulated by CHD7 according to the literature. These reporter genes are 45S rDNA, SOX4, SOX10, ID2, and MYRF. We observed that, upon WT-CHD7 expression, the reporter gene transcriptions were downregulated, whereas the four variant alleles of CHD7 had no impact. This suggests that these alleles are not polymorphisms because the variant proteins appeared non-functional. Furthermore, we applied our biological assay in SH-SY5Y cell line in which endogenous CHD7 gene was mutated using the CRISPR/Cas9 technique. Then, we observed that when a CHD7 missense variant was expressed, the transcription levels of the five reporter genes were non-significantly different, compared with the cells in which both CHD7 alleles were knocked-out. Therefore, the studied variants can be considered as disease-causing of CS.

L'obésité est une maladie multifactorielle qui constitue un facteur de risque de nombreuses pathologies, notamment les maladies cardiovasculaires, le diabète et les maladies neurodégénératives. Des études épidémiologiques récentes suggèrent un effet obésogène des contaminants environnementaux, mais peu d'informations sont disponibles sur leur effet potentiel sur le métabolisme des lipoprotéines hépatiques. L'objectif de cette étude était de déterminer l'effet de polluants environnementaux de la famille des hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) sur trois récepteurs des lipoprotéines, le récepteur des LDL (LDL-R), le lipolysis-stimulated lipoprotein receptor (LSR) et le scavenger receptor B1 (SR-B1) ainsi que sur les ATP binding cassette transporter A1 (ABCA1) et G1 (ABCG1) en utilisant des modèles cellulaires et/ou animaux. Les études par immunoblots et immunofluorescence in vitro ont révélé que l'exposition de cellules Hepa1-6 au B[a]P diminue de manière significative les taux de protéine LSR, LDL-R et ABCA1, alors qu’aucune modification significative du taux et de l’activité du LSR n’a été observée lors d’une exposition au pyrène ou au phénanthrène. L’analyse en temps réel par PCR et les études avec la lactacystine ont révélé que cet effet était dû principalement à une augmentation de la dégradation par le protéasome plutôt qu’à une diminution de la transcription ou à une augmentation de la dégradation lysosomale. En outre, les ligand-blots ont révélé que les lipoprotéines exposées au B[a]P avaient une affinité réduite pour le LSR ou le LDL-R. Des souris C57Bl/6RJ ont été traitées par le B[a]P (0,5 mg / kg, i.p) toutes les 48 h pendant 15 jours. Le gain de poids observé est accompagné d’une augmentation des taux de triglycérides et de cholestérol plasmatiques, du taux de cholestérol hépatique, et d’une diminution du taux de LDL-R et ABCA1 chez animaux traités au B[a]P par rapport aux témoins. Les corrélations observées entre les taux de LSR et de LDL-R hépatiques chez les souris contrôle ne sont plus observées chez les souris traitées au B[a]P, ce qui suggère un dérèglement du métabolisme des lipoprotéines hépatiques. Ces résultats suggèrent que la prise de poids induite par le B[a]P est peut-être liée à son action inhibitrice sur le LSR et le LDL-R, ainsi que sur l’ABCA1 et le métabolisme des lipoprotéines hépatiques, ce qui conduit à un statut lipidique modifié chez les souris traitées au B[a]P, donnant ainsi un nouvel éclairage sur les mécanismes sous-jacents de la contribution des polluants tels que le B[a]P à la perturbation de l'homéostasie lipidique, susceptible de contribuer à la dyslipidémie associée à l'obésité / Obesity is a multifactorial disorder that represents a significant risk factor for many pathologies including cardiovascular diseases, diabetes and neurodegenerative diseases. Recent epidemiological studies suggest potential obesogenic effects of environmental contaminants, but little information is available on their potential effect on hepatic lipoprotein metabolism. The objective of this study was to determine the effect of the common environmental pollutants, belonging to polycyclic aromatic hydrocarbon (HAP) on three lipoprotein receptors, the LDL-receptor (LDL-R), the scavenger receptor B1 (SRB1) and the lipolysis-stimulated lipoprotein receptor (LSR) as well as the ATP binding cassette transporters A1 (ABCA1) and G1 (ABCG1) using cell and/or animal models. Immunoblot and immunofluorescence in vitro studies revealed that exposure of Hepa1-6 to benzo[a]pyrene (B[a]P) significantly decreased LSR, LDL-R and ABCA1 protein levels, whereas no significant changes in protein levels and LSR activity where observed upon cell treatment with pyrene or phenanthrene. Real-time PCR analysis, lactacystin and chloroquine studies revealed that this effect was due primarily to increased proteasome-mediated degradation rather than to decreased transcription or to increased lysosomal degradation. Furthermore, ligand blots revealed that lipoproteins exposed to B[a]P displayed markedly decreased binding to LSR or LDL-R. C57Bl/6RJ mice were treated with B[a]P (0.5 mg/kg, i.p) every 48 h for 15 days. The increased weight gain observed was accompanied by increased plasma triglycerides and cholesterol levels, increased liver cholesterol content, and decreased LDL-R, ABCA1, ABCG1 and SR-B1 protein levels in B[a]P-treated animals as compared to controls. Correlations observed between hepatic LSR and LDL-R levels in control mice were no longer observed in B[a]P treated mice, suggesting a potential dysregulation of hepatic lipoprotein metabolism.Taken together, these results suggest that B[a]P-induced weight gain may be due its inhibitory action on LSR and LDL-R, as well as ABCA1 and lipoprotein metabolism in the liver, which leads to the modified lipid status in B[a]P-treated mice, thus providing new insight into mechanisms underlying the involvement of pollutants such as B[a]P in the disruption of lipid homeostasis, potentially contributing to dyslipidemia associated with obesity

-- Thèse fournie sans page de titre --Afin de mieux comprendre la physiopathologie des causes gastriques de malabsorption de la vitamine B12, nous nous sommes intéressés au déficit congénital en facteur intrinsèque, une maladie rare caractérisée par une diminution de la sécrétion de facteur intrinsèque (FI) fonctionnel dans le suc gastrique. Dans cette étude, nous rapportons cinq cas porteurs hétérozygotes du variant GIF c.290T>C (p.M97T) et deux cas porteurs hétérozygotes du variant GIF c.435_437delGAA (p.K145_N146delinsN). L'étude fonctionnelle des FI recombinants mutés produits par mutagenèse dirigée a mis en évidence une diminution de l'affinité du FI p.K145_N146delinsN pour la vitamine B12 n'expliquant toutefois pas totalement le phénotype observé chez les sujets. Par ailleurs, une association a été récemment décrite entre le polymorphisme rs601338, c.461 G>A du gène FUT2, codant pour une [alpha]1,2-fucosyltransférase, et les taux plasmatiques de vitamine B12. Afin de compléter notre étude, nous avons évalué l'influence du polymorphisme FUT2 c.461 G>A sur les taux de vitamine B12, de folates et d'homocystéine dans les populations Européennes et Africaines chez 1466 sujets. Notre étude démontre un effet du polymorphisme FUT2 c.461 G>A sur les taux plasmatiques de vitamine B12 et de folates indépendamment de l'âge, du sexe et de l'origine géographique. En conclusion, nos résultats démontrent que le gène du FI (GIF) n'est pas le seul gène impliqué dans la physiopathologie du déficit congénital en facteur intrinsèque. L'étude des malabsorptions d'origine gastrique de la vitamine B12 passe par une approche polygénique dans laquelle le gène FUT2 occupe une place importante / There are multiple causes of gastric vitamin B12 malabsorption. To get a better understanding of their physiopathology, we are interested in inherited gastric intrinsic factor (GIF) deficiency, a vitamin B12 absorption defect characterized by GIF impaired activity. In this study, we report five cases heterozygous carriers of the variant GIF c.290T>C (p.M97T) and two cases heterozygous carriers of the variant GIF c.435_437delGAA (p.K145_N146delinsN). The study of recombinant mutated GIF produced by site-directed mutagenesis evidenced a reduced affinity for vitamin B12 in the case of GIF p.K145_N146delinsN which does not explain fully the phenotypes observed in our subjects. Recently, an association was described between the FUT2 polymorphism rs601338, c.461 G>A, coding for a fucosyltransferase, and plasma levels of vitamin B12. To complete our study, we assessed the influence of FUT2 c.461 G>A polymorphism on vitamin B12, folate and homocysteine in European and African populations in 1466 subjects. Our study demonstrate a clear effect of FUT2 c.461 G>A polymorphism on both plasma levels of vitamin B12 and folate, regardless of age, gender, and geographic origin. In conclusion, our results demonstrate the GIF gene is not the only gene involved in the physiopathology of inherited GIF deficiency. It is necessary to study the gastric causes of vitamin B12 malabsorption through a polygenic approach, in which the FUT2 gene is an important element