Στην παρούσα διδακτορική διατριβή περιλαμβάνεται το αποτέλεσμα εκτεταμένης συγκριτικής μελέτης των μεθόδων που χρησιμοποιούνται στη διάγνωση της εισαγωγής και της εξέλιξης της οστεοπόρωσης. Η οστεοπόρωση, όπως και όλες οι μεταβολικές νόσοι των οστών, αποτελούν ένα σημαντικό πρόβλημα της παγκόσμιας υγείας. Πολλές τεχνικές έχουν προταθεί και εφαρμόζονται για τη διάγνωση της οστεοπόρωσης αλλά και για την παρακολούθηση της εξέλιξής της, με ταυτόχρονη αξιολόγηση της επίδρασης των θεραπευτικών αγωγών. Η μέθοδος της μέτρησης του Μορφικού Συντελεστή Απόσβεσης αποτελεί μια τεχνική γνωστή στην παγκόσμια βιβλιογραφία για την εκτίμηση της ποιότητας των κατασκευών με μη καταστροφικό τρόπο. Η διερεύνηση της δυνατότητας εφαρμογής της μεθόδου στην αξιολόγηση της δομικής ακεραιότητας των οστών με παράλληλη ανάπτυξη θεωρητικού μοντέλου το οποίο υποστηρίζει την ορθότητα των πειραματικών αποτελεσμάτων αποτέλεσε το βασικό στόχο της έρευνας. Ειδικότερα, περιλαμβάνεται αναλυτική έρευνα βιβλιογραφίας στην περιοχή του μη καταστροφικού ελέγχου συμβατικών κατασκευών και υλικών, και ανάπτυξη των κυριότερων τεχνικών που εφαρμόζονται στην καθημερινή κλινική πρακτική για τον διαγνωστικό έλεγχο της οστεοπόρωσης και γενικότερα των παθήσεων του μυοσκελετικού συστήματος [τεχνικές πυκνομετρίας (pQCT, DEXA, QUS, κ.λ.π) αλλά και τεχνικές που ανιχνεύουν μεταβολές των οστών σε επίπεδο αρχιτεκτονικής (ιστομορφομετρία) και σε μοριακό επίπεδο (βιοχημικοί δείκτες), καθώς και φασματοσκοπία Raman] με τα πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα κάθε μεθόδου. Λόγω της πολυπλοκότητας του υλικού του οστού, παρατίθενται αναλυτικά οι μηχανικές του ιδιότητες. Στη συνέχεια αναπτύσσεται το θεωρητικό μοντέλο υπολογισμού του Μορφικού Συντελεστή Απόσβεσης και παρουσιάζεται το εκτεταμένο πειραματικό μοντέλο που εφαρμόστηκε σε επίμυες και γυναίκες. Από τη σύγκριση των πειραματικών αποτελεσμάτων της μεθόδου του Συντελεστή Απόσβεσης και των συμβατικών τεχνικών που χρησιμοποιούνται για τη διάγνωση της οστεοπόρωσης με τις αναλυτικές τιμές υπολογισμού του Συντελεστή Απόσβεσης αναδεικνύεται η υψηλή ευαισθησία της προτεινόμενης μεθόδου και τεκμηριώνεται η ωριμότητά της για αποτελεσματική, επαναλήψιμη, έγκυρη και αξιόπιστη αξιολόγηση της δομικής ακεραιότητας των οστών. / Extended comparative study of the methods used in the diagnosis of osteoporosis is included in this thesis. Osteoporosis, as well as all metabolic diseases of bones, consist an important health problem. Many techniques have been proposed and are applied for monitoring of osteoporosis with simultaneous assessment of the effect of therapeutical treatment. Measurement of Modal Damping Factor is a worldwide known technique for the non destructive assessment of structural integrity. The potential of application of this method on the assessment of structural integrity of bones, in combination with development of theoretical model supporting the experimental results has been the main target of this research. Specifically, in the frame of the research, a thorough state of the art has been elaborated in the domain of non destructive testing of conventional structures and materials, as well as on the main techniques applied on everyday clinical practice for diagnosis of osteoporosis and of metabolic diseases of bones [bone density techniques (pQCT, DEXA, QUS), techniques detecting architectural changes (histomorphometry), molecular changes (biochemical markers) and Raman Spectroscopy], accompanied by the advantages and disadvantages of each approach. Due to the complexity of bone structure, its mechanical properties are presented, accompanied by the theoretical model, from which the Modal Damping Factor is calculated, and the experimental model that was applied on osteoporotic rats and women. The comparison between experimental results of Modal Damping Factor and of data from conventional methods used for diagnosis of osteoporosis with the analytical values of Modal Damping Factor permits for elevating the high sensitivity of the proposed method and documenting its maturity for effective, repetitive, and accurate assessment of bone structural integrity.

L’ostéoporose touche principalement les femmes après la ménopause, c’est une maladie caractérisée par une détérioration de la minéralisation et de la micro-architecture de l’os. L’objectif du travail de thèse présenté ici est d’identifier une fraction protéique laitière ayant un effet stimulant sur la formation osseuse. Une telle fraction, ajoutée dans un produit ou un complément alimentaire, pourrait contribuer à réduire la perte osseuse. La première étape du projet consiste à produire les fractions laitières. Des protéines laitières (caséine ou protéines sériques) ont été digérées par des enzymes puis filtrées pour les fractionner selon leur poids moléculaire. Les fractions obtenues ont ensuite été testées sur des cultures primaires de cellules osseuses. Certaines fractions protéiques laitières ont augmenté la prolifération et la différenciation des ostéoblastes. Parmi ces fractions actives, la fraction correspondant au rétentat d’une filtration sur un filtre à 10kDa d’un hydrolysat de caséine par de la chymotrypsine a été sélectionnée pour être testée sur animaux. Cette fraction a été nommée fraction CR10. Pour étudier l’activité du CR10 in vivo sur le métabolisme osseux, un modèle de souris sous restriction protéique est mis au point. Nos études démontrent que, lorsque le régime est basé sur des protéines de soja, le passage d’un régime contenant 20% de protéines à un régime contenant 6% de protéines induit une réduction de la formation osseuse. Le traitement des souris sous restriction protéique avec du CR10 n’a eu aucun effet, ce qui signifie que le CR10 n’arrive pas à exercer son activité anabolique in vivo. En revanche, si de la caséine est donnée à la place du soja ou si de la PTH est injectée aux souris, la formation osseuse est augmentée. Ces résultats suggèrent que la fraction CR10 n’est pas un bon candidat comme fraction anabolique. En revanche, l’effet positif de la caséine par rapport au soja pourrait être exploité lors de futures études visant à mettre au point une fraction caséique ostéoanabolique. / Osteoporosis is a disease mainly affecting women after menopause, characterized by a reduced bone mineralization and a deterioration of bone micro-architecture. The aim of this thesis is to identify a milk protein fraction able to stimulate bone formation. When added to a food product, this fraction could reduce bone loss. The first task of this project was to produce the milk protein fractions. Milk proteins (casein or whey proteins) were digested by enzymes and fractionated by filtration according to their molecular weight. The fractions obtained were then tested on primary cultures of bone cells. Some of the milk protein fractions tested were able to increase proliferation and differentiation of osteoblasts. Among these active fractions, the one obtained by digestion of casein by chymotrypsin followed by filtration through a 10 kDa filter have been selected to be tested on animals. This fraction is named CR10. To study the activity of CR10 in vivo, a protein-restricted mouse model has been developed. Our studies showed that a reduction of protein in the diet from 20% to 6% impaired bone formation when the diet was based on soy protein. When these protein-restricted mice ingested the CR10 fraction, no improvement of the BMD was reported, which means that the CR10 cannot exert its anabolic activity in vivo. However, if casein is given instead of soy or if PTH is injected to the mice, bone formation is increased. These results suggest that the CR10 is not a good candidate as an anabolic fraction. However, the positive effect of casein compared to soy could be exploited in future studies aimed at finding an osteoanabolic casein fraction.

Osteoporosis is a disease of the bones. It is often called the “silent disease," because someone could have it now or be at-risk without even realizing it. As a result, bones become weak and can break from a minor fall or, in serious cases, even from simple actions, like sneezing or bumping into furniture. Breaking a bone is often the first clue that someone suffers from osteoporosis. The diagnosis of osteoporosis can be made using conventional radiography and by measuring the Bone Mineral Density (BMD). The most popular method of measuring BMD is Dual-Energy X-ray Absorptiometry (DXA). In conventional methods the measurement of bone does not give information about the bone quality but for the bone quantity. A non-invasive method that will have the ability to determine the bone quality is of interest. Such a method will contribute to the prediction or even the prevention of bone malfunction. In this study, two quality parameters, that are designed to contribute to improved diagnostic methods of osteoporosis, are determined. Those bone quality parameters are the Calcium/Phosphate (Ca/P) and Hydroxyapatite/Collagen (HAp/Col) ratios. The algorithm developed allows us to trace the spectral changes which take place when an x-ray beam passes through filters based on the Lambert and Beer’s law. A large number of filters were applied to spectra so as to obtain pseudo-monoenergetic spectra. The optimum energy pair would derive from two quasi-monoenergetic spectra with sufficient number of photons which will result in the minimization of the Coefficient of Variation (CV) of the aforementioned ratios. Dual Energy x-ray method is used in order to obtain this energy pair. Both Single and Double exposure techniques are used. / Η οστεοπόρωση είναι μια ασθένεια των οστών. Συχνά αποκαλείται ως η «αθόρυβη ασθένεια», καθώς κάποιος δεν αντιλαμβάνεται ότι νοσεί από αυτή. Σαν αποτέλεσμα της ασθένειας αυτής, τα οστά αδυνατίζουν και μπορεί να σπάσουν ακόμα και με ένα πολύ μικρό πέσιμο, ή ακόμα στις πιο σοβαρές περιπτώσεις, ακόμα και με ένα φτέρνισμα ή ένα χτύπημα στα έπιπλα. Η θραύση ενός οστού είναι το πρώτο σύμπτωμα της εμφάνισης της οστεοπόρωσης. Η διάγνωση της οστεοπόρωσης μπορεί να γίνει με τη συμβατική ακτινογραφία και μετρώντας την πυκνότητα των οστικών αλάτων (BMD). Η πιο διαδεδομένη μέθοδος μέτρησης του BMD είναι η DXA. Στην παρούσα μελέτη, υπολογίστηκαν δύο ποιοτικοί παράμετροι , ο λόγος ασβεστίου-φωσφόρου (Ca/P) και ο λόγος υδροξυαπατίτη- κολλαγόνου (HAp/Col). Πραγματοποιήθηκε αλγόριθμος στον οποίο έγινε χρήση διαφόρων φίλτρων έτσι ώστε να τροποποιηθούν τα φάσματα ακτίνων-Χ και να αποκτηθούν σχεδόν μονοενεργειακά φάσματα. Επιπλέον χρησιμοποιήθηκαν οι τεχνικές μονής και η διπλής έκθεσης.

Σκοπός: Πρόσφατα δεδομένα, υποδεικνύουν ότι διαταραχή της ισορροπίας του λιπιδικού μεταβολισμού επηρεάζει τη λειτουργία των κυττάρων του οστού, με αποτέλεσμα την ανάπτυξη εκφυλιστικών και μεταβολικών νόσων, όπως η οστεοπόρωση. Στην παρούσα εργασία, μελετήσαμε τον ρόλου της απολιποπρωτεΐνης Ε (apoE), βασικού συστατικού του συστήματος μεταβολισμού των χυλομικρών και της VLDL (Very Low-Density Lipoprotein), στη ρύθμιση της οστικής ανακατασκευής και στην παθογένεια της οστεοπόρωσης, σε πειραματικά μοντέλα ποντικιών που έλαβαν δίαιτα πλούσια σε λιπαρά. Υλικά και μέθοδοι: Για τον λόγο αυτό, χρησιμοποιήσαμε μοντέλα ποντικών με έλλειψη του γονιδίου της apoE (apoE-/-) και αγρίου τύπου (C57BL/6) (ομάδα ελέγχου) που τους χορηγήθηκε για 24 εβδομάδες δίαιτα δυτικού τύπου (WTD) πλούσια σε λιπαρά (10 ζώα/ομάδα). Επιλέχθηκε η δίαιτα δυτικού τύπου διότι προσομοιάζει τις διατροφικές συνήθειες του σύγχρονου δυτικού κόσμου. Κάθε 6 εβδομάδες γινόταν μέτρηση σωματικού βάρους. Δύο και επτά ημέρες προ της ευθανασίας πραγματοποιήθηκε ενδοπεριτοναϊκή ένεση καλσεΐνης. Την 24η εβδομάδα τα ζώα θυσιάστηκαν, απομονώθηκαν χειρουργικά το μηριαίο οστό και οι οσφυϊκοί σπόνδυλοι και έγιναν ιστολογικές και ιστομορφομετρικές αναλύσεις. Με τη χρήση microCT scanner (στατική ιστομορφομετρία) εκτιμήθηκε η ποιότητα και η ποσότητα του σπογγώδους και του φλοιώδους οστού. Με τη χρώση TRAP και την εναπόθεση καλσεΐνης (δυναμική ιστομορφομετρία) ελέγχθηκε η οστική αποδόμηση και ο ρυθμός σύνθεσης νεοσχηματιζόμενου οστού, αντίστοιχα. Με τη χρήση φασματοσκοπίας Raman, αξιολογήθηκε η κατάσταση του δικτύου κολλαγόνου των μηριαίων οστών. Επιπλέον, μεσεγχυματικά κύτταρα του μυελού των οστών (BMMSC) απομονώθηκαν από το μηριαίο οστό των πειραματόζωων και καλλιεργήθηκαν με σκοπό την εκτίμηση των επιπέδων έκφρασης, τόσο σε επίπεδο πρωτεΐνης όσο και σε επίπεδο mRNA, μορίων που εμπλέκονται στην οστεοβλαστική λειτουργία [(Runx2, Osterix (Osx), Κολλαγόνο I τύπου 1a (Col1a1)], στην οστεοκλαστική λειτουργία [osteprotegerin (OPG), RANK-Ligand (RANKL), λόγος OPG/RANKL, RANK, TRAP, cathepsin Κ] καθώς και στην λιπογένεση [Peroxisome-Proliferator-Activated receptor γ (PPARγ)]. Για την εκτίμηση των επιπέδων έκφρασης των πρωτεϊνών, χρησιμοποιήσαμε τις μοριακές τεχνικές Western Blot και κυτταρομετρία ροής ενώ για την αξιολόγηση των επιπέδων έκφρασης του mRNA χρησιμοποιήσαμε τη RT-PCR. Αποτελέσματα: 1) Τα apoE-/- πειραματόζωα που έλαβαν WTD δεν ανέπτυξαν παχυσαρκία σε αντίθεση με τα C57BL/6 WTD. 2) Στον μυελό των οστών των apoE-/- WTD ποντικιών παρατηρήθηκε πλήρης απουσία λιποκυττάρων, σε αντίθεση με τα C57BL/6 WTD ζώα των οποίων ο μυελός των οστών ήταν πλούσιος σε λιποκύτταρα. 3) Ο αριθμός των οστεοκλαστών ήταν σημαντικά αυξημένος, ενώ των οστεοβλαστών σημαντικά ελαττωμένος στα apoE-/- WTD πειραματόζωα σε σύγκριση με τα C57BL/6 WTD. 4) Η στατική και η δυναμική ιστομορφομετρία έδειξαν ότι τα apoE-/- ποντίκια, σε δίαιτα δυτικού τύπου, εμφάνισαν σημαντική ελάττωση της οστικής τους μάζας. 5) Το δίκτυο του κολλαγόνου στα apoE-/- WTD ποντίκια εμφανίστηκε σημαντικά πιο σκληρό, πιο άκαμπτο και κατά συνέπεια λιγότερο ελαστικό συγκρινόμενο με αυτό των C57BL/6 WTD. 6) Τα apoE-/- WTD ποντίκια, εμφάνισαν σημαντικά μειωμένα επίπεδα έκφρασης του ρυθμιστή της οστεοβλαστογένεσης Runx2, τόσο σε επίπεδο πρωτεΐνης όσο και σε επίπεδο mRNA, συγκρινόμενα με τα C57BL/6 WTD ζώα. 7) Τα επίπεδα έκφρασης των ρυθμιστών της οστικής ανακατασκευής RANK και RANKL, ήταν σημαντικά αυξημένα στα apoE-/- WTD ποντίκια σε σχέση με τα C57BL/6 WTD ποντίκια. Αντίθετα, τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου της OPG καθώς και η αναλογία OPG/RANKL, ήταν σημαντικά μειωμένα στα apoE-/- WTD ποντίκια. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στην έκφραση των οστεοκλαστικών ρυθμιστών cathepsin K και TRAP μεταξύ των δύο υπό εξέταση ομάδων ζώων. 8) Ο ρυθμιστής της λιπογένεσης PPARγ, τόσο σε επίπεδο πρωτεΐνης όσο και σε επίπεδο mRNA, ήταν σημαντικά μειωμένος στα apoE-/- WTD ποντίκια σε σχέση με τα C57BL/6 WTD. Συμπεράσματα: 1) Η έλλειψη της apoE εμπλέκεται στην ελάττωση της οστικής μάζας σε ποντίκια υπό δίαιτα δυτικού τύπου 2) Η apoE φαίνεται ότι διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της λειτουργίας των οστεοβλαστών, ενώ δεν είναι σαφής ο ρόλος της στη λειτουργία των οστεοκλαστών 3) Η έλλειψη της apoE, προστατεύει από την παχυσαρκία αλλά και την εναπόθεση λιποκυττάρων στον μυελό των οστών, κατόπιν λήψεως δίαιτας πλούσιας σε λιπαρά. 4) Η apoE ρυθμίζει τη διαφοροποίηση των MSC’s σε ερχόμενο στάδιο, καθώς η έλλειψή της επηρεάζει τόσο την οστεοβλαστική όσο και τη λιποβλαστική διαφοροποίηση, μετά από κατανάλωση δίαιτας δυτικού τύπου, πλούσιας σε λιπαρά. / Introduction: Recent data suggest that lipid metabolism imbalances affect bone cell function and therefore may result in the development of metabolic diseases such as osteoporosis. In the present study, we investigated the role of apoE, a plasma protein playing cardinal role in lipoprotein metabolism, in the regulation of osteoblasts, osteoclasts and lipoblasts and in the pathogenesis of osteoporosis. Material and Methods: We used apoE deficient (apoE-/-) and wild type (C57BL/6) mice (10 animals/ group). Mice were fed with standard western-type diet (WTD) for 24 weeks. Body weight measurements were obtained every 6 weeks. Two and seven days before euthanasia calcein was injected intraperitonealy for the determination of new bone formation rate. Following sacrifice, lumbar vertebrae and femora were removed and quantitative/qualitative study of the cortical and cancellous bone was performed using microCT scanner. In the tissue sections we perfomed histological (H&E) and histochemical (TRAP) analyses. Static and dynamic histomorphometry were employed for the determination of bone quality and bone cell function. Using Raman spectroscopy, the quality and biochemical composition of the collagen fibers of the examined femora were evaluated. Bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) were isolated from mice femora and then assessed for the expression of the osteoblastic (Runx2, OSX, Col1a1), osteoclastic (OPG, RANKL, OPG/RANKL, RANK, TRAP, cathepsin K) and lipoblastic (PPARγ) regulators using Western Blotting, Flow Cytometry and RT-PCR. Results: 1) apoE-/- mice under WTD did not develop obesity and their BM was devoid of adipocytes, in contrast to the control mice. 2) Osteoclast number was significantly increased, while bone synthesis was significantly reduced in apoE-/- compared to the C57BL/6 mice that consumed WTD. 3) Static and dynamic histomorphometry showed that apoE-/- mice had sugnificantly reduced bone mass and impared bone architecture. 4) The collagen network in apoE-/- WTD mice was significantly stiffer and more rigid compared to the C57BL/6 WTD mice. 5) BMMSCs from apoE-/- WTD mice displayed significantly reduced Runx2 expression at both protein and mRNA levels compared to the control group. 6) The expression levels of RANK and RANKL, were significantly elevated in apoE-/- WTD mice compared to C57BL/6 WTD mice. In contrast, the gene expression levels of OPG and the ratio OPG / RANKL, were statistically significantly reduced in apoE-/- WTD mice. No significant differences were observed in the expression of cathepsin K and TRAP genes between the two test groups of animals. 7) The expression of the major lipoblastic regulator PPARγ was significantly reduced in apoE-/- WTD compared to their WT counterparts. Conclusions: 1) Low levels of apoE result in reduced bone mass following WTD. 2) apoE is implicated in the regulation of osteoblast function; nevertheless, its role in osteoclast function warrants further investigation. 3) The absence of apoE prevents obesity and BM adipocity after the consumption of WT (high-fat) diet. 4) apoE deficiency, regulates MSC differentiation at early stages, since its absence affects both the osteoblastic and lipoblastic differentiation, after the consumption of high fat diet.

Στην παρούσα διατριβή, μελετήθηκε η επίδραση της ατορβαστατίνης στην εξέλιξη της οστεοπόρωσης. Ως πειραματικό μοντέλο επιλέχθηκε ο επίμυς, που, κατόπιν, απώλειας των οιστρογόνων λόγω ωοθηκεκτομής, αναπτύσσει οστεοπόρωση. Η επαγωγή της οστεοπόρωσης επιβεβαιώθηκε με πληθώρα μεθόδων. Αρχικά, (ημέρα 0) στο πειραματικό δείγμα (n=25) πραγματοποιήθηκαν μετρήσεις, στο αίμα, των βιοχημικών δεικτών του μεταβολισμού του οστού, (Αμινοτελικό πεπτίδιο του κολλαγόνου Τύπου Ι – NTx και οστεοκαλσίνη) με τη μέθοδο ELISA, μέτρηση της οστικής πυκνότητας με τη μέθοδο pQCT και αξιολόγηση της δομικής ακεραιότητας – ποιότητας του οστού με τη μέθοδο MDF. Ακολούθησε η αφαίρεση των ωοθηκών άμφω και, μετά από 60 ημέρες, επαναλήφθηκαν οι παραπάνω μετρήσεις. Όλες οι παραπάνω μέθοδοι, επιβεβαίωσαν την επαγωγή της οστεοπόρωσης μετά την ωοθηκεκτομή, και, άρα, την επιτυχία του πειραματικού μοντέλου. Αφού εξασφαλίσθηκε το οστεοπορωτικό μοντέλο, ο πειραματικός πληθυσμός χωρίστηκε τυχαία σε τρεις υπο-πληθυσμούς. Στον ένα υπο-πληθυσμό (n=10) χορηγήθηκε ατορβαστατίνη (4mg/kg/ημέρα), στον δεύτερο υπο-πληθυσμό (n=10) χορηγήθηκε αλενδρονάτη (4mg/kg/ημέρα), ενώ ο τρίτος υπο-πληθυσμός (n=5) χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός μάρτυρας και δεν έλαβε καμία θεραπεία (no-therapy control). Η χορήγηση των φαρμακευτικών αγωγών ήταν δια στόματος μέσω στοματογαστρικού καθετήρα και διήρκεσε από την ημέρα 60 έως την ημέρα 145. Μετά το πέρας χορήγησης των φαρμακευτικών αγωγών, επαναλήφθηκαν οι προαναφερθείσες μετρήσεις, τα πειραματόζωα θυσιάστηκαν και απομονώθηκαν οστά κνήμης για ιστολογική μελέτη, καθώς και μελέτη πρωτεϊνικών μορίων που εμπλέκονται στην κυτταρική βιολογία των κυττάρων του οστίτη ιστού. Συγκεκριμένα, η ιστολογική μελέτη συμπεριελάμβανε εκτίμηση των οστών με χρώση αιματοξυλίνης – ηωσίνης σε τομές παραφίνης, ιστομορφομετρία, ανοσοϊστοχημική χρώση των μορίων Bone Morphogenetic Protein-2 (BMP-2) και Fas (παράγοντας οστεοκλαστικής απόπτωσης) σε τομές σε πλαστικό, καθώς και ανοσοαποτύπωση κατά Western των αυτών πρωτεϊνών. Γενικά, όλες οι μέθοδοι που εφαρμόστηκαν, έδειξαν να ακολουθούν όλες τις μεταβολές στην δομική – ποιοτική κατάσταση των οστών, καθ’όλη την πειραματική πορεία. Ιδιάιτερη ευαισθησία στην ανίχνευση των μεταβολών αυτών, φάνηκε να παρουσιάζουν οι βιοχημικοί δείκτες του οστικού μεταβολισμού, αλλά και η νέα μέθοδος μέτρησης του Συντελεστή Εσωτερικής Απόσβεσης (MDF). Όσον αφορά στις φαρμακευτικές αγωγές, και η ατορβαστατίνη και η αλενδρονάτη παρουσίασαν θετική επίδραση στην εξέλιξη της οστεοπόρωσης, επιβραδύνοντάς την. Ειδικότερα, η ομάδα που έλαβε ατορβαστατίνη επέδειξε μια ισχυρότερη απόκριση στη χορήγηση της ουσίας, συγκριτικά με την ομάδα που έλαβε αλενδρονάτη. Προς την ίδια κατεύθυνση, φάνηκε να τείνουν και τα ευρήματα σχετικά με την έκφραση της BMP-2 και του Fas, αφού η ατορβαστατίνη ήταν η ουσία εκείνη που αύξησε την έκφραση και των δυο αυτών μορίων και, συνεπώς, την παραγωγή οστού από τους οστεοβλάστες και την απόπτωση των οστεοκλαστών. Στο σημείο αυτό θα ήταν σκόπιμο να σημειωθεί πως τα αποτελέσματα της μελέτης αυτής είναι ενδεικτικά και θα μπορούσαν να ισχυροποιηθούν με εφαρμογή των πειραματικών μεθόδων σε μεγαλύτερο πειραματικό δείγμα, μεγαλύτερη διάρκεια χορήγησης των φαρμάκων και δοκιμές διαφορετικών δόσεων αυτών. / The effects of the administration of atorvastatin on the development of ovariectomy-induced osteoporosis were evaluated in this study. The ovariectomized rat was employed as the experimental model. The development of osteoporosis, following ovariectomy was confirmed by a plethora of experimental methods and techniques. Initially (day 0), the experimental population (n=25) was submitted to blood measurements of the bone biochemical markers, NTx and osteocalcin (ELISA protocol), bone density measurements by pQCT and assessment of bone structural integrity with MDF methodology. MDF (Modal Damping Factor) is a new analytical and arithmetic method, based on the measurement of the dynamic characteristics of bone (quality factor and modal damping factor) by applying vibration excitation in the range of acoustic frequencies. Ovariectomy was performed to all test animals, and 60 days later, the same biochemical and radiological measurements were repeated. All the above methodologies confirmed the development of osteoporosis renderring, thus, the experimental animal model successful. Since osteoporosis had been confirmed, the experimental population was randomly divided (two cases to one control) into 3 sub-populations. The first sub-population (n=10) was administered atorvastatin (4mg/kg/day), the second sub-population (n=10) was administered alendronate (4mg/kg/day), whereas the third sub-population (n=5) was not administered any drug (no-therapy control). Drug administration was oral by gavage, from day 60 up to day 145. At the end of therapy, the test animals were again tested for levels of bone biochemical markers NTx and osteocalcin, and submitted to pQCT and MDF evaluation. They were, then, euthanized and tibiae were isolated for further histological studies. Specificly, histology studies included the evaluation of bone quality by eosin – hematoxylin staining of paraffin – embedded tibia sections, Histomorphometry, immunohistochemistry of methyl-methacrylate – embedded sections and Western Blotting for Bone Morphogenetic Protein-2 (BMP-2) and apoptotic factor Fas. In general, all methods applied followed the changes in bone integrity and quality, throughout the whole experimental course. Higher sensitivity in detecting these changes was exhibited by the bone biochemical markers and the new MDF method. With regard to the therapeutical agents administered, both atorvastatin and alendronate seemed to have a positive impact on the progression of osteoporosis, decelerating it. Especially, the atorvastatin – treated group presented a greated response to the administration of the drug, compared to the alendronate – treated one. The findings concerning the expression of BMP-2 and Fas, seemed to point to the same direction, since atorvastatin administration increased the levels of BMP-2 and Fas expression, increasing, thus, the bone production and osteoclast apoptosis, respectively. At this point, it would be wise to notice that our results are indicative, not conclusive and could be fortified by application of the methods used on a larger experimental sample size, longer administration of the drugs and tests of different drug dosages.

Το αξιόπιστο πειραματικό μοντέλο της ωοθηκεκτομής σε επίμυες εφαρμόστηκε για τη μελέτη των παθογενετικών μηχανισμών της οστεοπόρωσης. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η διερεύνηση του ρόλου της λεπτίνης και των κυτοκινών RANKL και οστεοπροτεγερίνης (OPG) στην εξέλιξη της οστεοπόρωσης. Για την διεκπεραίωση της μελέτης χρησιμοποιήθηκαν 40 ενήλικοι θηλυκοί επίμυες ηλικίας 9 μηνών. Πριν την ωοθηκεκτομή στους επίμυες εφαρμόστηκε η τεχνική της ποσοτικής υπολογιστικής τομογραφίας (pQCT) παράλληλα με την πρωτοποριακή μη επεμβατική τεχνική του θερμοδυναμικού συντελεστή εσωτερικής απόσβεσης (MDF) ώστε να διαπιστωθεί η κατάσταση της οστικής πυκνότητας των πειραματόζωων. Σε χρονικά διαστήματα 20, 40 και 60 ημερών μετά την ωοθηκεκτομή πραγματοποιήθηκαν τυχαίες ομαδικές θυσίες με σκοπό τη συλλογή αίματος και την απομόνωση μηριαίων οστών και οστών κνήμης. Την 60η ημέρα πριν τη θυσία στην τελευταία ομάδα των ωοθηκεκτομήθέντων επίμυων επαναλήφθηκαν οι μετρήσεις pQCT και MDF για να διαπιστωθεί η εγκατάσταση σοβαρής οστεοπόρωσης με τη λήξη της πειραματικής πορείας. Οι οροί αίματος που συλλέχθηκαν από όλα τα χρονικά πειραματικά σημεία χρησιμοποιήθηκαν για τη διερεύνηση των επιπέδων έκφρασης των βιοχημικών δεικτών του οστικού μεταβολισμού NTx και οστεοκαλσίνης καθώς και της ελεύθερης λεπτίνης με την τεχνική της ενζυμικής ανοσοπροσρόφησης (ELISA). Στα οστά της κνήμης εφαρμόστηκε η τεχνική της ιστομορφομετρίας για τη μελέτη των μεταβολών της μικροαρχιτεκτονικής δομής των οστών κατά την εξέλιξη της οστεοπόρωσης. Επιπρόσθετα η τεχνική της ανοσοϊστοχημείας εφαρμόστηκε στα οστά της κνήμης για τη διερεύνηση των μεταβολών που προκαλεί η ωοθηκεκτομή στα επίπεδα έκφρασης του υποδοχέα της λεπτίνης και των κυτοκινών RANKL και οστεοπροτεγερίνης στους οστικούς κυτταρικούς πληθυσμούς. Στα μηριαία οστά εφαρμόστηκαν οι τεχνικές της ηλεκτροφόρησης σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE electrophoresis) και του ανοσοστυπώματος (Western Blot) για να συλλεχθούν επιπλέον πληροφορίες σχετικά με τις μεταβολές στα επίπεδα έκφρασης του υποδοχέα της λεπτίνης και των κυτοκινών RANKL και οστεοπροτεγερίνης κατά την εξέλιξη της οτεοπόρωσης. Τα συμπεράσματα που διεξάγονται από τα επιμέρους πειραματικά δεδομένα επιβεβαιώνουν την υπόθεση ότι η λεπτίνη κατέχει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του οστικού μεταβολισμού και συμμετέχει ενεργά μέσω κάποιου άγνωστου μέχρι στιγμής μηχανισμού στη διαδικασία της οστικής ανακατασκευής στην οστεοπόρωση. Όσον αφορά τις ρυθμιστικές κυτοκίνες της οστεοκλαστογένεσης RANKL και OPG, διαπιστώθηκε ότι μεταβάλλονται σημαντικά κατά την εξέλιξη της οστεοπόρωσης στους ωοθηκεκτομηθέντες επίμυες, υποδηλώνοντας τη σημαντικότητα του ρόλου τους στον οστικό μεταβολισμό. / Ovariectomy in mature rats mimics the changes in bone metabolism observed in postmenopausal women and results in osteoporosis. The aim of this thesis was to investigate the role of leptin and the cytokine RANKL and Osteoprotegerin (OPG) in the progression of ovariectomy-induced osteoporosis. Nine–month-old female Wistar rats were bilaterally ovariectomized (n=40). Before the operation, pQCT and MDF technology were applied on rats in order to estimate the bone mineral density of the animals. On days 20, 40 and 60 after the operation the rats were randomly sacrificed and blood samples, dissected knees and femurs were collected. On day 60, pQCT and MDF techniques were applied in order to confirm the establishment of severe osteoporosis until the end of the experimental procedure. Leptin, and the biochemical markers of bone metabolism, osteocalcin and NTx, were measured in blood serum from all time points, by an ELISA method. Bone sections from the knees of the rats were examined by histomorphometric techniques in order to investigate the alterations in the micro-architectural structure of the skeleton caused by ovariectomy. Furthermore, immunohistochemistry was applied on knee sections and SDS-PAGE electrophoresis and western blot techniques were performed in femur homogenized tissueς, in order to investigate whether the expression levels of leptin receptor, RANKL and OPG were altered during the progression of osteoporosis. The results indicate that leptin is involved in the molecular mechanisms of bone remodeling in osteoporosis. The regulators of osteoclastogenesis, RANKL and OPG are also important players in the field of bone metabolism