The first part of this thesis examined by comparative analysis the phenotype, tissue distribution and functional profile of the human DC subsets, myeloid (m) DC and plasmacytoid (DC), in RA and PsA. This study demonstrated that circulating pDC and mDC are reduced in the peripheral blood (PB) of RA and PsA patients, but are accumulated to the inflammatory synovial fluid (SF) and synovial membrane (SM), commensurate with altered migration. Furthermore, it was demonstrated that the majority of pDC and mDC within the synovial compartment displayed a predominantly immature phenotype as identified by the low to absent expression of specific co-stimulation and maturation markers including CD80, CD83, CD86 and dendritic cell lysosome-associated membrane protein (DC-LAMP). However, pDC and mDC purified from SF underwent ex vivo phenotypic maturation and released cytokines to TLR stimulation at comparable levels to their normal PB purified counterparts. Commensurate with that observation, cytokine profiling of SM localized pDC and mDC revealed expression of the pro-inflammatory cytokines IL-12p70, IL-23p19, IL-15, IL-18 and IFN-α/β. Together these data indicated no apparent intrinsic cellular defect, suggesting that extrinsic factors in the local synovial environment may be culpable for inhibition of DC maturation. In addition mDC in SM expressed predominantly IL-12p70 and IL-23p19, suggesting a central role in the regulation and expansion of T cells, in particular Th17, which have been ascribed a pathologic role in arthritis. In contrast, pDC expressed predominantly IL-15 and IL-18, cytokines that can enhance IL-12 induced IFN-γ release and inhibit T cell apoptosis, thus indicating a role in the amplification and prolongation of inflammatory arthritis. Of particular interest it was demonstrated that pDC also expressed IFN-α/β in abundance. As pDC constituted the dominant DC subset in the SM in both RA and PsA, this may have pathological implications as IFN-α has been critically linked to pathology in other autoimmune diseases, including systemic lupus erythematosus (SLE) and, of particular import to PsA, psoriasis. In conclusion, these studies indicate that mDC and pDC possess multi-faceted roles in inflammatory arthritis, involved in both the initiation and perpetuation of arthritis, but also the potential suppression thereof. The data provide a firm basis upon which to build rational tolerance induction regimes in due course as the appropriate biological targeting agents become available in the clinical environment.

Transglutaminase 2 (TG2) is an enzyme with a predominant role in cell stress response and tissue repair. Dramatically increased production of this enzyme is associated with early changes in arthritis, and the activity of the protein has been shown to directly contribute to both inflammatory and degenerative arthritis, although through distinct molecular mechanisms. Aberrant TG2 activity during joint disease might lead to protein modifications that are not normally present in extracellular matrix components. Those novel epitopes can possibly serve as a qualitative biomarker besides their potential role in disease pathogenesis. TG2 is released from cells via a non-conventional route, and this mechanism controls its extracellular activity. This pathway is likely to be shared with other proteins undergoing alternative secretion, many of which are potent biological signaling molecules. The aim of this project is to investigate whether non-classical secretion of TG2 is mediated by activation of the ligand-gated ion channel 7 (P2X7R) in analogy to interleukin-1β processing and release. Specifically, we are exploring whether ATP, a P2X7R agonist, which might be released from damaged cells at the sites of injury, triggers active release of TG2 from cells. To test this hypothesis we first employed macrophage and breast cancer cell models, where P2X7R is endogenously expressed, to look for involvement of ATP signaling in TG2 externalization through microvesicle shedding. By establishing HEK293 cells stably expressing P2X7R we show for the first time that introduction of functional P2X7R alone is sufficient to reconstitute rapid non-conventional TG2 export in a cell model. P2X7R activation induced time-dependent release of TG2 but not other cytoplasmic proteins, and this response was blocked by a selective P2X7R inhibitor. TG2 release was dependent on Ca2+ influx triggered by P2X7R activation and might be related to P2X7R-dependent membrane pore formation. These results provide a mechanistic explanation for a link between active TG2 release and inflammatory responses.

Η πλειοτροπίνη (ΡΤΝ) είναι ένας αυξητικός παράγοντας με υψηλή συγγένεια για την ηπαρίνη. Παρόλο που εκφράζεται στο χόνδρο κατά την εμβρυική και νεανική ηλικία, ο ρόλος της παραμένει ακόμα ασαφής. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η μελέτη της έκφρασης της ΡΤΝ και του υποδοχέα της Receptor Protein Tyrosine Phosphatase β/ζ (RPTPβ/ζ) στο χόνδρο και στο υποχόνδριο οστό ασθενών με οστεοαρθρίτιδα (ΟΑ). Υλικό και Μέθοδοι: Μελετήθηκαν o χόνδρος και το υποχόνδριο οστό από 29 ασθενείς που υποβλήθηκαν σε ολική αρθροπλαστική γόνατος και ισχίου, λόγω πρωτοπαθούς ΟΑ. Ως μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν 8 ασθενείς που χειρουργήθηκαν για υποκεφαλικό κάταγμα μηριαίου που δεν εμφάνιζαν ακτινολογικές ή μακροσκοπικές οστεοαρθριτικές αλλοιώσεις. Η μελέτη έγινε με τη χρήση ανάλυσης κατά Western και ανοσοϊστοχημείας. Αποτελέσματα: Η ΡΤΝ και ο RPTPβ/ζ δεν ανιχνεύτηκαν στο χόνδρο φυσιολογικών ενήλικων ατόμων. Η έκφραση τους και η αλληλεπίδρασή τους ήταν αυξημένη σε ασθενείς με ΟΑ μέσης ακτινολογικής και ιστολογικής βαρύτητας. Η ΡΤΝ ανιχνεύτηκε κυτταροπλασματικά κυρίως σε συστάδες επιφανειακών χονδροκυττάρων, σε χονδροκύτταρα της νεκρωτικής περιοχής και της ασβεστοποιημένης ζώνης. Επιπλέον, βρέθηκε να εκφράζεται και στα οστεοκύτταρα του υποχόνδριου οστού, με μέγιστη έκφραση σε μέσης βαρύτητας ΟΑ. Ο υποδοχέας RΡΤΡβ/ζ βρέθηκε να εκφράζεται και αυτός στο υποχόνδριο οστό σε μέσης βαρύτητας ΟΑ, ενώ με την αύξηση της βαρύτητας της νόσου, βρέθηκε να εκφράζεται στα οστεοκύτταρα βαθύτερων οστικών δοκίδων. Συμπεράσματα: Η αυξημένη έκφραση της ΡΤΝ και του υποδοχέα της RPTPβ/ζ στο χόνδρο και στο υποχόνδριο οστό ασθενών με ΟΑ καθιστά τα μόρια αυτά δυνητικά ενδιαφέροντες υποψήφιους στόχους για την ανάπτυξη θεραπευτικής προσέγγισης της νόσου. / Pleiotrophin (PTN) is a heparin-binding growth factor expressed in the cartilage in foetal and young age, but its exact role remains unclear as yet. The purpose of this paper is to study the expression of PTN and the receptor protein tyrosine phosphatase beta/zeta (RPTPβ/ζ) in the cartilage and the subchondral bone of patients with osteoarthritis. Material and Methods: We studied the cartilage and the subchondral bone from 29 patients who had undergone total knee and hip replacement for Primary Osteoarthritis, by using Western blot and immunohistochemistry analyses. As controls, we used eight patients operated for fractures of femoral head, who did not present radiological or macroscopical osteoarthritic changes. Results: PTN and RPTPβ/ζ were not detected in the cartilage of normal adults. Their expression and interaction were increased in patients with osteoarthritis (OA) of moderate radiological and histological severity. PTN was detected mainly in the cytoplasm, in clusters of superficial chondrocytes, in necrotic area chondrocytes and in chondrocytes in the tidemark zone. Moreover, it was also expressed in subchondral bone osteocytes, with maximum expression in moderate OA. RPTP β/ζ was also found to be expressed in the subchondral bone in moderate OA, while, as the severity of the disease increased, it was found to be expressed in the osteocytes of the trabecular bone. Conclusions: The increased expression of PTN and RPTPβ/ζ in the cartilage and subchondral bone of patients with OA renders these molecules potentially interesting candidate targets for developing a therapeutic approach to the disease.

Η Οστεοαρθρίτιδα ή αλλιώς η εκφυλιστική νόσος των αρθρώσεων δεν είναι μια μόνο νόσος αλλά μάλλον το τελικό αποτέλεσμα διαφόρων παθήσεων των αρθρώσεων. Σε μεγαλύτερη ή μικρότερη έκταση χαρακτηρίζεται πάντοτε από εκφύλιση του αρθρικού χόνδρου και ταυτόχρονη ανάπτυξη νέου οστού , χόνδρου και συνδετικού ιστού . Η εν λόγω ανάπτυξη έχει ως αποτέλεσμα την αναδιαμόρφωση του περιγράμματος της άρθρωσης . Οι φλεγμονώδεις αλλοιώσεις στην αρθρική μεμβράνη είναι συνήθως μικρές και δευτεροπαθείς . Πρόκειται για μια νόσο η οποία εμφανίζεται στο 80% των ατόμων ηλικίας πάνω από 65 έτη , ως ακτινολογικό εύρημα , ενώ στο 25% αυτών θα παρουσιάζει συμπτώματα . Διάφοροι παράγοντες επηρεάζουν την πορεία της νόσου . Εκτιμάται ότι σε λίγα χρόνια η επίπτωση της νόσου θα είναι τόσο μεγάλη έτσι ώστε δε θα επαρκούν οι ορθοπαιδικοί να χειρουργούν τους ασθενείς !!! Λόγω αυτών επιχειρείται η κατανόηση των μοριακών παθογενετικών μηχανισμών οι οποίοι λαμβάνουν χώρα στην οστεοαρθρίτιδα (ΟΑ) . Ο χόνδρος της άρθρωσης είναι αυτός που εκφυλίζεται με αποτέλεσμα την παραμόρφωση της άρθρωσης . Για την διατήρηση της ακεραιότητας του αρθρικού χόνδρου υπεύθυνη είναι μια λεπτή ισορροπία μεταξύ αναβολικών και καταβολικών διεργασιών που αφορούν τόσο στα χονδροκύτταρα όσο στην εξωκυττάρια θεμέλια ουσία . Η εκφύλιση του εκτελείται από αυξημένη δραστηριότητα των μεταλλοπρωτεασών του στρώματος (Αγκρεκανάσες) καθώς και των υπολοίπων πρωτεολυτικών ενζύμων τα οποία επάγονται από κυτοκίνες ( Il-1 , TNF-a) ή/και προϊόντα αποικοδόμησης της θεμέλιας ουσίας .Αν η εκφύλιση και η καταστροφή του χόνδρου είναι μεγαλύτερη από την παραγωγή νέας θεμέλιας ουσίας από τα χονδροκύτταρα τότε οδηγούμαστε στην ΟΑ . Νέα δεδομένα και απόψεις έρχονται συνεχώς στην επιφάνεια τα οποία υποστηρίζουν την συμμετοχή τόσο του αρθρικού υμένα όσο και του υποχόνδριου οστού στην ανάπτυξη της οστεοαρθρίτιδας . Ο κύριος στόχος αυτής της βιβλιογραφικής εργασίας είναι η λεπτομερής περιγραφή όλων των μορίων και των μονοπατιών που οδηγούν στην ενεργοποίηση των αγγρεκανασών , συνεπώς στην ανάπτυξη της οστεοαρθρίτιδας , την παράθεση των στοιχείων που εμπλέκουν , εκτός του αρθρικού χόνδρου , τον αρθρικό υμένα και το υποχόνδριο οστό στην παθογένεια της , καθώς επίσης τα διάφορα cross talks τα οποία υπάρχουν ανάμεσα στην αναβολική (σύνθεση) και καταβολική (καταστροφή) πορεία του χόνδρου , παρέχοντας έτσι μια καινούρια βάση για μελλοντική ερεύνα και ανακάλυψη νέων φαρμάκων τόσο προληπτικών όσο και θεραπευτικών της οστεοαρθρίτιδας . / -

Des cellules immunitaires appartenant à l’immunité de type 3 sont localisées dans muqueuse digestive. Les micro-organismes du microbiote stimulent le système immunitaire pour le maintenir en veille face à de potentiels agents infectieux, tout en ayant une tolérance pour les micro-organismes commensaux. Des études montrent des anomalies du microbiote intestinal chez les patients arthritiques. Ceci suggère une dérégulation de l’immunité mucosale digestive dans la survenue de l’inflammation articulaire. Des cellules de l’immunité mucosale pourraient migrer vers les sites articulaires, notamment grâce à des récepteurs aux chimiokines. Le facteur RORγt, indispensable à la différenciation des cellules de l’immunité de type 3, est régulé négativement par le récepteur PPARγ. A l’aide de modèle murins, nous avons étudié l’impact de l’invalidation de PPARγ et de l’inhibition du récepteur aux chimiokines CCR3 sur les relations entre sphères digestive et articulaire. Nous avons montré que l’induction d’une colite au cours d’une arthrite au collagène modifie le microbiote intestinal, retarde l’apparition et diminue la sévérité des lésions articulaires. Nous avons démontré que les souris PPARγ-/- développent spontanément une inflammation articulaire associées à des anomalies dans la répartition des cellules immunitaires de type 3 de la muqueuse digestive. Ces souris sont dysbiotiques avec une flore enrichie notamment en entérobactéries, mais non-arthritogène. Enfin, l’inhibition de CCR3 au cours du développement d’une arthrite au collagène retarde et diminue la sévérité de la pathologie et altère la répartition des leucocytes dans les articulations et de la muqueuse digestive / Numerous type 3 immune cells (Th17 and ILC3) are physiologically located in lamina propria of the intestine. Microbial agents within the gut shape the immune system to make it efficient against threats but peaceful with commensals. Recent studies demonstrated changes in gut microbiota composition (dysbiosis) in chronic inflammatory rheumatism. These results suggest a role for mucosal immunity alteration in articular inflammation occurrence. Indeed, some type 3 immune cells once activated by microbiota, are thought to migrate to joints, involving notably chemokines receptors. Transcription factor RORγt, the master regulator of type 3 immune cells, could be negatively regulated by nuclear receptor PPARγ. Using experimental murine models, we studied the consequence of PPARγ deficiency and consequence of the chemokine receptor CCR3 inhibition on the joint-gut axis. Firstly, we demonstrated that experimental colitis induces microbiota changes, delays and reduces collagen-induced arthritis severity. Secondly, we showed that PPARγ deficient mice display spontaneous joint inflammation associated with abnormal type 3 distribution within the gut. Dysbiosis with enrichment in facultative anaerobic Enterobacteriaceae was found in these mice. Fecal microbiota transfer demonstrated this microbiota is non-arthritogenic. Finally, we demonstrated that CCR3 inhibition has profound anti-arthritic potencies associated with changes in leukocytes distribution within the joint-gut axis

L'arthrose (OA) est une maladie dégénérative avec un impact remarquable sur la qualité de vie. Pourtant, aucune intervention pharmacologique entièrement appropriée, aucune thérapie biologique ou procédure n'entraînent la dégradation progressive de l'articulation OA. Ici, nous explorons les cellules souches mésenchymateuses (MSC) - précurseurs multi-potentiels de cellules qui peuvent être isolées à partir de différents niveaux de dégradation du cartilage. Nous émettons l'hypothèse que les cellules progénitrices mésenchymateuses (CPM) pourraient servir comme une thérapie potentielle. Le cartilage ostéoarthritique humain a été obtenu de 25 patients subissant un remplacement total du genou et classé en différents niveaux de dégradation. Les niveaux d'expression de l'ARNm de CD105, CD166, Notch 1, Sox9, Acan, Col II A1 et Col I A1 ont été mesurés au jour 0, au jour 14 (2 semaines in vitro) et au jour 35 (après chondrogénèse). Les cellules de toutes les classes d'OA ont augmenté de façon significative les marqueurs MPC de l'ARNm avec expression in vitro. Les cellules proliférées ont exprimées des marqueurs spécifiques aux MPC: CD105, CD166, CD73, CD90, Notch – 1 and Nucleostemin. La chondrogénèse induit une diminution de l'ARNm de CD105, de Notch 1 et de Sox9 seulement dans l'OA légère et modérée. Cependant, seules les pastilles modérées dérivées d 'OA ont révélé des signes de cartilage hyaline élevé - collagène II et faible expression de fibrocartilage - collagène I à la fois au niveau de l’ARNm et de la protéine. Une nouvelle conclusion émerge de nos données et confirme les différences dans les marqueurs MPC entre les différents niveaux de dégradation. Seules les cellules dérivées d 'OA modérées ont été capables de former une matrice hyaline composée de protéoglycanes et de collagène II avec le niveau faible en collagène I fibrocartilagineux. Nos résultats montrent que les CPM provenant d’un cartilage d’un niveau de dégradation modéré ont un fort potentiel d'auto-réparation. / Osteoarthritis (OA) is a degenerative disease with a remarkable impact on quality of life. Yet no fully appropriate pharmacological intervention, biologic therapy or procedure stops the progressive degradation of the OA joint. Herein, we explore mesenchymal stem cells (MSCs)—multipotent precursors of cells that can be isolated from different grades of OA cartilage. We hypothesize that mesenchymal progenitors cells (MPC), could emerge as a potential therapy. Human osteoarthritic cartilage were obtained and scored (according to the OARSI) from 25 patients undergoing total knee replacement. mRNA expression levels of CD105, CD166, Notch 1, Sox9, Acan, Col II A1 and Col I A1 were measured at day 0, day 14 (2 weeks in vitro) and day 35 (after chondrogenesis). Cells from all OA grades significantly increased MPC markers mRNA with in vitro expression. Proliferated cells expressed MPC specific antigens: CD105, CD166, CD73, CD90, Notch – 1 and Nucleostemin. The chondrogenesis induced decrease in CD105, Notch 1 and Sox9 mRNA only in mild and moderate OA. Yet, only moderate OA – derived pellets revealed high hyaline cartilage marker – collagen II and low fibrocartilage marker – Collagen I expression at both mRNA and protein level. A novel finding emerges from our data and confirms differences in MPC markers between OA grades. Only moderate – OA derived cells were able to form hyaline – like matrix composed of proteoglycans and collagen II with law level of fibrocartilaginous collagen I. Further studies that investigate the mechanistic effects of chondrogenic progenitor populations associated with aging and the progression of OA are crucial to our understanding of the clinical relevance of these cells for use in cartilage repair therapies.

Η IL-27 είναι μια ετεροδιμερής κυτταροκίνη, που παράγεται κυρίως από τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα και αποτελείται από τις υπομονάδες p28 και EBI3. Στα κύτταρα-στόχους ενεργοποιεί το μονοπάτι ενδοκυττάριας σηματοδότησης Jak-STAT και έχει τόσο αντι-φλεγμονώδεις όσο και προ-φλεγμονώδεις λειτουργίες. Στη βιβλιογραφία αναφέρεται ως κυριότερη προ-φλεγμονώδης δράση της IL-27 η επαγωγή του αρχικού σταδίου διαφοροποίησης των Th1 λεμφοκυττάρων. Εμείς επιπλεόν διαπιστώσαμε ότι η IL-27 ενισχύει την φλεγμονώδη απόκριση των μονοκυττάρων στους TLR-ligands. Οι αντι-φλεγμονώδεις δράσεις της συνοψίζονται 1) στην αναστολή των Th1, Th2 και Th17 λεμφοκυττάρων και 2) στην παραγωγή IL-10 από τα Τ-λεμφοκύτταρα. Ενώ ο ρόλος της στην πορεία των λοιμώξεων έχει μελετηθεί εκτενώς, ελάχιστα γνωρίζουμε για τις δράσεις της στο πλαίσιο χρόνιων φλεγμονωδών παθήσεων, όπως είναι η Ρευματοειδής Αρθρίτιδα. Στην παρούσα εργασία δείξαμε ότι ο TNF-α προκαλεί την παραγωγή της IL-27 από τα μονοκύτταρα και μακροφάγα, κάτι που ίσως ερμηνεύει την προέλευση της IL-27 που ανιχνεύεται στον αρθρικό υμένα ασθενών με Ρευματοειδή Αρθρίτιδα. Αποδείξαμε ότι η IL-27 έχει ισχυρές αντι-φλεγμονώδεις δράσεις αποτρέποντας τη φλεγμονώδη ενεργοποίηση των μονοκυττάρων και των μακροφάγων από τις κυτταροκίνες TNF-α και IL-1β. Σε αυτό το πλαίσιο, θεωρούμε ότι η IL-27 ίσως αποτελεί έναν αντιρροπιστικό μηχανισμό, που αποσκοπεί στον περιορισμό της έντασης της φλεγμονής. Επιπλέον βρήκαμε ότι είναι ισχυρός αναστολέας της οστεοκλαστογένεσης ελαττώνοντας την έκφραση των υποδοχέων RANK και TREM-2 στην επιφάνεια των προ-οστεοκλαστών. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την αναστολή της επαγωγής των βιοχημικών σημάτων (MAPK και NFκ-B) και των μεταγραφικών παραγόντων (NFATc1 και c-jun), που είναι αναγκαία για την ευόδωση της οστεοκλαστογένεσης. Τα ευρήματά μας, σε συνδυασμό με τις κατασταλτικές δράσεις της στα Τ-λεμφοκύτταρα, υποδεικνύουν ότι η IL-27 θα μπορούσε ίσως να θεωρηθεί μια ελκυστική θεραπευτική προοπτική σε ασθενείς με Ρευματοειδή Αρθρίτιδα αφού στοχεύει τόσο στην καταστολή της χρόνιας φλεγμονής όσο και στην αναχαίτιση των οστικών διαβρώσεων. Αυτή όμως η προοπτική προσκρούει πάνω στο γεγονός ότι, όπως διαπιστώσαμε, φλεγμονώδη ερεθίσματα (το αρθρικό υγρό ασθενών με ΡΑ, ο TNF-α και η IL-1β) καθιστούν τα μονοκύτταρα και τα μακροφάγα ανθεκτικά στις δράσεις της IL-27. Συγκεκριμένα βρήκαμε ότι τα μακροφάγα που προέρχονται από τις φλεγμαίνουσες αρθρώσεις ασθενών δεν απαντούν στην IL-27 και ότι ο TNF-α αναστέλλει την IL-27 μέσω ενός μηχανισμού που εξαρτάται από την ενεργοποίηση του p38. Επιπλέον αποδείξαμε ότι η IL-1β καθιστά τα κύτταρα ανθεκτικά στην IL-27 μέσω ελάττωσης της έκφρασης του μεμβρανικού υποδοχέα της IL-27. Είναι πολύ πιθανό τέτοιοι μηχανισμοί αντοχής να ενεργοποιούνται και στο φλεγμονώδες μικροπεριβάλλον του αρθρικού υμένα και να καθιστούν τα κύτταρα ανθεκτικά στην δράση των αντιφλεγμονωδών παραγόντων, που είναι παρόντες στην άρθρωση (όπως IL-27, IL-10 και TGF-β), συμβάλλοντας έτσι στη διαιώνιση της υμενικής φλεγμονής. / IL-27 is a cytokine mainly produced by antigen presenting cells and is comprised of p28 and EBI3 subunits. IL-27 activates the Jak-STAT signaling pathway and has both anti- and pro-inflammatory functions. The main pro-inflammatory function of IL-27 is the initiation of Th1 differntiation. We have also found that IL-27 primes human monocytes for more robust responses to TLR-ligands. The dominant anti-inflammatory functions of IL-27 are: 1) the inhibition of Th1, Th2 and Th17 differentiation and 2) the production of IL-10 by lymphocytes. While the functions of IL-27 in the course of infections are well-known, the potential role of IL-27 in chronic inflammatory diseases, like Rheumatoid Arthritis (RA), is still unclear. In our current study we have found that TNF-α stimulates production of IL-27 from monocytes and macrophages and this is a potential explanation for the reported expression of IL-27 in synovial tissues from patients with RA. We have also found that IL-27 has potent anti-inflammatory functions by inhibiting the effects of TNF-α and IL-1β on human monocytes and macrophages. In this context we hypothesize that IL-27 represents a feed-back inhibition mechanism that aims to restrain inflammation. Additionally, we observed that IL-27 is a potent inhibitor of human osteoclastogenesis by down-regulating the expression of RANK and TREM-2 on osteoclast precursors and abrogating RANKL-mediated activation of MAPK and NFκ-B pathways and induction of NFATc1 and c-jun. Our observations suggest that IL-27, by targeting concurrently inflammation and joint destruction, could be a potential attractive therapeutic strategy for RA. The main limitation for this perspective is that inflammatory stimuli (including synovial fluids derived from RA patients, TNF-α and IL-1β) render monocytes and macrophages refractory to the regulatory functions of IL-27. We have found that: 1) synovial macrophages derived from RA do not respond to IL-27 and 2) TNF-α and IL-1β inhibit IL-27 functions by a p38-dependent mechanism and by down-regulating expression of IL-27 receptor respectively. In rheumatoid arthritis, within the inflammed synovium, p38 is active and the cytokines TNF-α and IL-1β are abundant. In this context, we believe that these inflammatory stimuli render cells refractory to the anti-inflammatory factors that are expressed within the synovial microenvironment (including IL-27, IL-10 and TGF-β), contributing to the perpetuation of joint inflammation.

Η λεπτίνη είναι μια ορμόνη 16 kD που κωδικοποιείται απότογονίδιο obκαι παράγεται από τα λιποκύτταρα ρυθμίζοντας το ενεργειακό ισοζύγιο. Τα επίπεδα λεπτίνης στο πλάσμα είναι ανάλογα με το δείκτη σωματικής μάζας (BMI), ενώ η έκφρασή της εξαρτάται από τη νηστεία και τη σίτιση, την ινσουλίνη, τα γλυκοκορτικοειδή, καθώς και από προφλεγμονώδεις κυτταροκίνες, κύριως τον TNF-α και την IL-1. Το μόριο της λεπτίνης παρουσιάζει ομοιότητες με τη μακριά έλικα των κυτταροκινών και δρά μέσω του υποδοχέα της (OB-R), ο οποίος ανήκει στην υπεροικογένεια των υποδοχέων των κυτταροκινών και εμφανίζεται σε ποικιλία ισομορφών ενώ εκφράζεται σε διάφορους ιστούς και κύτταρα του νευροενδοκρινικού, αναπαραγωγικού, αιματοποιητικού και ανοσοποιητικού συστήματος. Η λεπτίνη εμπλεκεται και σε αυτοάνοσες καταστάσεις με το να προάγει τη διατήρηση παθογόνων Th1 κυτταρικών υποπληθυσμών. Στην παρούσα μελέτη προκειμένου να διερευνήσουμε το ρόλο της λεπτίνης σε αυτοάνοσες καταστάσεις μετρήσαμε τα επίπεδα αυτής και του υποδοχέα της σε ασθενείς με ρευματοειδή αρθρίτιδα, μια χρόνια συστεμική αυτοάνοση νόσο, για να δούμε εάν αυτά σχετίζονται με το στάδιο της νόσου ή τη θεραπεία. Ακόμη μελετήθηκε η εμπλοκή της λεπτίνης στην έκφραση προ- και αντιφλεγμονωδών κυτταροκινών στον ορό ασθενών και μαρτύρων. Τα αποτελέσματα δείχνουν πως τα επίπεδα λεπτίνης είναι υψηλά στους ασθενέις με ΡΑ. Επιπλέον τα επίπεδα λεπτίνης δεν βρέθηκε να σχετίζονται με το στάδιο της νόσου ή τη χορηγούμενη θεραπεία. Παρόλα αυτά τα αυξημένα επίπεδα λεπτίνης σε ασθενείς με ρευματοειδή αρθρίτιδα καταδεικνύουν ενδεχομένως έναν παθογενετικό ρόλο της λεπτίνης. / Leptin is a 16 kD peptide hormone, encoded by the ob gene and synthesized mainly by adipocytes to regulate the energy balance. In humans, leptin plasma levels are strongly correlated with body mass index (BMI) and the expression of leptin is regulated by fasting and feeding, insulin, glucocorticoids and pro-inflammatory cytokines, mainly TNFa and IL-1. Leptin is structurally similar to long-chain helical cytokines and it signals through its receptor, OB-R, which is a member of the cytokine receptor superfamily. OB-R comes in a variety of protein isoforms, and is expressed in several tissues and cells of the neuroendocrine system as well as the reproductive, hematopoietic and immune systems. Leptin has also been implicated in the pathogenesis of autoimmunity. It has also been suggested that leptin may promote the expansion and maintenance of pathogenic Th1-cell populations in autoimmune diseases. In this study to investigate the role of leptin in human autoimmunity, we measured leptin and OB-Rs levels inthe sera of patients suffering from rheumatoid arthritis (RA), a common chronicsystemic inflammatory disease, and tested for a possible correlation with disease activity and type of treatment. In addition, we studied whether leptin has an effect on the expression patterns of pro- and anti-inflammatory cytokine genes in PBMC isolated from RA patients and controls.Our results showed significantly elevated serum leptin levels in the rheumatoid population compared to the healthy controls.In addition, there was an absence of correlation between serum leptin levels and disease activity, as well as the nature and quantity of the medications administered to the patients. The absence of correlation between serum leptin levels and disease activity, coupled with the significantly and stably elevated levels of this hormone in the rheumatoid sera compared to the controls, are probably indicative of an insiduous pathogenetic role of leptin in rheumatoid arthritis.

La dédifférentiation du chondrocyte peut être provoquée par le stress mécanique ou cytokinique ainsi que la diffusion des facteurs de croissance dans le cartilage. C’est un élément-clé de la dégradation irréversible qui accompagne l’arthrose (ostéoarthritis, OA). Notre but est de rechercher des mécanismes moléculaires susceptibles d’être des cibles thérapeutiques originales contre cette affection. Or, il a été montré récemment que la voie des récepteurs Notch est fortement exprimée dans l’OA humaine. Objectifs: Etudier le rôle de la voie de signalisation Notch /Hes1/Hey1 dans les effets de l’Interleukine-1 β (IL-1β) et du FGF2 sur la dédifférenciation in-vitro des chondrocytes. Méthodes: Des chondrocytes de cartilage articulaire humain ou murin sont mis en culture primaire, puis traités par IL-1β ou FGF2. L’expression de Notch1-R/Hes1/Hey1 est étudiée par immunocytochimie, immunoblot et q-RT-PCR. L’implication de Hes1 dans les effets de l'IL-1β et du FGF2 a été étudiée au moyen d’un siRNA spécifique anti Hes1. Résultats: En normoxie, le marquage de Notch-R1 est localisé à la membrane et dans le cytoplasme des chondrocytes, sans effet des effecteurs. Notch1-R est en revanche nucléaire en hypoxie. L’hypothèse d’un contrôle de la localisation de Notch1-R par la pO2 est confortée par l’inhibition de l’expression de la Préséniline (γ-secrétase) en hypoxie. L’étude des effets des effecteurs sur Hes1 et Hey1 a été réalisée dans les conditions classiques de culture en normoxie. Hes1 est cytoplasmique mais passe dans le noyau sous l’effet de l’IL1β ou de FGF2, suggérant la possibilité d’effets transcriptionnels. Les ARNm de Hes1 sont augmentés d’un facteur de 2,5 avec l’IL-1β et de 7-8 avec le FGF2. Hey1 est insensible à l’IL-1β mais augmente de 4-5 fois sous FGF2. Ces effets sont transcriptionnels directement pour Hes1 (DRB-) et indirectement pour Hey1 (DRB+). Ils passent par la voie NF-κB pour les deux facteurs mais en plus par p38 MAP pour le FGF2. L’induction de Hes1 est insensible au DAPT, inhibiteur de la γ-sécrétase, donc indépendant d’une activation de novo du Notch-R1. L’utilisation d’un siRNA spécifique contre Hes1 montre que l’induction de Hey1 par FGF2 dépend de Hes1 et permet de vérifier l’influence de Hes1 dans la modulation des marqueurs phénotypiques. Hes1 est impliqué dans l’induction par IL-1β de l’expression de MMP13 et ADMTS-5. Hes1 est aussi le médiateur de l’induction par le FGF2 des messagers de la MMP13 (en partie) et de l’isomère Col2A. La protéine Col2A immature est normalement absente du cartilage de souris post-natale, où Col2B est l’isoforme essentielle du collagène de type 2. A l’inverse, le cartilage de souris vieillissante réexprime Col2A, comme cela a été montré dans le cartilage arthrosique chez l’homme. Conclusion: Hes1 est le médiateur des effets d’IL-1β et du FGF2 sur la dédifférentiation in-vitro des chondrocytes (Col2A, MMP13). La voie de Hes1 apparaît donc comme une cible valide pour de nouvelles thérapeutiques contre la dégradation chondrocytaire et donc les maladies dégénératives du cartilage. / Chondrocyte dedifferentiation is a key element of irreversible cartilage degradation induced by mechanical or cytokinic stress, or growth factors, as in degenerative osteoarthritis (OA). Our goal is to search for new therapeutical targets within this process, and Notch signaling has been reported to be strongly expressed during human OA. Objectives: To investigate the involvement of the Notch1/Hes1/Hey1 pathway as mediators of interleukin 1 β (IL-1β) and FGF2 in chondrocytes in vitro. Methods: Mouse or human articular chondrocytes were established in primary culture then challenged with IL-1β or FGF2. Notch-R1, Hes1/Hey1 and chondrogenic target genes expression was monitored by immunocytochemistry, q-rt-PCR, and immunoblotting. Hes1 involvement in IL-1β/FGF2 induced gene expression was investigated with a specific siRNA against Hes1. Results: In normoxia, Notch1-R labeling remained nuclear and stable in intensity in chondrocytes, irrespective of treatment. This suggested steady-state activation of this pathway. In contrast, Notch1-R labeling was located almost exclusively at the membrane or cytoplasm of chondrocytes in hypoxia, irrespective of treatment. Notch-R1 activation may thus be, at least in part, regulated by pO2 as supported by the inhibition of γ-secretase (Presenilin1) expression in hypoxia versus normoxia. In normoxia, addition of IL1β or FGF2 to the cells induced Hes1 translocation to the nucleus, suggesting the possibility of transcriptional effects. This was associated with a transient increase of Hes1 mRNA cyclic expression with mechanistic differences between the two effectors. Hes1 mRNA was increased 2.5-fold by IL-1β and 7-8-fold by FGF2. IL-1β elicited a loss of cyclicity in Hes1 expression while FGF2 conserved the cycles, akin to the effect of serum. These effects were transcriptional and occurred through NF-κB for both effectors but only through the p38 pathway for FGF2. Hey1 expression was not modified by IL-1β, while a 4-5 fold transient increase was observed with FGF2, always posterior to the Hes1 peak. Hey induction by FGF2 was transcriptional and depended on Hes1 expression (DRB). Hes1/ Hey inductions by IL-1β or FGF2 were insensitive to DAPT, a γ-secretase inhibitor, confirming the independence from novel activation of Notch-R. Hes1 expression was silenced by a specific siRNA, showing that the FGF2-induced Hey1 expression is under Hes1 control and ascertaining the role of Hes1 in chondrocyte phenotype modulations. Hes1 mediated IL-1β induction of MMP-13 and ADAMTS-5. Hes1 also mediated FGF2 up-regulation of MMP13 (partly) and Col2A isomer expression. Col2A is normally absent in post-natal mice cartilage, Col2B being the essential isoform of Type 2 collagen. Conversely, aging mice cartilage re-expresses Col2A abundantly as shown for human OA cartilage. Conclusion: Hes1 mediates IL-1β and FGF2 modulations of dedifferentiating chondrocyte phenotype (MMP13, Col2A). Thus the Hes1 pathway appears a valid target for therapeutical research on chondrocytes dedifferentiation, hence degradative cartilage diseases.

La cellule principale de l’os sous-chondral est l’ostéoblaste qui joue un rôle central dans la production qualitative et quantitative de la matrice ostéoïde. Plusieurs études montrent que le collagène de type I et la phosphatase alcaline sont des marqueurs précoces de la différenciation des ostéoblastes tandis que l’ostéocalcine (OCN) et la minéralisation sont des marqueurs des stades tardifs de cette différenciation. L’os sous-chondral est le site actif de nombreux changements morphologiques qui peuvent être différents au cours de l’arthrose (OA) mais qui sont partie prenante du processus pathologique. Ces changements consistent en une formation de la matrice osseuse importante associée une inhibition de la minéralisation. Ces phénomènes peuvent être reliés aux changements phénotypiques des ostéoblastes. La galectine-3 (gal-3) est un facteur inflammatoire qui a été détecté dans le tissu synovial et dans le liquide synovial lors d’inflammation d’OA. Des études antérieures ont montré que la gal-3 participait à la destruction du cartilage et inhibait fortement la production d’OCN par les ostéoblastes OA. Ces faits ont permis de suggérer que la gal-3 pouvait participer soit à l’initiation soit à la progression de l’arthrose. Peu d’études ont globalement été réalisées sur le rôle de la galectine-3 dans l’arthrose et encore moins sur le rôle de gal-3 sur les altérations de l’os sous-chondral.Dans ce contexte, ce travail de thèse a consisté à caractériser les ostéoblastes arthrosiques, puis investigué la modulation du phénotype des ostéoblastes arthrosiques par gal-3 en et enfin identifier les mécanismes cellulaires impliqués. D’une part, nous avons identifié deux populations ostéoblastes OA grâce à l’expression d’OCN. Dans les conditions basales, ces deux populations expriment de façon différentielle le TGF-ß1, Wnt5b et DKK2, ce qui suggère une différenciation et un phénotype hétérogènes des ostéoblastes chez les patients OA. D’autre part, nous confirmons le rôle délétère de la gal-3 dans l’articulation lors d’inflammation puisqu’elle stimule la production de collagénase 1 impliquée dans la dégradation osseuse. De plus, elle accentue la perturbation phénotypique des ostéoblastes qui produisent plus de leptine lors d’épisodes hypoxiques. Bien que plusieurs ligands membranaires puissent médier les effets de gal-3, 4F2hc semble jouer un rôle récurrent / Osteoblasts are the main cells in subchondral bone (SCB), which are responsible for the bone matrix production. Their differentiation can be evaluated by type I collagen and alkaline phosphatase in the early stage and by osteocalcin (OCN) and mineralization in the late stage. Alterations of SCB are essential episodes of osteoarthritis (OA) and are represented by a significant bone formation accompanied with abnormal hypomineralization. These changes in SCB are related to phenotypic modifications of osteoblasts. Galectin-3 (Gal-3) is an inflammatory factor markedly detected in the synovial tissue and synovial fluid during OA inflammation. Previous studies have demonstrated that gal-3 was deleterious for cartilage and inhibited the production of OCN in OA osteoblasts. These findings suggest that gal-3 can participate in either the initiation or progression of osteoarthritis. So far, a few studies have been conducted to explore the role of Gal-3 in OA and particularly related to SCB. In this context, the thesis has consisted to characterize OA osteoblasts, to investigate the modulation of the OA osteoblast phenotype by gal-3 and finally to identify the involved cellular mechanisms. We have identified two populations of OA osteoblasts according to the OCN expression. Under basal conditions, these two populations express TGF-ß1, Wnt5b and DKK2 differentially, suggesting various differentiation and heterogeneous phenotype of osteoblasts in OA patients. Moreover, we confirmed the deleterious role of gal-3 in the joint during inflammation since it stimulates the production of collagenase 1 involved in bone degradation. In addition, it emphasizes the disruption of phenotypic osteoblasts by producing more leptin during hypoxic episodes. Although several membrane ligands can mediate the effects of gal-3, 4F2hc seems to play a prominent role