No description available.

No description available.

Myotonic dystrophy (DM) is an autosomal dominant inherited multisystemic neuromuscular disease. The molecular mechanism for DM is mediated by toxic RNAs containing expanded repeat units. DMI is caused by a CTG repeat expansion in 3'-UTR of the DMPK gene while DM2 is caused by CCTG repeat in intronl of the ZNF9 gene. The molecular features of DM are formation of RNA foci, co-localisation of MBNL proteins with ribonuclear foci, splicing defects of a subset of pre-mRNAs with elevation ofCUGBPI in DMl. In order to develop therapy for DM, assays were designed based on the molecular characteristics of the disease to screen compounds. Two primary assays were based on disruption of nuclear foci and on correction of misregulated splicing involving intron2 CLCNI. The first part of this report deals with the development of a nuclear foci assay and splicing construct assay. Both assays were optimised in HTS and utilized in screens for molecules that clear nuclear foci from DM cells and correct misregulated splicing in intron2 of CLCNI respectively. High throughput screens of kinase and phosphatase inhibitor libraries using the nuclear foci assay and CLCNI splicing construct assay yielded two positive hits: protein kinase C inhibitors designated in the compound library as D8 (hypericin) and D9 (Ro-31-8220). The second part of this thesis deals with the confirmation of compound hits obtained from the primary screen. I examined two aspects: mutant DMPKtranscript entrapment in nucleus and splicing defects associated with the disease. A BpmJ restriction assay was used to test the effect of compounds on mutant DMPK transcripts showed that both D8 and D9 were unable to release the mutant transcript into the cytoplasm. D8 demonstrated efficacy in reversing spliceopathy in alternative splicing assays of JR, SERCAI MBNLI and MBNL2 while D9 did not have this effect except on MBNLI which showed a very minor efficacy.

Introduction: Neuromuscular disorders (NMDs) cause wasting and weakening of muscles. People affected by NMDs and their carers can experience a number of adverse psychosocial consequences, which can be exacerbated by the rare nature of many of these disorders. This makes access to medical information, timely diagnoses, supportive care and peer support difficult. Options for receiving peer support are increasing through the development of online support groups (OSGs) for people affected by NMDs. Aims: This thesis examined the role of a new OSG in facilitating online peer support for people affected by NMDs and their carers. This was carried out using two distinct, but inter-related, studies. The first study examined the various ways in which members used the message board facility. The second of these studies accessed members’ personal experiences of using this OSG. Methods: In order to examine how members used this new OSG, the first study involved an inductive thematic analysis of OSG message postings. Message postings from the first five months of this OSG’s existence (n=1,914) were analysed, so as to identify the main thematic content of members’ discussions. The second study accessed participants’ personal accounts of their OSG experiences. Semi-structured interviews were conducted with six OSG members and were analysed using Interpretative Phenomenological Analysis (IPA). This interview element examined the context through which members decided to use the group, factors that contributed to their continued use of the group, and the personal impact of participation. Results: The OSG message postings analysis demonstrated how members created a sense of community spirit by establishing common ground through disclosing personal information, searching for connections with people with similar illness experiences or interests, welcoming new members, and sharing aspirations for the development of a resourceful community. Experiences, emotional reactions and support were shared in relation to: delayed diagnosis; symptom interpretation; illness management and progression; and the sense of isolation incurred when managing a rare disorder. The board was also used to discuss societal and political issues pertaining to living with an NMD and methods of raising awareness of such conditions. The results of the interview study showed the valued connection that the OSG gave participants to similar others, in a friendly, non-pressurised environment. Members especially valued the reassurance of knowing that they were not alone in coping with their often-rare condition. The group provided participants with an understanding audience: a rare experience for a group whose condition is not widely known or understood. The information exchanged on the OSG was appreciated due to its specificity in dealing with NMDs. The board was also considered an important platform for raising awareness of NMD-related issues. The gratifying experience of helping other NMD sufferers was highlighted as a key theme. Participants also felt that the OSG was not without its limitations. Difficulties in relating to other people (because of varying disability levels, different disease progression histories, and different views on politics and other interests) influenced participants’ levels of interaction and the perceived benefits of the group. Less common concerns for the group – but important for some individuals – were privacy concerns in using a publicly accessible group and difficulty navigating through the message postings. Conclusions: This thesis provides a novel, in-depth insight into how people used a new OSG for NMDs, and the personal impact of participating in such a group. Analyses of message posting and interview data highlight the vital psychosocial support provided by the OSG, especially given the rarity of many of these conditions. However, it was found that some obstacles to support are inherent in the OSG itself, tempering assessments of the impact of its use.

Σκοπός: Σήμερα η θυμεκτομή αποτελεί ευρέως αποδεκτή θεραπευτική μέθοδο για τη βαρεία μυασθένεια (ΒΜ). Επιπλέον η απόπτωση πιστεύεται ότι διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη της ΒΜ. Ο σκοπός αυτής της εργασίας ήταν η μελέτη της έκφρασης των δεικτών bcl-2, bcl-x, bax, Fas, Fasl (αποπτωτικές ογκοπρωτεϊνες), PCNA και Ki67 (δείκτες κυτταρικού πολλαπλασιασμού) και p53 (ογκοκατασταλτικό γονίδιο) σε παρασκευάσματα θυμεκτομών από ασθενείς με ΒΜ, και η συσχέτιση αυτής της έκφρασης με κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους και την κλινική κατάσταση των ασθενών μετά τη θυμεκτομή. Ασθενείς και Μέθοδοι: Η μελέτη περιέλαβε 46 ασθενείς (17 άνδρες και 29 γυναίκες με μέση ηλικία 36.60±16.09 έτη) με ΒΜ, οι οποίοι υπεβλήθησαν σε τροποποιημένη ριζική θυμεκτομή. Η κλινική σταδιοποίηση (ταξινόμηση κατά Osserman) πριν τη θυμεκτομή έδειξε ότι 5 ασθενείς ήταν σταδίου Ι, 21 ΙΙΑ, 17 ΙΙΒ και 3 σταδίου ΙΙΙ. Η ιστοπαθολογική εξέταση του θύμου έδειξε την παρουσία υπερπλασίας σε 26 περιπτώσεις, ατροφίας σε 8, θυμώματος σε 9 και θυμικού καρκινώματος σε 3 περιπτώσεις. Σε τομές παραφίνης, εφαρμόσθηκαν α) η ανοσοϊστοχημική μέθοδος στρεπταβιδίνης-βιοτίνης περοξειδάσης για τα αντισώματα εναντίον των bcl-2, bax, bcl-x, Fas, Fasl, PCNA, Ki67 και p53, β) η μέθοδος in situ υβριδισμού με ιχνηθέτες σημασμένους με διγοξιγενίνη για τους δείκτες bcl-2, bax, bcl-x, Fas και Fasl και γ) η μέθοδος in situ υβριδισμού TUNEL για την εκτίμηση του αποπτωτικού δείκτη (ΔΑΣ). Τα αποτελέσματα εκφράσθηκαν μετά από μορφομετρική ανάλυση και συσχετίσθηκαν με τις κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους. Η αναλογία bax/bcl-2 (στα επίπεδα mRNA και πρωτεϊνης) καθορίσθηκε για κάθε δείγμα, διαιρώντας τα %bax (+) κύτταρα με τα % bcl-2 (+) κύτταρα. Η κλινική κατάσταση των ασθενών αξιολογήθηκε σε χρονικό διάστημα 39-166 (διάμεσος 86) μηνών μετά τη θυμεκτομή. Κατά τη στιγμή της αξιολόγησης και σύμφωνα με διεθνή κριτήρια (Jaretzki A, et al, Neurology 55:16, 2000) οι ασθενείς διαχωρίστηκαν ως εξής: ομάδα Α: πλήρης σταθερή ύφεση, ομάδα B: φαρμακολογική ύφεση+ελάχιστες εκδλώσεις+βελτίωση+επιδείνωση. Αποτελέσματα: Η αξιολόγηση της κλινικής κατάστασης ήταν δυνατή σε 39/46 ασθενείς. Σύμφωνα με τα προαναφερθέντα κριτήρια 13/39 ασθενείς ανήκαν στην ομάδα Α και 26/39 στην ομάδα B. Η ανάλυση απλής μεταβλητής απεκάλυψε ότι οι κλινικοί παράγοντες που σχετίζονται με πιο συχνή εμφάνιση πλήρους σταθερής ύφεσης είναι: η νεαρότερη ηλικία των ασθενών κατά τη θυμεκτομή, ο μικρότερος χρόνος που μεσολαβεί μεταξύ της έναρξης των συμπτωμάτων της νόσου και της θυμεκτομής (μικρότερος του έτους) και το ηπιότερο στάδιο της νόσου (Ι και ΙΙΑ vs. ΙΙΒ+ΙΙΙ). Όμως η ανάλυση κατά Cox απεκάλυψε ότι μόνο ο μικρότερος χρόνος που μεσολαβεί μεταξύ της έναρξης των συμπτωμάτων της νόσου και της θυμεκτομής (μικρότερος του έτους) και το ηπιότερο στάδιο της νόσου (Ι και ΙΙΑ vs. ΙΙΒ+ΙΙΙ) αποτελούν ανεξάρτητους προγνωστικούς παράγοντες (95% CI:0.043-6.50, p=0.01 και 95% CI:1.023-4.529, p=0.043, αντιστοίχως). Η έκφραση του bcl-2 ήταν υψηλότερη στις περιπτώσεις υπερπλασίας και θυμώματος σε σχέση με τα θυμικά καρκινώματα (p<0.001). Υψηλότερη έκφραση στα καρκινώματα σε σύγκριση με τα θυμώματα και τις περιπτώσεις υπερπλασίας κατεγράφη για τους δείκτες bax (p<0.001), PCNA, Ki67 (p<0.001), Fas, Fasl, p53 και ΔΑΣ (p<0.001). Επιπροσθέτως, αυτοί οι δείκτες εμφάνισαν υψηλότερη έκφραση προς τα βαρύτερα στάδια της νόσου. Η έκφραση του bcl-x δεν έδειξε καμία συσχέτιση με τα ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά του θύμου ή τα χαρακτηριστικά της ΒΜ. Η αναλογία bax/bcl-2 (στο επίπεδο mRNA και πρωτεΐνης) ήταν αυξημένη προς τα βαρύτερα στάδια της νόσου (+370% για το mRNA και +391% για την πρωτεΐνη, από το στάδιο I προς το στάδιο III). Όλες οι 13 περιπτώσεις της ομάδας Α είχαν αναλογία bax/bcl-2 <1, ενώ όλες οι 26 περιπτώσεις της ομάδας Β είχαν αναλογία >1. Η στατιστική ανάλυση απεκάλυψε: A) θετική συσχέτιση των bax(+) κυττάρων με το στάδιο της ΒΜ (p<0.001), του ΔΑΣ και των %Ki67(+) κυττάρων με το στάδιο της ΒΜ (p<0.001, αντίστοιχα), %Ki67(+) και %bax(+) κυττάρων με τον ΔΑΣ(p<0.05), %p53(+) και %bax(+) κυττάρων (p<0.05), και B) ανάστροφη συσχέτιση μεταξύ των %bcl-2(+) κυττάρων και του σταδίου της ΒΜ (p<0.05). Οι καμπύλες επιβίωσης Kaplan Meier έδειξαν υψηλότερο διάστημα ελεύθερο νόσου, στην ομάδα A (p<0.01). Η ανάλυση κατά Cox απεκάλυψε ότι η τιμή της αναλογίας bax/bcl-2 αποτελεί ανεξάρτητο προγνωστικό παράγοντα (95% CI:1.078-44.073, p=0.041). Συμπεράσματα: Η παρούσα μελέτη δείχνει ότι α) ασθενείς με βαρεία μυασθένεια που υπέστησαν τροποποιημένη μεγίστη θυμεκτομή εμφάνισαν σε υψηλό ποσοστό (95%) βελτίωση των συμπτωμάτων της νόσου μετά την επέμβαση, και β) η κλινική έκβαση των μυασθενικών ασθενών μετά την μεγίστη τροποποιημένη θυμεκτομή εξαρτάται από κλινικούς και μοριακούς παράγοντες. Σε αυτή τη μελέτη, η έκφραση των διαφόρων μοριακών δεικτών (bcl-2, bax, bcl-x, PCNA, Ki67, p53) και του αποπτωτικού δείκτη συσχετίσθηκε θετικά ή αρνητικά με τα μικροσκοπικά ευρήματα του θύμου. Αυξημένος βαθμός απόπτωσης και κυτταρικού πολλαπλασιασμού συνοδεύει τα βαρύτερα στάδια της νόσου. Η ανάλυση κατά Cox απεκάλυψε ότι ανεξάρτητοι προγνωστικοί παράγοντες για την κλινική κατάσταση των ασθενών μετά τη θυμεκτομή, είναι το μικρότερο χρονικό διάστημα μεταξύ έναρξης της νόσου και θυμεκτομής, το ηπιότερο στάδιο και η τιμή της αναλογίας bax/bcl-2 <1. Επιπλέον έρευνα χρειάζεται, η οποία θα έχει ως στόχο να καταδείξει εκείνους τους συγκεκριμένους δείκτες οι οποίοι θα παρέχουν με ασφάλεια πληροφορίες για τα μακρόχρονα αποτελέσματα της χειρουργικής θεραπείας στη μυασθένεια. / Objective: Today thymectomy is a widely accepted therapeutic option for myasthenia gravis (MG). On the other hand apoptosis seems to play a significant role in progress of MG. The aim of this study was to evaluate bcl-2, bcl-x, bax, Fas, Fasl (apoptotic oncoproteins), PCNA and Ki67 (cell proliferation markers) and p53 (tumor suppressor gene) expression in thymus from patients with myasthenia gravis (MG) and to determine the potential correlation with clinicopathologic parameters and the clinical response after thymectomy. Patients and Methods: The study included 46 patients (17 males, 29 females; mean age 36.60±16.09 years) with MG who underwent modified maximal thymectomy. Clinical staging (Osserman classification) included stage I in five, IIA in 21, IIB in 17 and III in three. Microscopic examination of thymus showed thymic hyperplasia in 26, atrophy in eight, thymoma in nine and thymic carcinoma in three cases. On paraffin sections, the streptavidin–biotin technique, using antibodies to bcl-2, bax, bcl-x, Fas, Fasl, PCNA, Ki67 and p53, was employed, and in situ hybridization with digoxigenin-labeled probes to bcl-2, bax, bcl-x, Fas and Fasl was performed. In addition, the apoptotic body index (ABI) was assessed via the TUNEL method. Staining results were expressed following morphometric analysis and were correlated with clinicopathologic parameters. Bax to bcl-2 mRNA and protein ratio was determined for each sample by dividing %bax (+) cells by % bcl-2 (+) cells. Patients were followed up for 39-166 (median 86) months. At the end of the follow-up period, according to standard criteria (Jaretzki A, et al, Neurology 55:16, 2000) patients were classified as follows: group A: complete stable remission, group B: pharmacological remission+minimal manifestations+ improvement, deterioration. Results: Follow-up data were available on 39/46 patients. According to the aforementioned criteria 13/39 patients belonged to group A and 26/39 to group B. ANOVA test revealed that the clinical factors correlated with more frequent development of complete stable remission were: the younger age of the patients, the shorter interval time between disease onset and thymectomy (less than a year) and the earlier stage (Ι και ΙΙΑ vs. ΙΙΒ+ΙΙΙ) of the disease. However Cox regression analysis revealed that only the shorter interval time between disease onset and thymectomy (less than a year) and the earlier stage (Ι και ΙΙΑ vs. ΙΙΒ+ΙΙΙ) of the disease constitute independent prognostic factors (95% CI:0.043-6.50, p=0.01 and 95% CI:1.023-4.529, p=0.043, respectively). Bcl-2 expression was higher in hyperplasia and thymoma cases, compared to thymic carcinomas (p<0.001). Higher expression in carcinomas, compared to hyperplasia and thymomas, was observed for bax (p<0.001), PCNA, Ki67 (p<0.001), Fas, Fasl, p53 and ABI (p<0.001). In addition these markers exhibited higher expression towards advanced stages of the disease. Bcl-x expression did not show any correlation with thymus pathology or MG features. The bax/bcl-2 mRNA and protein ratios were increased towards advanced disease stages (+370% for mRNA and +391% for protein, from MG stage I to stage III). All the 13 cases of group A had a bax/bcl-2 ratio<1, whereas all the 26 cases of group B had a ratio>1.Statistical analysis demonstrated: A) positive correlation of bax(+) cells with MG stage (p<0.001), ABI and %Ki67(+) cells with MG stage (p<0.001, respectively), %Ki67(+) and %bax(+) cells with ABI (p<0.05), %p53(+) and %bax(+) cells (p<0.05), and B) reverse correlation between %bcl-2(+) cells and MG stage (p<0.05). The Kaplan Meier survival curve showed higher percentage of complete stable remission in group A (p<0.01). Cox regression analysis revealed that the bax/bcl-2 ratio constituted independent prognostic factor (95% CI:1.078-44.073, p=0.041). Conclusions: This study shows a) that patients with MG who underwent modified maximal thymectomy for treatment developed improvement in 95% of the cases and b) that the prognosis of these patients depends on clinical and molecular factors. The expression of the several molecular markers included in this study (bcl-2, bax, bcl-x, PCNA, Ki67, p53) and the apoptotic index correlates positively or reversibly with the microscopic findings of thymus. Increased apoptosis and proliferation accompany advanced disease stage. Cox regression revealed that independent prognostic factors for therapeutic response after thymectomy are the shorter time interval between disease onset and thymectomy, the earlier stage and the bax/bcl-2 ratio<1. More extensive studies are needed in order to use these markers in the design and selection of the proper therapeutic modality in such cases.

Το υλικό της μελέτης μας περιλαμβάνει 120 πάσχοντες από βαριά μυασθένεια που μελετήθηκαν και παρακολουθήθηκαν από το 1977-2000. Η διάγνωση της νόσου στηρίχτηκε στην κλινική σημειολογία, τις φαρμακολογικές δοκιμασίες, την ηλεκτροφυσιολογική μελέτη και τη μέτρηση των αντισωμάτων κατά των υποδοχέων της ακετυλοχολίνης. Η σταδιοποίησή της νόσου έγινε με την κλίμακα του Οsser man. Στόχος της μελέτης πέραν της καταγραφής των δημογραφικών στοιχείων της νόσου στον Ελλαδικό χώρο ήταν η αξιολόγηση της ευαισθησίας των χρησιμοποιουμένων διαγνωστικών μέσων και της αποτελεσματικότητας της φαρμακευτικής αγωγής και της θυμεκτομής. Οι γυναίκες συγκριτικά με τους άνδρες υπερείχαν αριθμητικά (σχέση 2:1) και προσβλήθηκαν σε μικρότερη ηλικία (41 ± 18 έτη έναντι 47,7 ± 17,1 έτη ).Σε ότι αφορά τη βαρύτητα της νόσου υπερείχε σαφώς στις γυναίκες που κατά την έναρξη ανήκαν κατά 85% στη βαρύτερη γενικευμένη μορφή της νόσου έναντι του 51% των ανδρών. Από τους 120 ασθενείς, οι 64 αντιμετωπίσθηκαν συντηρητικά με φάρμακα ενώ οι 56 υπεβλήθησαν και σε θυμεκτομή. Η φαρμακευτική αγωγή περιέλαβε πυριδοστιγμίνη, πρεδνιζολόνη, azathioprine σε μονοθεραπεία ή σε συνδυασμό των ανωτέρω με ικανοποιητική ανταπόκριση στον έλεγχο της συμπτωματολογίας . πλασμαφαίρεση έγινε σε περιορισμένο αριθμό βαριών περιπτώσεων της νόσου που δεν ανταποκρίθηκαν στην ανωτέρω αγωγή. Η θυμεκτομή έγινε κατά κύριο λόγο με εκτεταμένη διαστερνική προσπέλαση με τα ισχύοντα διεθνώς κριτήρια δηλαδή στο πρώιμο στάδιο της νόσου και στη γενικευμένη κυρίως μορφή της. Οι ασθενείς παρακολουθήθηκαν από 1 μέχρι και 23 χρόνια και έγινε συστηματική προσπάθεια συγκριτικής αξιολόγησης της αποτελεσματικότητας της συντηρητικής θεραπείας και της θυμεκτομής. Η θυμεκτομή, παρ, ότι δεν διαπιστώθηκε στο υλικό μας στατιστικώς σημαντική υπεροχή της έναντι της συντηρητικής αγωγής εξακολουθεί να συμβάλλει στην αντιμετώπιση της νόσου .αναμένεται ωστόσο η σύγχρονη έρευνα να απαντήσει στο κρίσιμο ερώτημα της επιλογής του κατάλληλου χρόνου και των κατάλληλων για την επέμβαση περιπτώσεων λαμβανομένου πάντα υπόψιν του όποιου θετικού αποτελέσματος της συγχορηγούμενης φαρμακευτικής αγωγής. / The purpose of this study is to evaluate the epidemiological data of our 120 patients and to estimate the benefit of the pharmaceutical therapy and the effect of the thymectomy in our myasthenic patients.Our survey is a retrospective one (1977-2000) including 120 patients with myasthenia gravis who have been followed in the Neurological clinic of Patras University . The diagnosis was based on clinical aspects, pharmacological tests (prostigmine and Tensilon ), electrophysiological study (Desmedt),acetylcholine receptor antibodies titer, and CT scan of the mediastinum. All myasthenic patients have been classificated according to the Osserman scale. The male/female ratio was 2:1.The mean age at diagnosis time was 41,1+_18 years for females and 47,7+_1,7 for males.The prostigmine test was positive in 86.4% of patients with the ophthalmic type of the disease and in 91.4%of patients with the generalized form. The Tensilon test was positive in the 80% of patients with the ophthalmic form and in all patients with generalized form. 60.7% of patientswith ophthalmic form and 83.3% of patients with the generalized form had positive Desmedt test while 33.3% of patients with the opthalmic form and 72.5% with the generalized form had an abnormal acetylcholine receptor antibody titer. CT of the mediastinum was positive for 32% of our patients. All patients received drug treatment and 56 of them have been additionally thymectomised. The first choise of drug therapy have been anticholinesteracic remedies and in cases of therapy failure immunosupressants (prezolon, azathioprin) were added. 20-47.6% of our patients were given anticholinesteracic drugs while some 20-60.75% were given additionally prednizolone. Azathioprine was added in case that prednizolone was ineffective or patients experienced major adverse effects. Plasmaferesis was performed in a small number of our patients. Thymectomy was performed in 56 (46.4%) patients. 42 (75%) of them were males and 14 (25%) females.Thymectomy was performed mainly in the patients with the generalized type of the disease.Only 5 patient had the ophthalmic form of the disease. the rest suffered of the generalized myasthenia. Thymectomy is still a tool in management of myasthenia gravis.However in our study a benefit of thymectomy 83 compared to drug therapy does not seem to reach stastistical significance. This is in accordance with the majority of recent publications.

Σκοποί της εργασίας ήταν η επιδημιολογική μελέτη της MuSK-MG (μυασθένεια με αντι-MuSK αντισώματα) στην Ελλάδα, ο προσδιορισμός των υποτάξεων των IgG αυτοαντισωμάτων της MuSK-MG, η επίδραση της χορήγησης 4 MuSK-MG ορών στον AChR (υποδοχέα ακετυλοχολίνης) των κυττάρων της μυϊκής κυτταρικής σειράς ΤΕ671 και ο προσδιορισμός των ανοσογόνων επιτόπων της MuSK. Η επιδημιολογική μελέτη της MuSK-MG έλαβε χώρα μεταξύ 1 Ιανουαρίου 1986 και 30 Ιουνίου 2006 κι αφορούσε σε 33 ασθενείς. Ο προσδιορισμός των υποτάξεων των IgG αυτοαντισωμάτων πραγματοποιήθηκε με ραδιοανοσοκατακρήμνιση στους ορούς 14 ασθενών. Ο προσδιορισμός των ανοσογόνων επιτόπων της MuSK πραγματοποιήθηκε συνθέτοντας το εξωκυτταρικό κομμάτι της MuSK με τη μέθοδο Geysen της σύνθεσης πεπτιδίων σε στερεά φάση κι ελέγχοντας, στη συνέχεια, με τη μέθοδο ELISA, τη δέσμευση μιας σειράς MuSK-MG ορών στο τμήμα της MuSK που συνθέσαμε. Η μέση ετήσια επίπτωση της MuSK-MG στην Ελλάδα ήταν 0,32 ασθενείς/εκατομμύριο πληθυσμού/έτος. Στις γυναίκες, η έναρξη της MuSK-MG εμφανίστηκε μετά τα 30, ενώ, στους άνδρες, η νόσος εμφανίζεται σε κάθε δεκαετία. Οι περισσότεροι ασθενείς εμφάνισαν συμπτώματα από τους προσωπικούς κι αυχενικούς μύες. Η συντριπτική πλειονότητα των αυτοαντισωμάτων της MuSK-MG ήταν IgG4 υποτάξης. Σχετικά με την επίδραση των 4 MuSK-MG ορών στον AChR, οι οροί αυτοί ήταν ανίκανοι στην πρόκληση αποδόμησης του AChR των κυττάρων. Τέλος, δεν κατέστη δυνατός ο προσδιορισμός των ανοσογόνων επιτόπων της MuSK, αφού υπήρχαν αμινοξικές αλληλουχίες, στις οποίες ο αρνητικός μάρτυρας του πειράματος δεσμευόταν ισχυρότερα σε σχέση με τους MuSK-MG ορούς που δοκιμάσαμε. / The purposes of this study were to determine the epidemiological characteristics of muscle-specific kinase-myasthenia gravis (MuSK-MG) in Greece, the IgG subclass of the anti-MuSK antibodies, the effect of 4 MuSK-MG sera on the AChR of the cells of muscle cell line TE671 and the immunodominant epitopes of MuSK. This population-based study was performed on MuSK-MG patients in Greece between 1 January 1986 and 30 June 2006. Epidemiological and clinical data for 33 patients were collected. In addition, the distribution of anti-MuSK IgG autoantibody subclasses in the sera of 14 patients was determined by immunoprecipitation. The determination of the immunodominant epitopes on MuSK was performed by synthesizing the extracellular part of MuSK via Geysen method of peptide synthesis. Then, we performed ELISA method in order to determine the epitopes. The average annual incidence was 0.32 patients/million population/year. In females, onset of MuSK-MG occurred after the age of 30, whilst, in males, the disease appears in any decade. Most patients presented with involvement of the facial and bulbar muscles. The vast majority of anti-MuSK antibodies were IgG4. As far as the the effect of 4 MuSK-MG sera on the AChR of the cells is concerned, these sera were incapable of destroying the AChR effectively. Finally, we did not determine the immunodominant epitopes on MuSK, as there were amino acid sequences on which the negative control was bound with greater affinity than the MuSK-MG sera we tested.

Η μυασθένεια gravis (Myasthenia gravis, MG) είναι μία αυτοάνοση νόσος η οποία επηρεάζει την ομαλή λειτουργία της νευρομυϊκής σύναψης. Το μεγαλύτερο ποσοστό των ασθενών (80-85%) εμφανίζουν αντισώματα έναντι του μυϊκού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης (AChR), ενώ 5-7% των ασθενών εμφανίζουν αντισώματα έναντι της ειδικής κινάσης μυϊκής (MuSK). Η MuSK είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη της νευρομυϊκής σύναψης αλλά επίσης, εκφράζεται και στην ώριμη νευρομυϊκή σύναψη όπου εμπλέκεται, μέσω της αγρίνης, στην αγκυροβόληση των υποδοχέων της ακετυλοχολίνης στη μεμβράνη. Η MuSK αποτελείται από μια εξωκυτταρική περιοχή (ECD), η οποία περιέχει τρεις περιοχές τύπου–ανοσοσφαιρίνης (Ig-like) και μια περιοχή πλούσια σε κυστεΐνες (Fz), μια διαμεμβρανική και μία κυτταροπλασματική περιοχή η οποία περιέχει την καταλυτική περιοχή της κινάσης. Οι θεραπευτικές προσεγγίσεις για τη μυασθένεια είναι μη ειδικές και περιλαμβάνουν τη χορήγηση ουσιών που αναστέλλουν τη δράση της ακετυλοχολινεστεράσης, ανοσοκατασταλτικών και ανοσορυθμιστικών φαρμάκων, ενδοφλέβιων ανοσοσφαιρινών καθώς και την πλασμαφαίρεση. Ωστόσο, η ανοσοκαταστολή συχνά συνδέεται με σοβαρές παρενέργειες ενώ κατά τη χορήγηση ενδοφλέβιων ανοσοσφαιρινών, η πιθανότητα μετάγγισης άγνωστων μέχρι στιγμής μολυσματικών παραγόντων δεν μπορεί να αποκλειστεί. Επιπλέον, σε καμία από τις παραπάνω θεραπευτικές προσεγγίσεις δεν στοχεύονται επιλεκτικά τα αντισώματα και ταυτόχρονα συνοδεύονται από υψηλό κόστος εφαρμογής και περιορισμένη διαθεσιμότητα. Μια υποσχόμενη αντιγονοειδική θεραπευτική προσέγγιση για την MuSK μυασθένεια αποτελεί η μέθοδος της ανοσοπροσρόφησης. Η βασική αρχή αυτή της προσέγγισης έγκειται στην ακινητοποίηση της εξωκυτταρικής περιοχής της MuSK ως ανοσοπροσροφητή σε ένα σταθερό υπόστρωμα, κατασκευάζοντας έτσι ανοσοπροσροφητικές στήλες οι οποίες θα αφαιρούν από τον ορό του ασθενούς μόνο τα MuSK αντισώματα. Η παρούσα εργασία, είχε ως στόχο την έκφραση και το χαρακτηρισμό της εξωκυτταρικής περιοχής της MuSK σε διάφορα συστήματα έκφρασης στοχεύοντας στη δημιουργία ενός ανοσοπροσροφητή ο οποίος παράγεται σε μεγάλες ποσότητες αλλά και σε μία διαμόρφωση η οποία είναι ικανή να αναγνωρίζεται από την πλειονότητα των MuSK αντισωμάτων. Με σκοπό τη δημιουργία κατάλληλων ανοσοπροσροφητών εκφράστηκαν δύο διαφορετικές πρωτεΐνες, όπου η μία αποτελείται από ολόκληρο το εξωκυτταρικό τμήμα της MuSK (MuSK-ECDf) ενώ η άλλη είναι μικρότερη αφού υπολείπεται την περιοχή πλούσια σε κυστεΐνες (MuSK-ECDΔFz). Οι προσπάθειες στα συστήματα έκφρασης COS-7, HEK293 και E.coli απέβησαν άκαρπες αφού είτε οι πρωτεΐνες δεν εκφράστηκαν στη σωστή διαμόρφωση ή δεν αποδείχθηκαν κατάλληλοι ανοσοπροσροφητές. Και οι δύο πρωτεΐνες εκφράστηκαν επιτυχώς στο ετερόλογο σύστημα P. pastoris σε διαλυτή μορφή και σε ικανοποιητικά επίπεδα έκφρασης με την MuSK-ECDf πρωτεΐνη να εμφανίζει καλύτερα επίπεδα έκφρασης. Μετά τον καθαρισμό των δύο πρωτεϊνών με χρωματογραφίες συγγένειας και μοριακής διήθησης, οι πρωτεΐνες ακινητοποιήθηκαν σε υπόστρωμα σεφαρόζης και ακολούθησε ο χαρακτηρισμός τους ως ανοσοπροσροφητές. Και οι δύο ανοσοπροσροφητές έχουν τη δυνατότητα να αφαιρούν την πλειονότητα των MuSK αντισωμάτων από τον ορό των MuSK-μυασθενών με τον MuSK-ECDΔFz ανοσοπροσροφητή να εμφανίζει μικρότερη ικανότητα πρόσδεσης αντισωμάτων σε ορισμένους ορούς. Ο χαρακτηρισμός των δύο ανοσοπροσροφητών έδειξε ότι και οι δύο είναι ειδικοί για τα MuSK αντισώματα, μπορούν να αφαιρούν μεγάλες ποσότητες MuSK αντισωμάτων από τον ορό MuSK-μυασθενών, μπορούν να επαναχρησιμοποιηθούν, να αποθηκευτούν για μεγάλο χρονικό διάστημα και επίσης, παραμένουν σταθεροί στο υπόστρωμα σεφαρόζης κατά τη διάρκεια της ανοσοπροσρόφησης. Όι παραπάνω παράμετροι μπορούν να οδηγήσουν σε μία θεραπευτική προσέγγιση με χαμηλό κόστος για τον ασθενή αλλά ιδιαίτερα αποτελεσματική ως προς την αφαίρεση μόνο των παθογόνων MuSK αντισωμάτων. Στη συνέχεια, ακολούθησαν πειράματα χρησιμοποιώντας ζώα εργαστηρίου στα οποία φάνηκε ότι τα πειράματα ανοσοπροσρόφησης με τον MuSK-ECDf ανοσοπροσροφητή δεν εμφανίζουν καμία τοξική επίδραση σε κουνέλια. Επίσης, με πειράματα παθητικής μεταφοράς σε ποντίκια αποδείχθηκε η αποτελεσματικότητα των ανοσοπροσροφητικών στηλών να αφαιρούν τα MuSK αντισώματα από τον ορό των MuSK-μυασθενών όπως επίσης και η παθογονικότητα των απομονωμένων MuSK αντισωμάτων. Όλα τα παραπάνω αποτελέσματα καθιστούν εφικτή την ανάπτυξη μίας νέας θεραπευτικής προσέγγισης για τη MuSK μυασθένεια με χαμηλό κόστος για τον ασθενή και με το πλεονέκτημα της επιλεκτικής αφαίρεσης των MuSK αντισωμάτων από τον ορό. / Myasthenia gravis (MG) is an antibody-mediated autoimmune disease that affects the neuromuscular junction (NMJ). About 85% of MG patients have antibodies against the muscle nicotinic acetylcholine receptor (AChR), while about 5-7% of patients have antibodies against the muscle specific kinase (MuSK). MuSK is important during the development of the NMJ and it is also expressed at the mature NMJ, where it mediates the agrin-induced clustering of AChRs. MuSK is a transmembrane protein which consists of an extracellular region, a transmembrane domain and an intracellular, tyrosine kinase, catalytic domain. The extracellular domain (ECD) consists of three immunoglobulin–like (Ig) domains and a cysteine-rich domain (CRD). Current treatments of MG, such as cholinesterase inhibitors, immunosuppressive agents, intravenous immunoglobulin, thymectomy and plasmapheresis, are non specific, causing several side effects such as the removal of indispensable plasma components observed by plasmapheresis. We aim to develop an antigen-specific therapy in which only MuSK antibodies will be removed from patients’ sera using the immobilized MuSK-ECD as immunoadsorbent. Furthermore, the above treatments are not specific for the removal of the pathogenic antibodies and also, they have high cost and limited availability for the patients. The selective removal of MuSK antibodies from the blood of MuSK-MG patients with an extracorporeal technique similar to plasmapheresis could be a therapeutic option. The method is based on the immobilization of the extracellular domain (ECD) of MuSK as immunoabsorbent in an appropriate substrate for the construction of immunoadsorption columns which remove the MuSK antibodies from the MuSK-MG sera. The purpose of the current project was the expression of the ECD of MuSK in different expression systems in high amounts with appropriate conformation for the recognition of the majority of the MuSK antibodies and their use as immunoabsorbents. For the development of the appropriate immunoabsorbents, two different proteins were expressed; the one consisted of the whole ECD of MuSK (MuSK-ECDf) and the other was smaller because of the lack of the cysteine-rich region (MuSK-ECDΔFz). All efforts for protein expression in COS-7, HEK293 and E. coli were not successful because either the expression proteins were not in appropriate conformation or they worked not efficiently as immunoabsorbents. However, both proteins were expressed successfully in the heterologous system P. pastoris as secreted soluble proteins with satisfactory expression yields and much higher expression yield of MuSK-ECDΔFz than that of MuSK-ECDf. After the protein purification using metal affinity and gel filtration chromatography, the proteins were immobilized on CNBr activated sepharose beads and characterized as immunoabsorbents. Both immunoabsorbents remove effectively the majority of the MuSK antibodies from MG patients’ sera with the MuSK-ECDΔFz immunoadsorbent to show lower binding affinity in some sera. Further, both immunoaborbents are specific for the MuSK antibodies, show high binding capacity, are recyclable, can be stored effectively and are stable during the immunoadsorption. Furthermore, animal experiments showed that the ex-vivo clearance of plasma with the immobilized MuSK-ECDf had no toxic effects in rabbits. Finally, passive transfer experiments in mice showed the effectiveness of the immunoadsorption columns regarding the removal of the MuSK antibodies from patients’ sera and also, the pathogenicity of the removed MuSK antibodies. In conclusion, the above results are expected to lead to a therapeutic approach using the MuSK-ECD as specific immunoadsorbent for the ex vivo clearance of the MuSK-MG plasma and in parallel with a small cost for the patient.

Οι νικοτινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης, μέλη της υπερ-οικογένειας των ιοντικών διαύλων ενεργοποιούμενων από προσδέτη, είναι διαμεμβρανικές γλυκοπρωτεΐνες μεγέθους ~290 kDa. Ανάλογα με την τοπολογία και τα φαρμακολογικά τους χαρακτηριστικά οι νικοτινικοί υποδοχείς διακρίνονται σε νευρικούς και μυϊκούς υποδοχείς. Οι νευρικοί υποδοχείς εκφράζονται κυρίως στα περιφερειακά γάγγλια και σε συγκεκριμένα τμήματα του εγκεφάλου, καθώς και σε μη νευρικούς ιστούς όπως είναι τα επιθηλιακά κύτταρα και τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος. Οι μυϊκοί υποδοχείς απαντώνται στις μετασυναπτικές μεμβράνες των νευρομυϊκών συνάψεων των σπονδυλωτών, όπου ενέχονται στη διαβίβαση της νευρικής ώσης στους μυς και στα ηλεκτρικά όργανα ορισμένων ψαριών. Επιπλέον από το φυσιολογικό του ρόλο, ο μυϊκός υποδοχέας της ακετυλοχολίνης αποτελεί στόχο για πολλά κληρονομικά και επίκτητα νοσήματα, με σημαντικότερο και καλύτερα μελετημένο το αυτοάνοσο νόσημα μυασθένεια. Στο μεγαλύτερο ποσοστό των ασθενών με μυασθένεια (~80%) ανιχνεύονται στο ορό αυτοαντισώματα έναντι του μυϊκού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης (αντί-υποδοχέα αντισώματα) τα οποία οδηγούν στην ελάττωση των διαθέσιμων λειτουργικών υποδοχέων στη νευρομυϊκή σύναψη. Η μείωση του αριθμού των υποδοχέων προκαλεί αδυναμία δέσμευσης της ακετυλοχολίνης από τη μετασυναπτική μεμβράνη, αναστολή της σύσπασης του μυ και εκδήλωση μυϊκής κόπωσης και αδυναμίας, συμπτώματα χαρακτηριστικά της μυασθένειας. Οι υποδοχείς της μετασυναπτικής μεμβράνης δύνανται να ελαττωθούν μέσω δράσης του συμπληρώματος, αντιγονικής τροποποίησης ή λειτουργικής παρεμπόδισης. Οι σύγχρονες θεραπευτικές προσεγγίσεις για τη μυασθένεια είναι μη ειδικές και περιλαμβάνουν τη χορήγηση ουσιών που αναστέλλουν τη δράση της ακετυλοχολινεστεράσης, ανοσοκατασταλτικών και ανοσορυθμιστικών φαρμάκων, ενδοφλέβιων ανοσοσφαιρινών καθώς και την πλασμαφαίρεση. Μια υποσχόμενη αντιγονοειδική θεραπευτική προσέγγιση για την μυασθένεια αποτελεί η μέθοδος της αναοσοπροσρόφησης. Η βασική αρχή αυτή της προσέγγισης έγκειται στην ακινητοποίηση των υπομονάδων του μυϊκού υποδοχέα ως ανοσοπροσροφητών σε ένα σταθερό υπόστρωμα, κατασκευάζοντας έτσι ανοσοπροσροφητικές στήλες. Για την προσέγγιση αυτή απαραίτητη είναι η απόκτηση ενός ανοσοπροσροφητή με διαμόρφωση που να προσομοιάζει αυτή του αντιγόνου-στόχου. Ωστόσο, η απόκτηση μεγάλων ποσοτήτων του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης καθίσταται εξαιρετικά δύσκολη εξαιτίας του μεγάλου μεγέθους του, του υδρόφοβου χαρακτήρα του και της αδυναμίας απομόνωσης του σε μεγάλες ποσότητες από φυσικές πηγές. Για τους λόγους αυτούς, η έρευνα προσανατολίζεται στην μελέτη των εξωκυτταρικών περιοχών (ΕΚΠ) του ανθρώπινου νικοτινικού υποδοχέα στις οποίες προσδένεται η πλειονότητα των αυτοαντισωμάτων των μυασθενών. Η καθήλωση ανασυνδυασμένων ΕΚΠ των υπομονάδων α1, β, γ, δ και ε του υποδοχέα ως ανοσοπροσροφητών εκφρασμένων στο ετερόλογο σύστημα Pichia pastoris είχε περιγραφεί και προηγουμένως από το εργαστήριό μας. Ωστόσο, αν και η χρήση των πρωτεϊνών αυτών ως ανοσοπροσροφητών κατάφερε την αφαίρεση ενός ποσοστού αυτοαντισωμάτων από ορούς μυασθενών, δεν επετεύχθη η ικανοποιητική απομάκρυνσή τους. Η παρούσα εργασία, είχε ως στόχο την έκφραση και το χαρακτηρισμό των συνδεδεμένων ΕΚΠ των υπομονάδων α1, β, γ ή ε και δ του μυϊκού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης στο σύστημα έκφρασης P. pastoris. Στοχεύοντας στη δημιουργία ενός βελτιωμένου ανοσοπροσροφητή, πραγματοποιήθηκε η σύνδεση όλων των ΕΚΠ των υπομονάδων του υποδοχέα χρησιμοποιώντας έναν πεπτιδικό συνδέτη. Τα πενταμερή β-δ-α1-γ-α1 ΕΚΠ και β-δ-α1-ε-α1 ΕΚΠ, κατασκευάστηκαν σε μία προσπάθεια μίμησης της διαμόρφωσης ολόκληρου του υποδοχέα σε ένα μοναδικό πολυπεπτίδιο. Τα πενταμερή, θεωρητικά φέρουν το σύνολο των αντιγονικών επιτόπων που αναγνωρίζουν τα αντισώματα αλλά και τις διεπιφάνειες των υπομονάδων που πιθανολογείται ότι είναι επίσης ανοσογόνες. Παράλληλα, μελετήθηκαν και τα διμερή α1-β ΕΚΠ και β-α1 ΕΚΠ, τα οποία προέκυψαν ως ενδιάμεσα στάδια στην κατασκευή των πενταμερών και φέρουν την πλειονότητα των επιτόπων έναντι των οποίων κατευθύνονται τα αυτοαντισώματα. Τα πενταμερή β-δ-α1-γ-α1 ΕΚΠ και β-δ-α1-ε-α1 ΕΚΠ εκφράστηκαν επιτυχώς στο ετερόλογο σύστημα P. pastoris σε διαλυτή μορφή αλλά με ιδιαίτερα χαμηλό επίπεδο έκφρασης. Επιπλέον η ανοσοπροσροφητική τους ικανότητα ως προς την αφαίρεση αυτοαντισωμάτων όχι μόνο δεν βελτιώθηκε αλλά παρουσιάστηκε μειωμένη σε σχέση με τις επιμέρους υπομονάδες. Αντίθετα, όσο αφορά στη χρήση συγκαταμερών στη θεραπευτική προσέγγιση για τη μυασθένεια, το διμερές α1-β ΕΚΠ φαίνεται να τηρεί ένα σύνολο προϋποθέσεων έναντι των πενταμερών β-δ-α1-γ-α1 ΕΚΠ, β-δ-α1-γ-α1 ΕΚΠ και β-α1 ΕΚΠ που το καθιστούν καλό υποψήφιο ανοσοπροσροφητή. Σε αυτές συγκαταλέγονται το σχετικά υψηλό επίπεδο παραγωγής του από το ετερόλογο σύστημα έκφρασης του P. pastoris καθώς και το γεγονός ότι απομονώνεται σε καθαρή μορφή. Σε ότι αφορά το ανοσοπροσροφητικό του προφίλ, φέρει την πλειονότητα των επιτόπων έναντι των οποίων κατευθύνονται τα αυτοαντισώματα και τα απομακρύνει εξίσου αποδοτικά όσο και το μείγμα των μεμονωμένων α1 και β ΕΚΠ. Επιπλέον, το α1-β ΕΚΠ ως ένα πολυπεπτίδιο, υπερτερεί έναντι των μεμονωμένων α1 ΕΚΠ και β ΕΚΠ καθώς ο χαρακτηρισμός του όσο αφορά τις δοκιμασίες με στόχο την έγκριση για κλινική χρήση αναμένεται να είναι ευκολότερος έναντι των δύο πρωτεϊνών. Τέλος, η υψηλή χωρητικότητά του ως προς την αφαίρεση αυτοαντισωμάτων μπορεί να εξασφαλίσει χαμηλό κόστος παραγωγής, έναν παράγοντα σημαντικό για την εφαρμογή της αντιγονοειδικής θεραπευτικής προσέγγισης σε μεγάλη κλίμακα. Ο επιτυχής χαρακτηρισμός του α1-β ΕΚΠ σχετικά με παραμέτρους σταθερότητας, τοξικότητας και ασφάλειας θα μπορούσε να σηματοδοτήσει την έναρξη των κλινικών δοκιμών για τη χρήση του ως ανοσοπροσροφητή στην εφαρμογή της νέας θεραπευτικής προσέγγισης για τη μυασθένεια σε ανθρώπους. / Myasthenia gravis is an antibody mediated autoimmune disease that affects the neuromuscular junction. The muscle nicotinic acetylcholine receptor (AChR) is the main antigen in myasthenia gravis. Circulating antibodies against the acetylcholine receptor are the main pathogenic factors, causing loss of the available functional receptors at the neuromuscular junction with the consequent impairment of signal transduction. Muscle nicotinic acetylcholine receptors are transmembrane proteins formed by 5 homologous subunits: two α subunits and three β, γ (in the embryo and replaced by ε in the adult) and δ. Typically, each subunit consists of an N-terminal extracellular domain (ECD), a transmembrane region and a cytoplasmic loop. The ECDs carry most of the epitopes for MG autoantibodies ,with subunit α baring the main immunogenic region. Current MG treatments include the use of anticholinesterase drugs, immunosuppressants or immunomodulators, plasmapheresis and thymectomy with none of these approaches being specific. The selective removal of anti-AChR antibodies from the blood of MG patients with an extracorporeal technique similar to plasmapheresis could be a therapeutic option. In our laboratory, we aim to develop this method using recombinant extracellular domains (ECDs) of the AChR subunits (α, β, γ, δ and ε) as immunoadsorbents immobilized on CN-Br Sepharose. We have previously described the expression of the individual ECDs in P. pastoris system and their characterization. The aim of this dissertation was to study and characterize the linked ECDs of the α, β, γ, δ and ε subunits expressed in the yeast P. pastoris system. In an attempt to improve immunoadsorption efficiency we expressed the AChR subunits linked with a flexible peptide linker 24 amino acids long. More specifically we designed and characterized two pentameric constucts namely β-δ-α1-γ-α1 ECD & β-δ-α1-ε-α1 ECD to mimic the whole pentameric extracellular domain of the AChR in a native conformation. We also examined two dimeric constructs (α1-β ECD & β1-α ECD) since these subunits carry the majority of MG epitopes. Regarding the pentamers, they were successfully expressed in the P.pastoris system but with the expression yield being relatively low. Furthermore their immunoadsorbing ability was limited in comparison with the mixture of all five ECDs. This fact, combined with their small expression yield, poses a serious obstacle for their use in therapy. On the other hand, both expression yield and antibody binding of the α1-β dimer were satisfactory, at least as good as the mixture of individual α and β ECDs. In addiction, the high capacity of thee α1-β ECD in combination with its expression yield suggests that few milligrams of protein could be sufficient for the clearance of the plasma from an average titer patient. Such a quantity could be easily obtained, allowing the large scale application of the method, while reducing the cost. Therefore, the α1-β dimer constitutes a suitable candidate to be used as efficient immunoadsorbent in the development of a specific therapy against MG. Further characterization of the α1-β ECD, with respect to stability, toxicity and safety aspects, could mark the initiation of animal studies. The successful completion of these studies is crucial for the advancement into clinical trials, for the use of the α1-β ECD as immunoadsorbent in the antigen-specific therapy for myasthenia gravis.

Ο μυϊκός νικοτινικός υποδοχέας ακετυλοχολίνης (nAChR), είναι ένα πενταμερές κανάλι ιόντων νατρίου, το οποίο εδράζεται στους σκελετικούς μύες στη νευρομυϊκή σύναψη και μετατρέπει τις νευρικές ώσεις σε μυϊκές συσπάσεις. Το κανάλι αυτό γίνεται στόχος του ανοσοποιητικού συστήματος, που παράγει στην περίπτωση της βαριάς μυασθένειας αντισώματα εναντίον του. Η συχνότητα της ασθένειας αυτής στο γενικό πληθυσμό είναι 125-400 περιπτώσεις/εκατομμύριο, με αναλογία ανδρών/γυναικών ασθενών 1:2. Τα πρώτα συμπτώματα της νόσου είναι διπλωπία και βλεφαρόπτωση που εξελίσσονται σε γενική μυϊκή αδυναμία και εύκολη κόπωση έως παράλυση των άκρων ή ακόμα και των αναπνευστικών μυών. Οι καθιερωμένες σήμερα θεραπείες της βαριάς μυασθένειας περιλαμβάνουν χορήγηση αντιχολινεστερασικών, ανοσοκατασταλτικών φαρμάκων, θυμεκτομή, πλασμαφαίρεση, καθώς και ενδοφλέβια χορήγηση ανθρωπίνων ανοσοσφαιρινών σε μεγάλες δόσεις. Όμως κοινός παρονομαστής όλων αυτών των θεραπειών είναι η έλλειψη εκλεκτικότητας καθώς και οι παρενέργειες. Τα παραπάνω προβλήματα έχουν κάνει φανερή την ανάγκη για εξεύρεση νέων και πιο εξειδικευμένων θεραπειών, όπως θεραπείες στις οποίες τα παθολογικά αυτοαντισώματα θα αφαιρούνται εκλεκτικά από την κυκλοφορία. Η μελέτη που έγινε στοχεύει στην εκλεκτική αφαίρεση των παθολογικών αντισωμάτων από το αίμα μυασθενών, με μυϊκούς nAChRs ή τμήματα αυτών, που είτε θα χορηγούνται ενδοφλεβίως, είτε θα βρίσκονται ομοιοπολικά προσδεμένα σε στήλες χρωματογραφίας από όπου θα περνά ο ορός. Στο πρώτο μέρος της μελέτης δημιουργήθηκαν παρασκευάσματα που περιείχαν το μυϊκού τύπου nAChR από τα ηλεκτρικά όργανα του ψαριού Torpedo californica (Τ. nAChR). Συγκεκριμένα, παρασκευάστηκε Τ. nAChR ο οποίος ήταν διαλυμένος σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (PBS), σε PBS/Χολικό νάτριο 2% (PBS/Χ.Ν.2%) καθώς επίσης και ενσωματωμένος σε λιποσώματα επικαλυμμένα με αλυσίδες πολυαιθυλενογλυκόλης (PEG), με στόχο την παράταση του χρόνου ημιζωής στον οργανισμό και τη μείωση της αντιγονικότητας. Τα παρασκευάσματα συγκρίθηκαν μεταξύ τους ως προς την ικανότητά τους να δεσμεύουν το μονοκλωνικό αντίσωμα mAb35 (ένα μονοκλωνικό αντίσωμα που προσδένεται σε μυϊκούς nAChRs) καθώς και I125-α-μπουγκαροτοξίνη (I125-α-Bgt) (πρωτεΐνη-συστατικό του δηλητηρίου του φιδιού Bungarus multicinctus και ανταγωνιστής ακετυλοχολίνης, ραδιοσημασμένη με I125), σε διάφορα χρονικά διαστήματα από την παρασκευή τους. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τη μεγαλύτερη ικανότητα δέσμευσης έχει το παρασκεύασμα στο οποίο ο Τ. nAChR είναι διαλυμένος σε PBS/Χ.Ν.2%. Επίσης προσδιορίστηκαν και συγκρίθηκαν τα ποσοστά του mAb35, τα οποία δεσμεύτηκαν in vivo σε αρουραίους από τα ίδια παρασκευάσματα με Τ. nAChR. Τα πειράματα αυτά έδειξαν ότι μόνο ο Τ. nAChR που ήταν διαλυμένος σε PBS/Χ.Ν.2% μπόρεσε να δεσμεύσει ποσοτικά το mAb35. Τέλος έγιναν πειράματα βιοκατανομών, του Τ. nAChR ραδιοσημασμένου με I125-α-Bgt, στα παραπάνω παρασκευάσματα, σε αρουραίους. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι μέγιστο χρόνο ζωής in vivo έχει ο ενσωματωμένος υποδοχέας σε λιποσώματα επικαλυμμένα με PEG. Στο δεύτερο μέρος της μελέτης χρησιμοποιήθηκαν εξωκυτταρικά τμήματα του ανθρωπίνου μυϊκού nAChR (ECDs), εκφρασμένα στο ζυμομύκητα Pichia pastoris και σε κύτταρα εντόμων High Five (από τις ωοθήκες του εντόμου Trichoplusia ni). Τα Pichia pastoris και High Five α1 ECDs συγκρίθηκαν μεταξύ τους ως προς την ικανότητα να δεσμεύουν αντισώματα από ορούς μυασθενών χρησιμοποιώντας τη ραδιοανοσολογική μέθοδο. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων με ορούς 5 ασθενών, έδειξαν ότι το High Five α1 ECD δεσμεύει υπερδιπλάσια ποσοστά αυτοαντισωμάτων σε σχέση με το Pichia pastoris α1 ECD. Από τα πειράματα αυτά φαίνεται πως το High Five α1 ECD πλεονεκτεί του Pichia pastoris α1 ECD ποιοτικά. Συνολικά από τη μελέτη που έγινε, προέκυψε μια σειρά από συμπεράσματα. Κατ’ αρχήν αποδείχθηκε ότι nAChRs, όπως ο Τ. nAChR, μπορούν να ενσωματωθούν σε πολλά διαφορετικά παρασκευάσματα όπως σε PBS, PBS/Χ.Ν.2% και λιποσώματα, τα οποία επηρεάζουν τις ιδιότητές τους, όπως την ικανότητα δέσμευσης mAb35 και I125-α-Bgt και το χρόνο ημιζωής στον οργανισμό. Όπως αποδείχθηκε ο Τ. nAChR μπορεί να δεσμεύει mAb35 σε οποιαδήποτε από τα παραπάνω παρασκευάσματα in vitro, ενώ in vivo μπορεί να το δεσμεύει όταν είναι διαλυμένος σε PBS/Χ.Ν.2%. Επίσης φάνηκε ότι μεγαλύτερο χρόνο ημιζωής in vivo έχει ο Τ. nAChR ενσωματωμένος σε λιποσώματα επικαλυμμένα με PEG. Τέλος αποδείχθηκε ότι ανασυνδυασμένα ECDs της ανθρώπινης α1 υπομονάδας του μυϊκού nAChR, δεσμεύουν αυτοαντισώματα από τον ορό μυασθενών και ότι η ικανότητα δέσμευσης των τμημάτων αυτών, επηρεάζεται από το σύστημα στο οποίο εκφράζονται. Η πληροφορία αυτή πρέπει να ληφθεί υπόψη στη κατασκευή ανοσοπροσροφητικών στηλών για τη θεραπεία της βαριάς μυασθένειας. / The muscle nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) is a pentameric cation channel, which is located at the neuromuscular synapse and converts neuronal impulses into muscle contractions. In myasthenia gravis patients, this particular channel is targeted by the immune system, which produces antibodies against it. The incidence of the disease is about 125-400 cases per million. The first symptoms of the disease are diplopia and blepharoptosis, which may shift to general weakness and fatigability. The established therapies for myasthenia gravis, include administration of acetylcholinesterase inhibitors, immunosuppresive drugs, thymectomy, plasmaphaeresis and administration of intravenous immunoglobulins (IVIGs). Unfortunately all these therapies are not specific and have many serious side effects. This has made clear the need for more specific therapies, in which pathological autoantibodies will not be produced or will be removed selectively. This project aims at the specific aphaeresis of pathological autoantibodies from the patients’ blood by using the muscle nAChR or extracellular domains (ECDs) of its subunits. These molecules will either be administered i.v. or will be covalently conjugated on chromatography beads, forming a column by which the serum could pass and be cleaned from autoantibodies. In the first part of this project, formulations of nAChR, from the electric organs of fish Torpedo californica (T. nAChR), were prepared. Particularly T. nAChR was diluted in PBS and PBS/Sodium Cholate 2% (PBS/S.Ch.2%) and incorporated into liposomes coated by polyethylenoglycol (PEG) chains in different percentages, in order to achieve longer half-life in vivo. Their ability to bind mAb35 (a monoclonal antibody that binds muscle nAChRs) and I125-α- bungarotoxin (I125-labeled toxin from the poison of the snake Bungarus multicinctus, a well studied nAChR antagonist) were compared. The results showed that T. nAChR has the best binding capacity in vitro in the PBS/S.Ch.2%. Apart from the in vitro mAb35 binding measurements, in vivo binding experiments were also performed, using Lewis rats. Results indicate that only T. nAChR in the PBS/S.Ch.2% formulation binds mAb35 quantitatively in vivo. Finally, the biodistribution of T. nAChR in several formulations was also studied in rats. T. nAChR formulations were radiolabelled using I125-α-bungarotoxin and administered i.v. The results indicate that T. nAChR has the longest half-life time when incorporated into PEG-coated liposomes. In the second part of this project, ECDs of human muscle nAChR α1 subunit, expressed in the yeast Pichia pastoris and High Five insect cells were used. Pichia pastoris and High Five α1 ECDs were measured and compared for their ability to bind autoantibodies from myasthenic patients’ sera using radioimmunoassay. The results from 5 patients’ sera indicate that High Five α1 ECD binds more than twice more autoantibodies than Pichia pastoris α1 ECD. In conclusion, it was proved that nAChRs can be incorporated to many different formulations, like PBS, PBS/S.Ch.2% and liposomes, which affect its binding capacity and half-life time. It was shown that Τ. nAChR, when incorporated into any of the above formulations, can bind mAb35 in vitro, while in vivo only in PBS/S.Ch.2% formulation. In addition, it was proved that Τ. nAChR has longer half-life time in vivo when incorporated in PEG-coated liposomes. In the last part of the project, it was shown that ECDs of human nAChR α1 subunit binds autoantibodies from myasthenia gravis patient’s serum and their binding capacity is strongly affected by the expression system.