Η βαριά μυασθένεια (Myasthenia gravis-MG) είναι μία επίκτητη αυτοάνοση δυσλειτουργία στη νευρομυϊκή σύναψη που προκαλείται από αντισώματα που κατευθύνονται ειδικά έναντι του μυϊκού τύπου νικοτινικού υποδοχέας της ακετυλοχολίνης (AChR) που βρίσκεται στα μυϊκά κύτταρα. Τα αντισώματα μειώνουν τον αριθμό των λειτουργικών υποδοχέων με αποτέλεσμα οι μυς να μην μπορούν να ανταποκριθούν στα μηνύματα που λαμβάνουν από τα νευρικά κύτταρα. Η κλινική εικόνα χαρακτηρίζεται από χρόνια μυϊκή αδυναμία. Η σωστή διάγνωση από τον θεράποντα ιατρό και ο σχεδιασμός της κατάλληλης θεραπείας, αποτελούν τη βάση για την αντιμετώπιση μιας νόσου και την ενίσχυση της ποιότητας ζωής. Η μη συμμόρφωση όμως του ασθενούς, στη θεραπεία που του προτείνεται, αποτελεί αντικείμενο έρευνας τις τελευταίες δεκαετίες. Η μη συμμόρφωση έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση του κόστους περίθαλψης, προκαλώντας μεγάλες κοινωνικοοικονομικές συνέπειες. Στην παρούσα έρευνα δημιουργήθηκε ένα ερωτηματολόγιο και διατέθηκε σε δείγμα 30 μυασθενών. Μέσω της συλλογής των απαντήσεων έγινε μια προσπάθεια να προσδιοριστούν οι παράγοντες που οδηγούν σε μη συμμόρφωση. Διερευνάται η στάση ζωής που κρατά ο ασθενής, η εικόνα που έχει ο ίδιος για τον εαυτό του και ο ρόλος που έχουν το στενό περιβάλλον, ο ιατρός και ο φαρμακοποιός του, ούτως ώστε, ο ασθενής να είναι συνεπής στην αγωγή που του έχει προταθεί. / Myasthenia Gravis (MG) is an acquired autoimmune neuromuscular junction disorder caused by antibodies directed specifically toward the skeletal muscle nicotinic acetylcholine receptor (AChR). The antibodies decrease the number of functional AChRs which compromises neuromuscular transmission. The clinical course of MG is characterized by muscular weakness and fatigability. The right diagnosis of the attending physician and the design of appropriate therapy are determinant for the treatment of a disease and enhance quality of life. Non-compliance of the patient (also adherence or capacitance) to the treatment that his doctor suggested, however, is being investigated in the last decades. Non-compliance increase health care costs and evoke considerable socioeconomic consequences. Worldwide, non-compliance is a major obstacle to the effective delivery of health care. In the present dissertation a questionnaire is created and distributed to a sample of 30 MG patients. Through the collection of responses we attempted to analyze the factors that lead to non-compliance. The objective was to identify how the patient sees himself. It was also made an effort to clarify the roles of doctor, pharmacist and family in patient compliance when long term medication is needed.

Οι υποδοχείς της ακετυλοχολίνης (AChRs) είναι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες ενεργοποιούμενες με τη δέσμευση της ακετυλοχολίνης (ACh). Με κριτήρια, όπως η χημική συγγένεια που εμφανίζουν για σηματοδότικά μόρια και οι φαρμακολογικές τους ιδιότητες, ταξινομούνται στην ομάδα των νικοτινικών AChRs και στην ομάδα των μουσκαρινικών AChRs. Οι νικοτινικού τύπου υποδοχείς δημιουργούνται από τη συναρμογή πέντε ομόλογων υπομονάδων και υποδιαιρούνται σε μυϊκού τύπου, ευρισκόμενους κυρίως στους σκελετικούς μύες των σπονδυλωτών και σε νευρικού τύπου, απαντώμενους κατά κύριο λόγο στο κεντρικό και περιφερικό νευρικό σύστημα. Οι AChRs σχετίζονται με σειρά παθολογικών καταστάσεων, μεταξύ των οποίων και η βαρειά μυασθένεια (Myasthenia Gravis-MG). Η μυασθένεια χαρακτηρίζεται από χρόνια μυϊκή αδυναμία, προκαλούμενη από τη δράση αντισωμάτων υψηλής συγγένειας έναντι του μυϊκού τύπου AChR. Με απώτερο σκοπό τη διερεύνηση της παθογονικότητας των αυτοαντισωμάτων έναντι μεμονωμένων υπομονάδων του AChR, προχωρήσαμε στην παραγωγή ανασυνδυασμένων πολυπεπτιδικών τμημάτων των υπομονάδων στο ζυμομύκητα Pichia pastoris. Τα πολυπεπτίδια χρησιμοποιήθηκαν στην παρασκευή χρωματογραφικών-ανοσοπροσροφητικών στηλών, που εφαρμόστηκαν ακολούθως για την απομόνωση αυτοαντισωμάτων από επιλεγμένους ορούς μυασθενικών ατόμων. Η παθογόνος δράση των απομονωμένων αυτοαντισωμάτων ελέχθηκε μέσω της προκαλούμενης απώλειας υποδοχέων (αντιγονική τροποποίηση-antigenic modulation) σε κυτταρική σειρά (ΤΕ671) που εκφράζει τον AChR και μέσω της χορήγησή τους σε πειραματόζωα και τον έλεγχο της εμφάνισης χαρακτηριστικών συμπτωμάτων της νόσου. Εκτενής συγκριτική μελέτη μεταξύ τεσσάρων επιλεγμένων ορών και αντισωμάτων έναντι της α1 και της β υπομονάδας του υποδοχέα, που απομονώθηκαν από τους συγκεκριμένους ορούς, έδειξαν πως τα αυτοαντισώματα ευθύνονται για δράση των ορών στους υποδοχείς των κυττάρων. Τόσο οι ολικοί οροί όσο και τα απομονωμένα-καθαρά αυτοαντισώματα έναντι των υπομονάδων α1 και β, προκάλεσαν δοσοεξαρτώμενη απώλεια υποδοχέων στα κύτταρα και μάλιστα τα αντι-α1 αντισώματα εμφανίστηκαν περίπου τέσσερις φορές δραστικότερα από τα αντι-β. Η ικανότητα των μερικώς απαλλαγμένων από αυτοαντισώματα έναντι του υποδοχέα ορών να προκαλούν απώλεια υποδοχέων στα κύτταρα, φάνηκε να ποικίλλει και να συσχετίζεται άμεσα με το είδος των αντισωμάτων που έχουν παραμείνει στον ορό, υποστηρίζοντας μια διαφορετικότητα στην παθογονικότητα των επιμέρους αντισωμικών κλασμάτων. Με σκοπό την επιβεβαίωση και ενίσχυση των αποτελεσμάτων που προκύπτουν από τα in vitro πειράματα, ακολούθησαν προσπάθειες για την πρόκληση πειραματικής μυασθένειας σε πειραματόζωα, με τη χορήγηση ορών μυασθενικών και καθαρών αυτοαντισωμάτων έναντι διαφόρων υπομονάδων του υποδοχέα. Η χορήγηση σε ζώα τόσο του ολικού ορού, όσο και καθαρών αντισωμάτων έναντι της α1-υπομονάδας του υποδοχέα, προκάλεσαν σημαντική απώλεια βάρους και εμφάνιση έντονων συμπτωμάτων μυϊκής αδυναμίας, μέχρι και το θάνατο. Πειραματόζωα που ενέθηκαν με το κλάσμα του ορού από το οποίο έχουν απομακρυνθεί τα συγκεκριμένα αντισώματα εμφάνισαν πολύ ηπιότερα ή και καθόλου συμπτώματα, ενώ απουσία συμπτωμάτων καταγράφηκε και κατά τη χορήγηση ορού που περιείχε αποκλειστικά αντισώματα έναντι της β υπομονάδας, αλλά και απομονωμένων αντι-β αντισωμάτων. Η παρούσα μελέτη υπέδειξε τα αυτοαντισώματα έναντι του AChR ως τον μοναδικό παθογόνο παράγοντα στον ορό μυασθενικών ατόμων, συμβάλλοντας στην κατανόηση της παθοφυσιολογίας της νόσου. Επιβεβαίωσε την υπεροχή των αντι-α1 αντισωμάτων έναντι των αντι-β, ως πρός την παθογονικότητά τους, τόσο in vitro όσο και in vivo, με την επιφύλαξη βέβαια που επιβάλλει ο μικρός αριθμός δειγμάτων που μελετήθηκαν. Η δυνατότητα λήψης αντισωμάτων που στοχεύουν σε συγκεκριμένη υπομονάδα μπορεί να συμβάλλει στη λεπτομερή μελέτη της δραστικότητας του κλάσματος και να οδηγήσει στη συσχέτισή του με την εμφάνιση συγκεκριμένων συμπτωμάτων της νόσου. / Acetylcholine receptors (AChRs) are integral membrane proteins that respond to the binding of acetylcholine (ACh), which is synthesized, stored and finally released by cholinergic neurons. Like other transmembrane receptors, AChRs have been classified according to either their pharmacological properties or their relative affinities for various molecules, and can therefore be further divided into: i) nicotinic AChRs, which are particularly responsive to nicotine and ii) muscarinic AChRs, which are particularly responsive to muscarine. AChRs are involved in myasthenia gravis (MG) and many other physiological disorders, mainly affecting the central and peripheral nervous system. In MG, autoantibodies are directed against the nicotinic AChR at the neuromuscular junction. The disease is characterized by various symptoms, including muscle weakness and fatigability, due to defective neuromuscular transmission. To obtain an insight into the role of the various anti-AChR antibody specificities in MG, we isolated and studied the in vitro and in vivo activity of autoantibodies targeting individual AChR subunits. Using recombinant proteins corresponding to extracellular domains (ECDs) of individual AChR subunits as immunoadsorbents; we isolated autoantibodies which specifically bind to these subunits. We then used the well established TE671 human muscle cell line to examine the in vitro functions of subunit-specific autoantibody populations through their ability to induce nAChR antigenic modulation. Isolated subunit-specific autoantibodies were also used to determine their capacity to passively transfer experimental MG into lab animals. Our results clearly demonstrated that autoantibodies against the α1 or β subunit can cause AChR loss via antigenic modulation in a dose-dependent manner, the anti-α1 autoantibodies being much more effective than the anti-β autoantibodies. Furthermore, we showed that the autoantibody-depleted sera were much less effective, or were completely inactive, at causing AChR loss. In in vivo experiments, the administration of MG sera derivatives to lab animals showed that sera enriched in anti-α1 autoantibodies, as well as the corresponding pure anti-α1 autoantibodies from two individuals, are efficient in inducing MG like symptoms to the animals. A single serum contained almost 100% anti-β antibodies and the corresponding purified antibodies did not cause any clinical MG symptoms. The depleted fraction of MG sera tested, induced mild symptoms or no symptoms were observed, and this is in agreement with the in vitro results, strongly suggesting that the anti-AChR autoantibodies in MG sera and mainly the anti-α1 specificities are the sole pathogenic factor in anti-AChR antibody-seropositive MG.

Ο νικοτινικός υποδοχέας της ακετυλοχολίνης ανήκει στην υπερ-οικογένεια των ιοντικών διάυλων ενεργοποιούμενων μέσω προσδέτη (ligand-gated ion channels). Οι υπομονάδες των υποδοχέων που ανήκουν στην οικογένεια αυτή, φέρουν στο αμινοτελικό τους άκρο τη χαρακτηριστική κυστεϊνική θηλιά (Cys-loop) μεταξύ δύο συντηρημένων καταλοίπων κυστεΐνης, οι οποίες συνδέονται με δισουλφιδικό δεσμό. Οι νικοτινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης είναι μεγάλες διαμεμβρανικές πρωτεΐνες που αποτελούνται από πέντε ομόλογες υπομονάδες και χωρίζονται σε δυο κατηγορίες, τους νευρικούς και τους μυϊκούς. Οι νευρικοί υποδοχείς εκφράζονται κυρίως στο κεντρικό και περιφερικό νευρικό σύστημα, καθώς και σε μη-νευρικούς ιστούς, όπως τα επιθηλιακά κύτταρα και τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος. Επιπλέον, χωρίζονται σε δύο υποκατηγορίες, τους ετεροπενταμερείς, όπως είναι η (α4)x(β2)y, και τους ομοπενταμερείς, όπως η (α7)5. Οι μυϊκοί υποδοχείς απαντώνται στις μετασυναπτικές μεμβράνες των νευρομυϊκών συνάψεων των σπονδυλωτών και στα ηλεκτρικά όργανα ορισμένων ψαριών και εμφανίζουν στοιχειομετρία (α1)2β1γδ (στα έμβρυα) ή (α1)2β1εδ (στους ενήλικες). Ο μυϊκός υποδοχέας της ακετυλοχολίνης σε σχέση με τα υπόλοιπα μέλη της υπερ-οικογένειας, είναι ο καλύτερα μελετημένος ως προς τα χαρακτηριστικά και τη λειτουργία του. Ένας από τους κύριους παράγοντες που συνέβαλε στον εκτεταμένο χαρακτηρισμό του μυϊκού υποδοχέα είναι η δυνατότητα απομόνωσης, σε μεγάλες ποσότητες και σε λειτουργική μορφή, υποδοχέων της ακετυλοχολίνης παρόμοιων με αυτούς της νευρομυϊκής σύναψης από τα ηλεκτρικά όργανα των ψαριών Torpedo και Electrophorus. Οι πρώτες πληροφορίες για την τρισδιάστατη δομή του υποδοχέα δόθηκαν από ένα μοντέλο ηλεκτρονικής μικροσκοπίας, από υποδοχέα που απομονώθηκε από το ηλεκτρικό όργανο του ψαριού Torpedo marmorata. Στη συνέχεια, η λύση της δομής ενός ομολόγου του εξωκυτταρικού τμήματος του υποδοχέα, της acetylcholine binding protein (AChBP) από το σαλιγκάρι Lymnaea stagnalis έφερε και τις πρώτες πληροφορίες υψηλής ανάλυσης. Η AChBP είναι μια υδατοδιαλυτή πρωτεΐνη, η οποία σχηματίζει σταθερά ομοπενταμερή, με ομολογία 20%-24% με το εξωκυτταρικό τμήμα των υπομονάδων του υποδοχέα. Πρόσφατα, η λύση της δομής της εξωκυτταρικής περιοχής της α1 υπομονάδας του υποδοχέα ποντικού, στην οποία είχε προσδεθεί ο ανταγωνιστής της ακετυλοχολίνης α-μπουγκαροτοξίνη, προσέφερε επιπλέον πληροφορίες για τα χαρακτηριστικά του υποδοχέα, όπως είναι η κύρια ανοσογόνος περιοχή (MIR) και η συντηρημένη Cys-loop περιοχή. Παρόλα αυτά δεν έχουν δημοσιευτεί υψηλής ανάλυσης πληροφορίες για τη δομή του ανθρώπινου υποδοχέα. Επιπλέον από το φυσιολογικό ρόλο του μυϊκού υποδοχέα, ο οποίος είναι άμεσα υπεύθυνος για τη διαβίβαση της ώσης στη νευρομυϊκή σύναψη, παράλληλα ο υποδοχέας αυτός αποτελεί και στόχο για πολλά κληρονομικά και επίκτητα νοσήματα, στα οποία ανήκει και το αυτοάνοσο νόσημα μυασθένεια. Στη νόσο αυτή, αυτοαντισώματα έναντι του μυϊκού υποδοχέα προκαλούν μείωση των διαθέσιμων λειτουργικών υποδοχέων στη νευρομυϊκή σύναψη με συνέπεια να παρεμποδίζεται η δράση της ακετυλοχολίνης. Αυτοαντισώματα έναντι του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης εντοπίζονται στο 80%-90% των μυασθενών και η παρουσία τους θεωρείται ο κύριος παθογόνος παράγοντας για τη μυασθένεια. Ο σημαντικός ρόλος λοιπόν του υποδοχέα σε φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις, τον καθιστά αντικείμενο εντατικής έρευνας. Η λεπτομερής ανάλυση της δομής και της λειτουργίας του θα μπορούσε να συμβάλλει στην κατανόηση της δομής και της λειτουργίας των υπόλοιπων υποδοχέων-μελών της υπερ-οικογένειας καθώς επίσης και στην εξιχνίαση του αυτοάνοσου μηχανισμού της μυασθένειας. Ωστόσο, το μεγάλο μέγεθος του μορίου του υποδοχέα, ο υδρόφοβος χαρακτήρας του και η αδυναμία απομόνωσής του από φυσικές πηγές, δυσχεραίνει την πραγματοποίηση δομικών μελετών. Για το λόγο αυτό, είναι αναγκαίο να προκύψουν πρωτεϊνικά μόρια με δομή η οποία να πλησιάζει αρκετά τη φυσική διαμόρφωση του νικοτινικού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης και σε ποσότητες ικανές ώστε να είναι εφικτές οι δομικές μελέτες τους. Προηγούμενα, είχαν εκφραστεί στο εργαστήριό μας οι εξωκυτταρικές περιοχές (ΕΚΠ) των υπομονάδων α1, β1, γ και ε (α1ΕΚΠ, β1ΕΚΠ, γΕΚΠ και εΕΚΠ) του ανθρώπινου μυϊκού υποδοχέα, χρησιμοποιώντας ως σύστημα έκφρασης το ζυμομύκητα Pichia pastoris. Οι ανασυνδυασμένες αυτές πρωτεΐνες, απομονώθηκαν σε διαλυτή και γλυκοζυλιωμένη μορφή, αναγνωρίζονταν από μονοκλωνικά αντισώματα έναντι της κάθε υπομονάδας, αλλά και από αντισώματα προερχόμενα από ορούς μυασθενών. Ωστόσο, τα επίπεδα έκφρασης και η διαλυτότητα δεν ήταν ικανοποιητικά για δομικές μελέτες. Παρόλα αυτά, οι ανασυνδυασμένες αυτές πρωτεΐνες, χρησιμοποιήθηκαν επιτυχώς για μια καινούρια αντιγονοειδική θεραπευτική προσέγγιση για τη μυασθένεια, η οποία έγκειται στην ειδική αφαίρεση των αυτοαντισωμάτων από ορούς μυασθενών, χρησιμοποιώντας τις συγκεκριμένες πρωτεΐνες ως ανοσοπροσροφητές. Η χρήση της α1ΕΚΠ του ανθρώπινου μυϊκού υποδοχέα ως ανοσοπροσροφητή, είχε ως αποτέλεσμα την αφαίρεση μεγάλου ποσοστού αυτοαντισωμάτων από ορούς μυασθενών. Παρόμοια ήταν και τα αποτελέσματα με τη χρήση των εξωκυτταρικών τμημάτων των υπομονάδων β1, γ και ε ως ανοσοπροσροφητές. Ωστόσο, με τον τρόπο αυτό δεν επιτυγχάνεται πλήρης απομάκρυνση των παθογόνων αυτοαντισωμάτων. Η παρούσα εργασία είχε στόχο τη βελτίωση της δομής, της διαλυτότητας και των επιπέδων έκφρασης των υπομονάδων του μυϊκού υποδοχέα, έτσι ώστε να είναι κατάλληλες για δομικές μελέτες και κυρίως για να συμβάλλουν στις προσπάθειες βελτίωσης της αντιγονοειδικής θεραπείας για τη μυασθένεια. Ειδικότερα, το πρώτο μέρος αφορά μελέτες σχετικές με την έκφραση της γΕΚΠ, η οποία σχημάτιζε ολιγομερή και είχε πολύ χαμηλά επίπεδα έκφρασης. Σχεδιάστηκαν λοιπόν 4 μεταλλάγματα, με την προοπτική να προκύψουν πιο διαλυτά και υδρόφιλα μόρια. Οι μεταλλάξεις που σχεδιάστηκαν αφορούσαν στην αντικατάσταση συγκεκριμένων κυστεϊνών, που θα μπορούσαν να σχηματίζουν ακατάλληλους ένδο- ή δια-μοριακούς δεσμούς (μέσω δισουλφιδικών δεσμών), καθώς επίσης και στην αντικατάσταση της υδρόφοβης Cys-loop περιοχής με την αντίστοιχη, πιο υδρόφιλη της AChBP. Στα δύο μεταλλάγματα που έφεραν τη Cys-loop περιοχή της AChBP, παρατηρήθηκε δραματική βελτίωση στα επίπεδα έκφρασης και στη διαλυτότητα των μορίων, ενώ ακόμη προσεγγίστηκε το αναμενόμενο μοριακό μέγεθος, όπως φανέρωσαν τα αποτελέσματα από τη χρωματογραφία μοριακής διήθησης καθώς και οι μετρήσεις δυναμικής σκέδασης φωτός. Όταν τα δύο βελτιωμένα μεταλλάγματα χρησιμοποιήθηκαν ως ανοσοπροσροφητές για την αντιγονοειδική θεραπεία που προαναφέρθηκε, παρουσίασαν βελτιωμένη ικανότητα πρόσδεσης αυτοαντισωμάτων από ορούς μυασθενών, συγκριτικά με την αγρίου τύπου γΕΚΠ. Τα αποτελέσματα αυτά έδειξαν ότι η υδρόφοβη Cys-loop περιοχή της αγρίου τύπου γΕΚΠ συμβάλλει σημαντικά στη δημιουργία συσσωματωμάτων κατά την έκφραση της ΕΚΠ και για το λόγο αυτό ακολούθησε η αντικατάσταση αυτής της περιοχής και στις υπόλοιπες ΕΚΠ των υπομονάδων του μυϊκού υποδοχέα. Προκειμένου να βελτιωθεί περαιτέρω η αντιγονοειδική θεραπευτική προσέγγιση για τη μυασθένεια, πραγματοποιήθηκαν προσπάθειες να συνεκφραστούν όλες οι ΕΚΠ των υπομονάδων του μυϊκού υποδοχέα, με σκοπό να δημιουργηθούν σύμπλοκα που διαθέτουν και τις διεπιφάνειες μεταξύ των ΕΚΠ του υποδοχέα, οι οποίες πιστεύεται ότι είναι και αυτές ανοσογόνες. Στις προσπάθειες αυτές χρησιμοποιήθηκαν οι μεταλλαγμένες ΕΚΠ των υπομονάδων που φέρουν τη Cys-loop περιοχή της AChBP. Οι αρχικές συνεκφράσεις των ΕΚΠ όλων των υπομονάδων του ανθρώπινου μυϊκού υποδοχέα ήταν ανεπιτυχείς όσον αφορά στη δημιουργία συμπλόκων. Προκειμένου λοιπόν, να πραγματοποιηθεί ο συνδυασμός όλων των ΕΚΠ των υπομονάδων και η δημιουργία ενός λειτουργικού μορίου, το επόμενο βήμα ήταν η σύνδεση των υπομονάδων με ένα πεπτιδικό συνδέτη επαναλαμβανόμενων αμινοξέων. Ο συνδέτης που χρησιμοποιήθηκε αποτελείται από οκτώ επαναλαμβανόμενες τριάδες των αμινοξέων αλανίνη – γλυκίνη – σερίνη (AGS)8. Αρχικά κατασκευάστηκαν όλα τα ζεύγη (συγκαταμερή) που χρειάζονται, για να επακολουθήσουν πολλαπλά στάδια υποκλωνοποιήσεων, προκειμένου να σχηματιστεί το πενταμερές. Όλα τα συγκαταμερή παρουσίασαν το αναμενόμενο μοριακό βάρος όπως φάνηκε από ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου σε αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-PAGE), γεγονός που σημαίνει ότι ο συνδέτης δεν πρωτεολύεται και είναι ικανός να συγκρατεί τις υπομονάδες ενωμένες. Επιπλέον, τα επίπεδα έκφρασης που παρουσίασαν τα συγκαταμερή ήταν ικανοποιητικά και όλα τα συγκαταμερή που έφεραν την α1ΕΚΠ διατήρησαν την ικανότητα να προσδένουν σημασμένη α-μπουγκαροτοξίνη, η οποία προσδένεται ειδικά στην α1ΕΚΠ με υψηλή συγγένεια. Ωστόσο, τα αποτελέσματα από τη χρωματογραφία μοριακής διήθησης, φανέρωσαν ότι όλα τα συγκαταμερή εκλούονται δίνοντας ένα ευρύ φάσμα μοριακών βαρών, από μονομερή μέχρι ολιγομερή και συσσωματώματα. Τέλος, η α1ΕΚΠ-(AGS)8-γΕΚΠ παρουσίασε αυξημένη ικανότητα πρόσδεσης 125Ι-α-Βgt συγκριτικά με την γΕΚΠ-(AGS)8-α1ΕΚΠ, γεγονός που σημαίνει ότι η σειρά με την οποία συνδέονται οι υπομονάδες, παίζει σημαντικό ρόλο στη διαμόρφωση των μορίων. Στην προσπάθεια βελτίωσης της διαμόρφωσης και των χαρακτηριστικών των συγκαταμερών, έγινε χρήση ενός μεγαλύτερου συνδέτη, αποτελούμενου από έντεκα επαναλαμβανόμενες τριάδες των αμινοξέων αλανίνη – γλυκίνη – σερίνη (AGS)11, ωστόσο δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στα τελικά προϊόντα έκφρασης. Όσον αφορά στη χρήση των συγκαταμερών στη θεραπευτική προσέγγιση για τη μυασθένεια, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι όλα τα συγκαταμερή διατήρησαν πλήρως την ικανότητα να προσδένουν αυτοαντισώματα από τους ορούς των μυασθενών, αν και δε βελτίωναν περαιτέρω την ικανότητα ανοσοπροσρόφησης των επιμέρους ΕΚΠ. Συμπερασματικά λοιπόν, καταλήγουμε ότι η αντικατάσταση της υδρόφοβης Cys-loop περιοχής των ΕΚΠ των υπομονάδων με την αντίστοιχη, υδρόφιλη περιοχή του ομολόγου AChBP, οδηγεί στη δημιουργία μορίων με βελτιωμένα χαρακτηριστικά, όπως είναι τα επίπεδα έκφρασης και η διαλυτότητα των μορίων. Τα μόρια αυτά μπορούν στη συνέχεια να συνδεθούν με ένα πεπτιδικό συνδέτη και να παραχθούν συγκαταμερή με σωστή διαμόρφωση, τα οποία διατηρούν τα λειτουργικά χαρακτηριστικά τους, όπως είναι η πρόσδεση σημασμένης α-μπουγκαροτοξίνης και η πρόσδεση αυτοαντισωμάτων από ορούς μυασθενών. Τα δεδομένα αυτά ενισχύουν την πεποίθηση ότι είναι εφικτή η κατασκευή του ετεροπενταμερούς του ανθρώπινου μυϊκού υποδοχέα που θα αποτελείται μόνο από τις ΕΚΠ των υπομονάδων του. / The nicotinic acetylcholine receptor (AChR) belongs to the superfamily of pentameric ligand-gated ion channels (LGIC), also known as the Cys-loop receptor family. The subunits of the receptors belonging to this superfamily carry at their N-terminal domain characteristic, highly conserved Cys-loop region, a string of 13 amino acids linked by a disulfide bond. AChRs are large, transmembrane glycoproteins, which are composed of five homologous subunits, arranged around a central ion channel and they are divided into two subgroups, the neuronal and the muscle type. The neuronal receptors are expressed mainly in the central and the peripheral nervous system, as well as in non-neuronal tissues, such as epithelial and immune cells. Moreover, the neuronal receptors are further subdivided into two categories, the heteropentamers, such as (α4)x(β2)y, and the homopentamers, such as (α7)5. The muscle AChRs are located on the postsynaptic membrane of the neuromuscular junction and have the subunit composition α2βγδ (embryonic) or α2βεδ (adult). The muscle AChR is the best studied model from the superfamily of the LGICs, as far as its characteristics and function are concerned. One of the major reasons which contributed to its extensive characterization is the ability to isolate, in great amounts and in a functional form, AChRs similar to these of the neuromuscular junction from the electric organs of the fishes Torpedo and Electrophorus. An electron microscopy model of the Torpedo marmorata, purified from the electric organ of the electric ray, provided the first information about the three-dimensional structure of the AChR. The first high resolution insight was provided by the solved crystal structure of the AChBP from the snail Lymnaea stagnalis, a homologue of the extracellular domain (ECD) of the AChR. The AChBP is a soluble protein, which forms stable homopentamers and shares high homology with the ECDs of the AChR (20%-24%). Recently, the solved crystal structure of a mutated mouse α1ECD bound to α-bungarotoxin provided further information for a number of receptor-specific elements, including the main immunogenic region (MIR) and the Cys-loop. Nevertheless, high resolution information about the three-dimensional structure of the human AChR has not been reported so far. In addition to the physiological role of the muscle AChR, which is responsible for mediating the neuromuscular transmission, the muscle AChR is the target for a number of acquired and hereditary diseases, including the autoimmune disease myasthenia gravis (MG). In MG, autoantibodies against the AChR cause loss of the available and functional AChRs in the neuromuscular junction, and as a consequence, the action of acetylcholine is blocked. Autoantibodies against AChR are found in nearly 80%-90% of patients with generalized MG and are considered the main pathogenic factor in MG. The important pathophysiological roles of the AChRs made them subject to intensive research. The detailed analysis of the structure and function of the AChR could contribute to the understanding of the structure and function of the rest of the members of the superfamily, as well as to the comprehension of the pathogenic mechanism of MG. However, the fact that the AChR is a big, hydrophobic molecule, difficult to purify from natural sources, make the accomplishment of structural studies hard. It is necessary to generate recombinant molecules with conformation similar to that of the native AChR, in efficient amounts, in order to perform structural studies. We have previously expressed the human muscle AChR α1, β1, γ and ε ECDs using the yeast Pichia pastoris. These recombinant proteins were purified in a soluble and glycosylated form, recognizable by both monoclonal antibodies and a considerable percentage of anti-subunit antibodies in positive sera from MG patients. However, both the expression yield and the solubility of these proteins were not satisfactory for structural studies. Nevertheless, they were successfully used for a novel, antigen-specific therapeutic approach against MG, regarding the specific removal of the autoantibodies from MG sera, using these proteins as immunoadsorbents. The use of the human α1ECD as an immunoadsorbent resulted in the removal of a great percentage of autoantibodies from sera derived from MG patients. The results were similar when the β1, γ and ε ECDs were used as immunoadsorbents. However, the complete removal of the pathogenic autoantibodies from the MG sera was not achieved. We aimed at the improvement of the structure, solubility and expression yield of the ECDs of the muscle AChR, in order to render them suitable for structural studies and mainly to use them for the amelioration of the antigen-specific therapeutic approach against MG. For this, we selected the γECD, which formed oligomers and displayed a low expression yield and constructed four mutants of the protein. The mutations were concerning the replacement of certain cysteines, which could form inappropriate intra- or inter-molecular bonding and thus aggregation, as well as the substitution of the hydrophobic Cys-loop region by its counterpart, more hydrophilic AChBP Cys-loop. The two mutants which carried the Cys-loop of the AChBP displayed a dramatic improvement at the expression yield and solubility, while they approached the expected molecular size, according to the results from gel filtration and dynamic light scattering. When these two improved mutants were used as immunoadsorbents, they exhibited an increased ability to bind autoantibodies from MG sera, compared with the wild type γECD. These results indicate that the hydrophobic Cys-loop region of the γECD importantly contributes to the formation of aggregates during the expression of the ECD, and consequently followed the replacement of this region at the rest ECDs of the muscle AChR. In order to further ameliorate the antigen-specific therapeutic approach against MG, we carried out efforts to co-express all of the ECDs of the muscle AChR, targeting to create complexes which would carry the interfaces between the ECDs, which are thought to be also immunogenic. At these efforts, the mutant forms of the ECDs which carried the Cys-loop of the AChBP were used. These initial co-expressions of the ECDs were not successful, with the respect to the creation of complexes. In order to combine the ECDs of all the subunits and construct a functional molecule, the next step was the binding of these ECDs with a linker of repeated amino acids. The linker that was used, was consisted of eight repeated triplets of the amino acids alanine-glycine-serine (AGS)8. At the beginning were constructed the pairs (concatamers) which were needed in order to follow subclonings, preparative to form the pentamer. All of the concatamers displayed the expected molecular weight, according the results of the SDS-PAGE. This fact suggests that the linker does not undergo proteolysis, and thus is capable of retaining the subunits conjoint. Furthermore, the expression yield of the concatamers was satisfactory and they retained their ability to bind radiolabelled α-bungarotoxin, which is specifically binds to the α1ECD with high affinity. However, the results from the gel filtration indicated that all the concatamers eluted in a broad spectrum of molecular weights, from monomers to oligomers. In an effort to improve the conformation and the characteristics of the concatamers, a bigger linker which was consisted of eleven repeated triplets of the amino acids alanine-glycine-serine (AGS)11 was used, but the final products where shown to be similar. With respect to the use of the concatamers at the therapeutic approach against MG, the results showed that all the concatamers retain the ability to bind autoantibodies from MG sera, although there was no further improvement in the immunoadsorbing ability of the single ECDs. Conclusively, the substitution of the hydrophobic Cys-loop of the ECDs by the corresponding, more hydrophilic of the AChBP, results in the construction of molecules with improved characteristics, such as the expression yield and the solubility. The molecules are able to be linked together and form concatamers with the appropriate conformation, retaining their functionality, such as the binding of radiolabelled α-bungarotoxin and autoantibodies from MG sera. These results demonstrate that it is feasible to construct the heteropentamer of the human muscle AChR, which will consist only of the ECDs.

Η βαριά μυασθένεια (Myasthenia Gravis, MG) είναι μια αυτοάνοση νόσος η οποία χαρακτηρίζεται από διαταραχή στη νευροδιαβίβαση στο επίπεδο της νευρομυϊκής σύναψης. Η διάγνωση της MG βασίζεται στην κλινική συμπτωματολογία η οποία συνεπικουρείται από φαρμακολογικές, ηλεκτροφυσιολογικές και απεικονιστικές δοκιμασίες και επιβεβαιώνεται συνήθως από την ορολογική ανίχνευση αυτοαντισωμάτων έναντι συστατικών της νευρομυϊκής σύναψης. Οι σύγχρονες διαγνωστικές δοκιμασίες είναι συνήθως ικανές προς ανίχνευση της παρουσίας αντισωμάτων στο 85-90% περίπου των μυασθενών με γενικευμένη MG και στο 50% περίπου των ασθενών με οφθαλμική MG. Το κενό αυτό στη διάγνωση της MG δημιουργεί ένα σημαντικό πρόβλημα στις περισσότερες περιπτώσεις που ελέγχονται επειδή ένα αρνητικό αποτέλεσμα (το οποίο είναι το συχνότερο αποτέλεσμα στη συνήθη εργαστηριακή διάγνωση της MG) αφήνει μία ασάφεια σχετικά με την ύπαρξη MG. Πράγματι, ακόμη και ένας πολύ χαμηλός τίτλος θα μπορούσε να είναι επαρκής για να εξηγήσει την παρουσία της μυασθένειας, δεδομένου ότι δεν έχει διαπιστωθεί σημαντική συσχέτιση μεταξύ του τίτλου των αντισωμάτων και της σοβαρότητας της νόσου στον πληθυσμό των ασθενών. Ως εκ τούτου, υπάρχει αυξανόμενη ανάγκη για την ανάπτυξη ιδιαίτερα ευαίσθητων διαγνωστικών μεθόδων, για την αναμφισβήτητη απόδειξη της νόσου. Η πλέον ευαίσθητη διαγνωστική δοκιμασία είναι η ραδιολογική ανοσοκαθίζηση (Radioimmunoprecipitation assay, RIPA) και ο πλέον σημαντικός περιοριστικός παράγων για την ανίχνευση χαμηλού τίτλου αντισωμάτων, είναι η αδυναμία χρήσης μεγάλου όγκου ορού (μέγιστο είναι ~5-20 μl), η οποία θα καθιστούσε αναγκαία την επακόλουθη χρήση υψηλού όγκου αντί-ορού και η οποία θα οδηγούσε σε υπερβολικά μεγάλα άνοσο-ιζήματα, τα οποία με τη σειρά τους συνδέονται με απαράδεκτα επίπεδα μη ειδικού θορύβου υπόβαθρου. Με την ανάπτυξη στην παρούσα μελέτη της RIPA δύο-σταδίων ξεπεράσθηκαν σε μεγάλο βαθμό τα προβλήματα αυτά. Η δοκιμασία αυτή βασίζεται στην ακινητοποίηση του αντιγόνου-στόχου σε ένα αδιάλυτο υπόστρωμα, ακολουθούμενη από την επώαση με μεγάλους όγκους (π.χ. 0,1-1ml) του προς εξέταση ορού και την επακόλουθη απελευθέρωση των προσδεμένων αντισωμάτων με μικρό όγκο διαλύματος χαμηλού pH, τα οποία στη συνέχεια ανιχνεύονται και τιτλοδοτούνται με απλή RIPA με τη χρήση 125I-σημασμένων αντιγόνων. Δηλαδή χρησιμοποιήθηκε η αρχή του καθαρισμού με χρωματογραφία συγγένειας με όχι αυστηρό αλλά με απλό και εύκολο τρόπο, προκειμένου να εμπλουτισθεί ο ορός σε μεγάλο βαθμό στα ειδικά για το αντιγόνο αντισώματα πριν από τον προσδιορισμό και την τιτλοποίηση τους με τις συνήθεις ανοσολογικές δοκιμασίες. Έγινε προσπάθεια ανάπτυξης της προσέγγισης αυτής για την ανίχνευση αντισωμάτων έναντι του AChR και έναντι της MuSK. Έγιναν πολλές προσπάθειες για την εφαρμογή της για την ανίχνευση αντί-AChR αυτοαντισωμάτων. Σημειώθηκε μεγάλη πρόοδος, αλλά απαιτούνται επιπρόσθετες βελτιώσεις για την εφαρμογή της στην διάγνωση ρουτίνας. Για την ανίχνευση των αντί-MuSK αυτοαντισωμάτων με την προσέγγιση αυτή επετεύχθη σημαντικότερη βελτίωση. Η παρούσα συστηματική προσέγγιση απεδείχθη τουλάχιστον 20-50 φορές περισσότερο ευαίσθητη από την κλασική RIPA. Όλοι οι οροί οι οποίοι είχαν χαρακτηρισθεί προηγουμένως ως θετικοί ή αρνητικοί με την κλασική RIPA βρέθηκαν όπως αναμενόταν επίσης θετικοί ή αρνητικοί αντίστοιχα. Επιπλέον όμως μερικοί εκ των ορών οι οποίοι στο παρελθόν είχαν χαρακτηρισθεί ως αμφίβολοι βρέθηκαν σαφώς θετικοί, ή μερικοί άλλοι οι οποίοι είχαν χαρακτηρισθεί ως αρνητικοί αλλά παρουσίαζαν τίτλους ελαφρά υψηλότερους του μηδενός, αλλά όχι στατιστικά σημαντικούς ώστε να αξιολογηθούν ως υψηλότεροι του υπόβαθρου, βρέθηκαν θετικοί, ενώ άλλοι εξακολουθούν να παραμένουν αρνητικοί. Η δοκιμασία που αναπτύξαμε ήταν αρχικά περισσότερο επίπονη από ότι η κλασική RIPA, αλλά με την ανάπτυξη σημαντικών βελτιώσεων, η διαδικασία αυτή έχει απλουστευθεί ώστε να είναι δυνατός ο ταυτόχρονος έλεγχος μεγάλου όγκου (0,1-1 ml) πολλαπλών δειγμάτων ορών και έχει καταστεί δυνατή η χρήση της στην καθημερινή διάγνωση. Η βελτιωμένη αυτή μέθοδος εφαρμόζεται σήμερα για την ανίχνευση αντί-MuSK αντισωμάτων και αποσκοπεί στην ανίχνευση πολύ μικρών ποσοτήτων αυτοαντισωμάτων στον ορό των μυασθενικών οι οποίοι έχουν χαρακτηρισθεί ως οροαρνητικοί ή αμφίβολοι. / Myasthenia Gravis (MG), is an autoimmune disease, characterized by impairment in neurotransmission at the neuromuscular junction level. The diagnosis of MG is based on clinical symptomatology, assisted by pharmacological, electrophysiological and imaging tests and is usually confirmed by serological detection of autoantibodies to components of the neuromuscular junction. The available diagnostic tests are usually able to detect the presence of antibodies in 85-90% of myasthenic patients with generalized MG and 50% of patients with ocular MG. This gap in the diagnosis of MG creates a major problem in most cases during diagnosis because a negative result (which is the most common result in ordinary laboratory diagnosis of MG) leaves an ambiguity regarding the existence of MG. Even a very low titer of specific antibodies, would be sufficient to explain the presence of myasthenia, since there has been no significant correlation between the titer of antibodies and the severity of disease among patients. Therefore, there is increasing need for the development of highly sensitive diagnostic methods for the unambiguous confirmation of the disease. The most sensitive diagnostic test so far, is the radiological immunoprecipitation assay (Radioimmunoprecipitation, RIPA) and the most important limiting factor for detecting low antibody titer, is the inability to use large volumes of serum (maximum is ~ 5- 20 ml), which would require the subsequent use of high-volume of anti-serum, which will result in excessively large immuno-sediments, which in turn are associated with unacceptable levels of nonspecific background values. With the development of two-step RIPA assay in this study we have largely overcome these problems. This test is based on the immobilization of target antigen to an insoluble substrate, followed by incubation with large volume (eg 0,1-1ml) of the test serum and release of bound antibodies with small volume of low pH solution, which are then detected and titrated with simple RIPA using 125I-labeled antigens. We used the principle of enrichment of serum to a large extent in antigen-specific antibodies by affinity purification with no strict but simple and easy way, before the final identification and titration of specific antibodies with standard immunoassays. We attempted the development of this approach in order to detect antibodies against AChR and MuSK. Numerous efforts have been made to implement this method in order to detect AChR autoantibodies, but although there was substantial progress, additional improvements are required for its application in routine diagnosis. With this approach we achieved significant improvement for detection of anti- MuSK autoantibodies. This systematic approach was proved to be at least 20-50 times more sensitive than classical RIPA. All sera which were previously classified as positive or negative with standard RIPA were also positive and negative respectively, as expected. In addition some of the sera which were previously classified as ambiguous were clearly positive and some others who were classified as negative but were slightly higher than zero, but not statistically significant so as to assess them as higher than the background, were positive, while others still remain negative. This newly developed test was originally more laborious than the classical RIPA, but with the development of significant improvements, the process has been simplified and allows the simultaneous testing of large volumes (0,1-1 ml) of multiple serum samples and its use has been made possible in everyday diagnosis. This improved method is currently applied to detect anti-MuSK antibodies and is designed to detect very small amounts of autoantibodies in the serum of myasthenic patients who are classified as seronegative or ambiguous.

Dans ce travail, la variabilité de la composition phénolique et des activités antioxydantes de 5 espèces extrêmophiles tunisiennes (T. gallica, L.guyonianum, M. edule, P. equisetiforme et P. laevigata) a été étudiée. Les résultats ont montré que T. gallica est la plus riche en polyphénols totaux et que M. edule possède le contenu les plus élevé en flavonoïdes. En outre, la plus forte teneur en tanins condensés est trouvée chez P. equisetiforme. L. guyonianum s’est distinguée par son potentiel antioxydant puissant. L’analyse par CLHP a dévoilé la présence de l’acide rosmarinique, et des 2 flavonoïdes catéchine et isorhamnétine-3-O-rutinoside dans l’extrait de T. gallica. Les flavonoïdes majoritaires identifiés chez L.guyonianum sont la quercétine, la catéchine et l’isorhamnétine-3-O-rutinoside. L’étude a également montré que les extraits de T. gallica (TGE) et de L. guyonianum (LGE) exercent un effet cytoprotecteur sur les cellules IEC-6 stimulées par le H2O2. Le prétraitement avec TGE ou LGE à 0,25 μg.ml-1 a entrainé la restauration de la morphologie normale des IEC-6 et l'amplification de leur prolifération. En présence deTGE, l'activité CAT a été normalisée et la teneur en MDA a diminué. Alors qu’en présence de LGE, l’activité SODT a été améliorée et le pool cellulaire en GSH a augmenté. En outre, TGE et LGE ont induit la déphosphorylation de la JNK-MAPK pour réduire la mort cellulaire. D’un autre côté, l’effet préventif de l’administration de TGE et de LGE sur les dommages oxydatifs induits par le sepsis a été démontré. Dans les groupes de rats prétraités avec TGE et LGE, la perte de poids a diminué et le taux de survie a augmenté.Dans le groupe T30, l'activité SODT des EDL et des SOL a été significativement plus élevée que celle du groupe septique. Dans le même groupe T30, l’activité Mn-SOD des EDL et des SOL a été supérieure par rapport à l'isoforme SODT. Dans les groupes L300 et L30, l’activité CAT des EDL, des DIA et des SOL a été supérieure à celle du groupe septique. Les taux de GSH plasmatique ont augmenté dans les groupes T300 et L30. Dans les groupes L300 et T30, les activités AST et ALT ont diminué par comparaison au groupe S. En conclusion, l’administration des extraits de T. gallica et de L. guyonianum améliorent les capacités antioxydantes des muscles squelettiques et respiratoires, et préviennent les lésions hépatiques chez les rats septiques. / In this work, the variability of phenolic composition and antioxidant activities of 5 Tunisian extremophilic species (T. gallica, L. guyonianum, M. edule, P. equisetiforme and P. laevigata) was studied. Main results showed that T. gallica was the richest in total polyphenols. M. edule had the highest flavonoids content. In addition, the highest condensed tanins content was found in P. equisetiform.L. guyonianum was distinguished by its powerful antioxidant potential. HPLC analysis showed that T. gallica contained essentially rosmarinic acid, and the 2 flavonoids catechin and isorhamnetin-3-Orutinoside.The major flavonoids identified in L. guyonianum are quercetin, catechin, and isorhamnetin-3-O-rutinoside. The study showed that extracts of T. gallica (TGE) and L. guyonianum (LGE) exerted a cytoprotective effect on H2O2-stimulated IEC-6 cells. Pretreatment with TGE or LGE at 0.25 μg.ml-1 resulted in the re-establishment of normal cell morphology and the amplification of cell proliferation. In the presence of TGE, CAT activity was normalized and MDA content decreased. In the presence of LGE, SODT activity was improved and the GSH content increased. TGE and LGE induced JNK dephosphorylation to reduce cell death. In addition, the preventive effect of TGE and LGE administration on sepsis-induced oxidative damage was demonstrated. In TGE and LGE pretreated groups, weight loss decreased and survival rate increased. In T30 group, SODT activity of EDL and SOL was higher than those of the septic group. In the same group T30, Mn-SOD activities of EDL and SOL were higher than SODT. In L300 and L30 groups, CAT activities of EDL, DIA and SOL were higher than those of the septic group.Plasma GSH levels increased in the T300 and L30 groups. AST and ALT activities decreased in L300 and T30 groups. Altogether, the administration of T. gallica and L. guyonianum extracts improves the antioxidant capacities of skeletal and respiratory muscles and prevents hepatic injury in septic rats.

Σκοπός: Η θυμεκτομή αποτελεί κοινώς αποδεκτή θεραπεία της μυασθένειας με τις διάφορες προσπελάσεις να αναφέρονται ως ανάλογης αξίας για την επίτευξη ύφεσης της νόσου. Έχοντας πλέον την μόνιμη σταθερή ύφεση ως καθαρή και μετρήσιμη νευρολογική έκβαση των μυασθενικών ασθενών μετά θυμεκτομή και γνωρίζοντας ότι η ύφεση της νόσου αποτελεί χρόνο-εξαρτώμενο γεγονός, πραγματοποιήσαμε μια αναδρομική μελέτη των ασθενών με μυασθένεια που αντιμετωπίστηκαν χειρουργικά με σκοπό τον πιο αξιόπιστο καθορισμό του ρόλου των μεγίστων θυμικών εκτομών και την ταυτοποίηση προγνωστικών παραγόντων για ύφεση της νόσου μετά θυμεκτομή. Υλικό και μέθοδος. Η μελέτη περιλαμβάνει 78 ασθενείς που υποβλήθηκαν σε τροποποιημένη μέγιστη θυμεκτομή από το 1990 έως το 2007. Οι ενδείξεις θυμεκτομής περιελάμβαναν: οφθαλμική μυασθένεια ανθιστάμενη στη φαρμακευτική αγωγή, γενικευμένη μυασθένεια και μυασθένεια με θύμωμα. Τα στοιχεία που συλλέχθηκαν αφορούσαν τη βαρύτητα της νόσου (τροποποιημένη Osserman ταξινόμηση), την προεγχειρητική φαρμακευτική αγωγή, την ηλικία έναρξης της νόσου (≤ 40/ > 40 έτη), το χρονικό διάστημα που μεσολάβησε από τη διάγνωση στη θυμεκτομή (≤ 12/ > 12 μήνες), το φύλο, την ιστολογία του θύμου αδένα, τη θνητότητα και τις επιπλοκές. Στους ασθενείς με θύμωμα περαιτέρω στοιχεία που ελήφθησαν υπόψη αφορούσαν τον ιστολογικό τύπο του θυμώματος κατά την Παγκόσμια Οργάνωση Υγείας και το στάδιο του όγκου κατά Masaoka. Η εκτίμηση της νευρολογικής έκβασης στο τέλος του μετεγχειρητικού follow up έγινε βάση της νέας ταξινόμησης του Αμερικανικού Ιδρύματος για τη Βαρεία Μυασθένεια με την πλήρη σταθερή ύφεση να λαμβάνεται υπόψη για τον καθορισμό της επάρκειας της διενεργηθείσας εκτομής και για τη σύγκριση των αποτελεσμάτων μας με αυτά προηγουμένων μελετών. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων έγινε με το SPSS 17 και αφορούσε δύο ομάδες ασθενών ανάλογα με την παρουσία ή μη θυμώματος. Η μέθοδος Kaplan-Meier χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση της επίπτωσης των υπό εκτίμηση προγνωστικών παραγόντων στην επίτευξη της πλήρους ύφεσης ενώ η Cox Regression ανάλυση αποτέλεσε το μοντέλο για την ανάλυση της ταυτόχρονης επίδρασης των υπό μελέτη παραμέτρων στην επίτευξη πλήρους σταθερής ύφεσης. Τιμές του p < 0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. Αποτελέσματα: 51 ασθενείς είχαν μυασθένεια χωρίς θύμωμα και 27 ασθενείς παρανεοπλασματική μυασθένεια. Δεν υπήρχαν στατιστικά σημαντικές διαφορές στα προεγχειρητικά κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών πλην της αναμενομένης εμφάνισης της νόσου σε απώτερη ηλικία στους ασθενείς με θύμωμα. Η θνητότητα ήταν μηδενική ενώ η χειρουργική νοσηρότητα, ανάλογη προηγουμένων μελετών θυμεκτομής με διαφορετικού τύπου προσπέλασεις, ανήλθε στο 7,7% και ήταν ως επί το πλείστον ήσσονος σημασίας. Το ποσοστό μετεγχειρητικής μυασθενικής κρίσης ήταν μόλις 3,8%. Οι ασθενείς με μυασθένεια και θύμωμα βίωσαν όψιμη νευρολογική έκβαση ανάλογη αυτής των ασθενών χωρίς θύμωμα (πιθανότητα ύφεσης 74,5% vs 85,7%, p= 0.632). Η μη χρήση στεροειδών στην προεγχειρητική φαρμακευτική αγωγή, ως έμμεσος δείκτης της βαρύτητας της νόσου, σχετίστηκε με στατιστικά καλύτερη πιθανότητα για πλήρη ύφεση των συμπτωμάτων τόσο στους ασθενείς με θύμωμα (95% CI 2.687-339.182, p= 0.006) όσο και σε αυτούς χωρίς θύμωμα (CI 95% 1.607-19.183, P= 0.007) στην πολυπαραγοντική ανάλυση. Αξιόλογη διαφορά, αν και στατιστικά μη σημαντική, για τη έκβαση της νόσου είχε η πρώιμη σε σχέση με την απώτερη χειρουργική αντιμετώπιση των ασθενών. Στη σύγκριση των 27 ασθενών με μυασθένεια και θύμωμα με 12 επιπλέον ασθενείς που υποβλήθηκαν στην ίδια επέμβαση για θύμωμα άνευ μυασθένειας η παρουσία των συμπτωμάτων μυϊκής αδυναμίας συνδυάστηκε με στατιστικά σημαντική βελτίωση της επιβίωσης των ασθενών (100% vs 38,8% στη 10ετία, p< 0.001). Στους ασθενείς με μυασθένεια χωρίς θύμωμα και απώτερης ηλικιακά έναρξης της νόσου το ποσοστό σημαντικής βελτίωσης των μυασθενικών συμπτωμάτων, εξαιρουμένης της πλήρους ύφεσης, ήταν 70%. Στους ασθενείς με μυασθένεια και θύμωμα η ιστολογική ταυτοποίηση των θυμωμάτων κατά την Παγκόσμια Οργάνωση Υγείας προέκυψε στατιστικά σημαντική τόσο στην μονοπαραγοντική όσο και στην πολυπαραγοντική ανάλυση με τα θυμώματα τύπου Β2, Α και Β3 να επιτυγχάνουν από πολύ καλή έως άριστη πιθανότητα πλήρους ύφεσης και τα θυμώματα τύπου ΑΒ, Β1 και C να έχουν απογοητευτική έκβαση όσον αφορά την ίαση. Συμπεράσματα: Η παρούσα μελέτη δείχνει ότι η τροποποιημένη μεγίστη θυμεκτομή είναι ασφαλής και σχετίζεται με υψηλή πιθανότητα για ίαση των μυασθενικών ασθενών με και χωρίς θύμωμα. Οι ασθενείς πρέπει να αντιμετωπίζονται χειρουργικά πρώιμα μετά τη διάγνωση με κυριότερο προγνωστικό παράγοντα για το απώτερο νευρολογικό αποτέλεσμα την προεγχειρητική βαρύτητα της νόσου. Η ασφαλής και πιο αξιόπιστη εκτίμηση της τελευταίας απαιτεί πιο αντικειμενικά κριτήρια όπως αυτά που θεσπίστηκαν από το Αμερικανικό Ίδρυμα για τη Βαρεία Μυασθένεια. Η ενσωμάτωση σε αυτά τα κριτήρια μοριακών παραμέτρων που φαίνεται να επηρεάζουν την πρόγνωση της νόσου, ενδεχόμενα να βελτιώσουν την αξιοπιστία της κλινικής σταδιοποίησης του MGFA και να αναδείξουν υποομάδες ασθενών με διαφορετική νευρολογική πρόγνωση μετά από θυμεκτομή. Επίσης η πρώιμη διάγνωση των θυμωμάτων εξαιτίας των συνυπαρχόντων μυασθενικών συμπτωμάτων μπορεί να οδηγήσει σε καλύτερη επιβίωση τους συγκεκριμένους ασθενείς. Τέλος η νευρολογική έκβαση των ασθενών με θυμωματώδη μυασθένεια σχετίζεται με τον ιστολογικό τύπο των θυμωμάτων, αλλά όχι αναγκαία και με την κακοήθη συμπεριφορά τους. / Objective: Thymectomy represents a widely accepted treatment for myasthenia gravis with different surgical approaches reported as comparably efficient in achieving disease’s remission. With the complete stable remission being currently accepted as a clear measurable outcome of patients with myasthenia undergoing surgical treatment and the knowledge that disease’s remission should be evaluated as a time dependent event we proceeded to a retrospective analysis of our experience on the surgical management of myasthenic patients. The objective was to access the effect of maximal resection on the neurological outcome and identify predictors of disease remission. Materials and methods: The study group consisted of 78 patients who underwent modified maximal thymectomy for myasthenia from 1990 to 2007. Indications for thymectomy included: ocular myasthenia refractory to medical treatment, generalized myasthenia and thymomatous myasthenia. The data collected included preoperative disease’s severity (modified Osserman classification), preoperative medical treatment, age at onset of the disease (≤ 40/ > 40 years), time elapsed between diagnosis and thymectomy (≤ 12/ > 12 months), gender, thymus gland histology, mortality and morbidity. In thymoma patients further analysis was carried out according the World Health Organization histological classification and the Masaoka stage of the tumors. The evaluation of the neurological outcome at the end of follow up was performed according the Myasthenia Gravis Foundation of America classification. Both the effectiveness of the resection performed and the comparison of our results with those of previous studies were done using the complete stable remission as the end point of the study. The statistical analysis of the results was carried out using the SPSS 17. Kaplan-Meier life table analysis was performed and the log rank test was used to evaluate the effect of the variables examined on the distribution of disease’s remission over time. The Cox proportional hazard model was also applied to verify the concurrent effect of the evaluated factors on the achievement of complete stable remission. P values < 0.05 were considered statistically significant. Results: 51 patients suffered of non thymomatous myasthenia while 27 patients had myasthenia with thymoma. The two groups were comparable in refer to the clinical features of the patients apart the more advanced age at the time of the diagnosis for thymoma patients. There was no perioperative mortality, while the surgical morbidity was comparable to the one reported in other series of patients with different surgical approaches and was 7.7%. The rate of postoperative myasthenic crisis was only 3.8%. Thymoma and non thymoma patients experienced comparable complete stable remission prediction (74.5% vs 85.7% at 15 years, p= 0.632). The absence of steroids in the preoperative medical regimen was statistically associated with the achievement of complete stable remission in both thymoma (95% CI 2.687-339.182, p= 0.006) and non thymoma patients (CI 95% 1.607-19.183, P= 0.007) in multivariate analysis. There was an important difference, although not statistically significant, for the neurological outcome between early and late surgical treatment. When the 27 patients with myasthenia and thymoma were compared with other 12 patients similarly operated for thymoma without symptoms and signs of muscular weakness we found that the presence of myasthenia was statistically associated with improved survival (100% vs 38.8% at 10 years, p< 0.001). Non thymoma patients presenting with late onset myasthenia, experienced high improvement (complete stable remission excluded) rate reaching up to 70% at the end of follow up. Among patients with thymomatous myasthenia gravis the World Health Organization histological classification was statistically associated with the late neurological outcome. Thymoma types A, B3 and B2 reached a high to excellent prediction of disease’s remission while types AB, B2 and C had a disappointing neurological outcome. Conclusons: The present study demonstrated that the modified maximal thymectomy is a safe procedure, associated with an excellent neurological outcome in both thymomatous and non thymomatous myasthenia. The patients should be operated early after the diagnosis is made with the disease’s severity being the prime determinant of the possibility to achieve complete remission of myasthenic symptoms. The evaluation of disease’s severity requires objective criteria like the ones proposed by the Myasthenia Gravis Foundation of America. The inclusion in these criteria of molecular markers related to myasthenia’s prognosis and its neurological outcome after thymectomy may further enhance its validity and may allow the identification of subgroups of patients with different disease prognosis after thymectomy. The presence of muscular weakness may lead to early diagnosis and surgical treatment of thymomas with improved survival. Finally the neurologic outcome in thymoma patients after thymectomy may be statistically associated with the World Health Organization classification subtypes but not necessarily with the aggressiveness of these tumors.