El desenvolupament de bioprocessos productius reproduïbles i escalables s'ha convertit en un dels colls d'ampolla a mesura que es consolida l'obtenció de proteïnes recombinants. Per poder superar-ho, la FDA i la EMEA han posat en marxa la iniciativa Process Analytical Technologies (PAT) que cerca el desenvolupament de processos productius eficients i controlats i que serveix de marc pel desenvolupament del present treball.El treball desenvolupat te com a objectiu el desenvolupament i implementació d'eines que permetin monitoritzar i controlar els processos de producció amb el llevat metilotròfic P. pastoris. Aquest objectiu es materialitza en forma de un desenvolupament d'eines per la correcta monitorització de paràmetres i variables associats al procés productiu, com són el desenvolupament d'un sistema automàtic de presa de mostra, el desenvolupament d'eines per a l'eliminació d'interferències per un sensor en línea de metanol, el desenvolupament d'un sistema en línea de compostos amínics i el desenvolupar un software sensor que permeti determinar en línea la velocitat específica de creixement de P. pastoris en base a un algoritme d'identificació RLS. A més a més, s'ha implementat un sistema de control per a poder analitzar l'efecte de la concentració de metanol en una soca de fenotip Mut+ de P. pastoris sobre la productivitat del procés productiu i posteriorment s'ha avaluat l'efecte de la utilització de substrats mixtes per a la producció de proteïnes recombinants pels fenotips Muts i Mut+ de P. pastoris.Paraules clauDiscontinu alimentat, Pichia pastoris, substrats mixtes, bioprocés, control, optimització, RLS / El desarrollo de bioprocesos productivos reproducibles y escalables se ha convertido en uno de los cuellos de botella a medida que se consolida la obtención de proteínas recombinantes. Para poder superarlo, la FDA y la EMEA han puesto en marcha la iniciativa Process Analytical Technologies (PAT) que busca el desarrollo de procesos productivos eficientes y controlados y que sirve de marco para el desarrollo del presente trabajo.El trabajo desarrollado tiene como objetivo el desarrollo e implementación de herramientas que permitan monitorizar y controlar los procesos de producción de la levadura metilotrófica P. pastoris. Este objetivo se materializa en forma de un desarrollo de herramientas para la correcta monitorización de parámetros y variables asociadas al proceso productivo, como son el desarrollo de un sistema automático de toma de muestra, el desarrollo de herramientas para la eliminación de interferencias para un sensor en línea de metanol, el desarrollo de un sistema en línea de medida de la concentración de compuestos amínicos y el desarrollo de un software sensor que permita determinar en línea la velocidad específica de crecimiento de P. pastoris en base a un algoritmo de identificación RLS. Además, se ha implementado un sistema de control para poder analizar el efecto de la concentración de metanol en una cepa de fenotipo Mut+ de P. pastoris sobre la productividad del proceso productivo y posteriormente se ha evaluado el efecto de la utilización de sustratos mixtos en la producción de proteínas recombinantes para los fenotipos Muts y Mut+ de P. pastoris.Palabras ClaveDiscontinuo alimentado, Pichia pastoris, substratos mixtos, bioproceso, control, optimización, RLS / The development of reproducible and scalable productive bioprocesses has become one of the bottlenecks for the production of recombinants proteins. In order to overcome it, the FDA and the EMEA have started off the Process Analytical Technologies (PAT). That initiative looks for the development of efficient and controlled productive processes and is in this concept where the present work is framed.The goal of this experimental work is the development and implementation of tools that allow monitorization and control of P. pastoris production processes.This goal is materialized with the creation and implementation of tools for the correct monitorization of parameters and state variables of the productive process, such as the development of an automatic sampling system, the development of tools for the elimination of interferences of an on-line methanol sensor, the development of an amine compounds analyzer and the development of a sensor software that allows to gauge the specific growth rate of P. pastoris using a RLS identification algorithm. Moreover, a methanol control system has been implemented for analyzing the effect of the substrate concentration in the productivity on a P. pastoris (phenotype Mut+) culture. And finally it has been analyzed the effect of mixed substrate strategy in Muts and Mut+ phenotypes of P. pastoris for the production of recombinant proteins. Key wordsFed-batch, Pichia pastoris, mixed substrates, bioprocess, control, optimization, RLS.

En aquest treball s'exposen dues línies de recerca centrades en el procés de producció d'una lipasa de Rhizopus oryzae (ROL) en Pichia pastoris: la utilització de diferents tècniques de monitoratge i l'aplicació d'estratègies de cultiu que permetin millorar la producció de la ROL en una soca Mut+ d'aquest sistema d'expressió. En els cultius discontinus alimentats amb P. pastoris cal disposar d'una mesura en línia i en temps real de la concentració de substrat, el metanol. Per això es va desenvolupar un analitzador d'injecció seqüencial. Es va comprovar que aquest té una freqüència d'anàlisi òptima per a cultius amb la soca Muts però baixa per a la soca Mut+. Amb aquesta última soca, es van utilitzar i comparar dos mesuradors comercials en fase gas. Es va avaluar també la fluorimetria com a tècnica de monitoratge per a la determinació de tres variables clau: la biomassa, el substrat (glicerol/metanol) i la proteïna recombinant.Inicialment es va fer un seguiment de l'evolució de la biomassa a partir del senyal de fluorescència off-line del triptòfan. Es pot predir la biomassa correctament però es van evidenciar diferents desavantatges: la necessitat de dilució de les mostres i d'un sistema de presa de mostra específic. Per això es va decidir aplicar i avaluar la fluorimetria multivariable in situ. Amb la utilització d'una sonda fluorimètrica in situ, combinada amb mètodes quimiomètrics de tractament de dades multivariables, es va aconseguir predir la biomassa i el substrat a partir de la determinació del senyal de diversos fluoròfors. No es va aconseguir una bona predicció de la producció de ROL. Per millorar el seguiment de la proteïna, es va fusionar a la GFP. Es van detectar dos inconvenients: els nivells de producció disminuïen respecte a la producció de ROL únicament i la riboflavina, que Pichia excreta al medi, interferia amb el senyal de fluorescència del mutant de GFP escollit. Tant amb la filtració de la mostra abans de la determinació del senyal de GFP com si s'hagués escollit un mutant de GFP amb emissió més allunyada de la riboflavina es podria haver evitat aquest inconvenient i fer un seguiment de la ROL excretada. Es pot seguir la ROL intracel·lular.Quant a la producció de la ROL, es va estudiar l'efecte del nivell de metanol residual en cultius discontinus alimentats amb la soca Mut+. Existeix una concentració òptima entorn els 2.5 g·l-1 de metanol al medi. A concentracions superiors es va apreciar inhibició per substrat. Es va observar un fenomen de limitació per transferència d'oxigen al final del cultiu i una important disminució de la viabilitat cel·lular.Per això, es van avaluar estratègies de cultiu alternatives. Primer es va aplicar una estratègia de metanol limitant (MLFB) per evitar la limitació d'oxigen al final d'un cultiu a 2.5 g·l-1 de metanol residual (MNLFB). Es va millorar la productivitat un 40%. En segon lloc, es va aplicar una estratègia de temperatura limitant per avaluar el seu efecte sobre la producció. No es van millorar els resultats. Finalment, es va aplicar una estratègia MNLFB a 2.5 g·l-1 de metanol però amb un medi amb una menor osmolaritat i una fase final amb limitació de temperatura per evitar la limitació d'oxigen. Es va aconseguir reduir la mortalitat cel·lular però la productivitat disminuïa respecte el cultiu on s'aplica una fase de MLFB al final de la inducció. Tot i això, es va obtenir un producte final un 30% més pur en quant a activitat lipolítica respecte la proteïna total. Posteriorment es va procedir a escalar la producció en planta pilot. Es va observar limitació en la transferència d'oxigen en fases inicials de la inducció. Això va originar l'aparició d'un subproducte, associat a una reducció en la producció de ROL extracel·lular. En millorar la transferència d'oxigen es va minimitzar aquesta limitació i va millorar la producció. No es van aconseguir els mateixos nivells de productivitat que a escala laboratori però es continua treballant en la millora de la transferència de matèria per assolir-los. / In this work two research lines, applied to the production of a Rhizopus oryzae lipase (ROL) in Pichia pastoris, are shown: the application of different monitoring and cultivation techniques to improve ROL production in a P. pastoris Mut+ strain.During P. pastoris fed-batch cultures, methanol needs to be on line measured and monitored in real time. For this purpose, a sequential injection analyzer was developed. Although it presented a suitable analysis frequency for a Muts strain it was too low for a Mut+ strain. When the later was used, two different methanol commercial sensors in the outlet gas steams were utilized and compared. Fluorometry was also evaluated as a monitoring technique for three key variables: biomass, substrate (glycerol/methanol) and recombinant protein. Initially, biomass was followed by the off-line determination of tryptophan's fluorescence. Biomass was correctly predicted with this system but different disadvantages appeared: the need of a sample dilution procedure and a specific sampling device. Therefore, multivariable in situ fluorometry was subsequently evaluated. By means of an in situ multivariable fluorimetric probe, combined with chemometric methods to data processing, biomass and substrate prediction was properly achieved. ROL production could not be satisfactorily estimated.To improve ROL monitoring, it was fusioned to the green fluorescent protein (GFP). Two main disadvantages were found: production levels were lower when compared to solely ROL expression and riboflavin, naturally excreted by the yeast, interfered to GFP's signal. This problem could be solved with sample filtration prior to GFP's measurement and also if a different GFP mutant had been chosen with emission signal further to riboflavin's.With respect to ROL production, the effect of methanol concentration was studied in Mut+ fed-batch cultures. There is an optimal methanol concentration about 2.5 g·l-1. Substrate inhibition was observed at higher methanol levels. Oxygen transfer limitation at the end of the induction phase and an important cell viability decrease were also found. Therefore, alternative culture techniques were evaluated. First a methanol limited fed-batch phase (MLFB) was applied when oxygen limitations appeared at the end of a 2.5 g·l-1 methanol fed-batch phase (MNLFB). Productivity increased up to 40% with this strategy. Secondly, a temperature limited fed-batch was applied. No better results were obtained compared to the reference MNLFB culture. Finally, a 2.5 g·l-1 methanol fed-batch was applied with a lower salt content medium and a final temperature limited phase when oxygen limitation appeared. Cell death was reduced but productivity decreased with respect to the reference MNLFB culture. However, a 30% purer lipase was obtained in terms of lipase activity to total protein.Thereafter, the scaling of the production process in a pilot plant was evaluated. Oxygen limitation was found in the early induction phase. This caused a byproduct secretion associated to a ROL production decrease. When oxygen transfer was enhanced, byproduct secretion was reduced and ROL production improved. Similar laboratory scale productivities were not achieved but oxygen mass transfer is being further enhanced to reach the objective levels.

En les últimes dues dècades, la teràpia gènica ha permès plantejar noves aproximacions en l'àmbit de la medicina personalitzada. Es troba orientada a guarir malalties actualment incurables i/o a millorar ostensiblement la qualitat de vida dels pacients, gràcies a la introducció de material genètic al nucli de la cèl·lula diana per permetre, augmentar o suprimir l'expressió d'un gen específic amb finalitat terapèutica. El vector és l'agent que juga el paper cabdal en aquest mecanisme. D'entre els possibles tipus (virals i no virals), destaca el vector adenoviral per la seva preeminència en els actuals assajos preclínics amb humans i per la necessitat de proveir demandes de mercat importants. El present treball aborda el desenvolupament complet d'un bioprocés per a l'obtenció de vectors adenovirals per a teràpia gènica: estudia els diferents aspectes que conformen el bioprocés, i analitza la implementació a escala industrial de la millor alternativa possible. Com a punt de partida, es realitzen estudis previs per conèixer la interacció dels vectors adenovirals amb les línies cel·lulars productores existents. S'aprofundeix en les tècniques de cultiu de dos candidats cel·lulars concrets: HEK293 (adherent) i HEK293S (no adherent). A partir de la infecció d'ambdós amb el vector adenoviral, es caracteritzen els principals paràmetres del cicle infectiu, els quals permeten concloure que la línia cel·lular HEK293S resulta més apropiada en base a una major productivitat. Aquestes dades proporcionen la base per desenvolupar l'etapa de producció del bioprocés. Aquesta s'estructura entorn als tres factors fonamentals que descriuen la bioreacció (el monitoratge, l'estratègia i el sistema de producció), els quals s'analitzen en profunditat. Es demostra la validesa del mètode de la velocitat de consum d'oxigen (OUR) per realitzar el monitoratge en línia de l'activitat cel·lular durant les fases de creixement i d'infecció. Posteriorment, es decideix avaluar dues estratègies de producció: l'estratègia en discontinu (estratègia de referència) i l'estratègia en continu amb perfusió (estratègia que proporciona les condicions el més semblants possibles a les que tindria la cèl·lula in vivo). Finalment, s'apliquen els anteriors factors en l'anàlisi del sistema de producció, en concret, amb la utilització de dues alternatives: l'anomenat sistema convencional (bioreactor de tanc agitat Biostat Bplus) i el sistema no convencional (bioreactor basat en tecnologia d'un sol ús Wave Bioreactor). A partir dels resultats obtinguts, es pot constatar que l'estratègia de producció en continu amb perfusió proporciona elevades concentracions cel·lulars, incrementant-se també tant la productivitat com la concentració vírica final. D'altra banda, també es posen de manifest els avantatges operacionals del sistema de cultiu no convencional, encara que sacrificant la possibilitat d'utilitzar la mesura de la velocitat de consum d'oxigen (OUR). Per tal de completar el treball, es desenvolupa l'etapa de purificació del bioprocés. En aquesta s'analitzen les propietats del producte i del brou de cultiu, i s'avaluen dues estratègies de purificació. Aquestes es diferencien fonamentalment per la seva possibilitat de facilitar el canvi d'escala, de manera que es designen com a estratègia de purificació no escalable (basada en la ultracentrifugació) i escalable (basada en la cromatografia). La primera és comunament emprada a escala de laboratori; donat que es recull específicament la banda de densitat que conté el vector adenoviral, s'implementa per obtenir material amb una elevada puresa que serveixi com a referència a l'hora de comparar els resultats obtinguts amb l'estratègia escalable. Per portar a terme aquesta última, es dissenyen les operacions que la integren, i es determinen els paràmetres de purificació, entre ells el rendiment global de recuperació del producte final. Posteriorment, es realitza la caracterització del producte per determinar el seu grau de puresa. Els resultats obtinguts deixen palès que l'estratègia escalable presenta un rendiment global superior al de la no escalable, tot i que el grau de puresa aconseguit és inferior. Les dades experimentals, tant de la producció com de la purificació, permeten disposar de quatre alternatives amb l'objectiu d'analitzar la potencial implantació del bioprocés a escala industrial. El disseny i la comparació de les mateixes es realitza d'acord amb el seu dimensionament seguint unes bases de disseny comunes, i la seva valoració final es projecta en termes econòmics. A partir dels resultats obtinguts, l'alternativa més aconsellable d'ésser portada a la pràctica és la basada en el bioprocés integrat pel sistema de producció no convencional operant en continu amb perfusió. Aquesta memòria s'estructura, doncs, de manera que inicialment es fa una introducció (capítol 2), on es revisen les característiques de la teràpia gènica, dels vectors adenovirals i de les línies cel·lulars productores, així com del bioprocés i de l'estricta normativa de producció GMP que el regeix. Seguidament (capítol 3), es plantegen els principals objectius del treball. A continuació (capítol 4), es concentren els estudis previs que caracteritzen tant la línia cel·lular productora com la infecció amb el vector adenoviral. Al capítol 5, es presenta el desenvolupament de l'etapa de producció del bioprocés. Anàlogament, en el capítol 6, es desenvolupa l'etapa de purificació del mateix. En el capítol 7, es realitza l'anàlisi de procés de les alternatives sorgides. En el capítol 8, s'exposen les principals conclusions extretes del treball. Finalment, es presenten els materials i mètodes emprats (capítol 9), i s'afegeix l'apèndix (capítol 10), on es complementen alguns aspectes concrets d'aquest treball. / For the last two decades, gene therapy has allowed to bring up new approaches in personal medicine. Its goal is to cure illnesses through the introduction of genetic material to the nucleus of a target cell in order to allow, increase or suppress the expression of a specific gene with therapeutic purpose. The vector is the agent that plays the principal role in this mechanism. Among the possible types (viral and non viral), the adenoviral vector is one of the most important due to its pre-eminence in the current preclinical human assays. The present work achieves the complete development of a bioprocess for the obtention of adenoviral vectors for gene therapy: it studies the different aspects that conform the bioprocess, and analyzes the industrial implementation of the best alternative. As a starting point, previous studies are carried out for knowing the interaction of the adenoviral vectors with the existing producing cellular lines. Techniques are studied for culturing two cellular candidates: HEK293 (adherent) and HEK293S (non adherent). From the infection of both with the adenoviral vector, main parameters of the infective cycle are characterized, which allow to conclude that the cellular line HEK293S is more appropriate due to its higher productivity. These data provide the basis to develop the production of the bioprocess. This stage is based on the study of three fundamental factors that describe bioreaction (monitoring, culture strategy and production system), which are deeply analyzed. The oxygen uptake rate (OUR) method is developed to monitor the cellular activity during the phases of growth and infection. Later on, two culture strategies are evaluated: batch (reference stretegy) and perfusion (strategy that provides most similar conditions to those in vivo). Finally, the former factors apply to the analysis of the production system, in particular, with the utilization of two alternatives: the so called conventional system (stirred tank bioreactor Biostat Bplus) and the non conventional system (single use technology based Wave Bioreactor). From the results, it can be concluded that the perfusion strategy provides high cellular densities, increasing the productivity as well as the final viral concentration. On the other hand, some operational advantages of the non conventional system are outlined, in spite of losing the OUR measure. In order to complete the work, the purification stage of the bioprocess is developed. The properties of the product and the culture broth are analyzed, and two strategies of purification are evaluated. These differ in the possibility of increasing scale, so they are designated as non scalable strategy (based on ultracentrifugation) and scalable strategy (based on filtration and chromatography). The first one is commonly used at laboratory scale; given that the final product contains specifically the adenoviral vector, it is implemented to obtain referencie material with high purity when comparing the obtained results with the scalable strategy. The last one is developed based on the design of several operations. The characterization of the final product is carried out to determined its purity. The obtained results conclude that the scalable strategy shows higher global yield than the non scalable one, even though the degree of purity achieved is lower. The production and purification data allow to have four alternatives in order to analyze the potential implantation of the industrial bioprocess. The design and the comparison of these are carried out according to the same bases of design, and the final discussion is based on economical terms. From the results, the most advisable alternative of being brought to practice is the one based on the bioprocess operating in perfusion using the non conventional system. This memory is structured so it initially contains an introduction (chapter 2), where the characteristics of gene therapy, adenoviral vectors and the producing cellular lines, as well as the bioprocess are outlined. Next (chapter 3), the main objectives of the work are described. Next (chapter 4), the previous studies that characterize the producing cellular line as well as the infection with the adenoviral vector are concentrated. In chapter 5, the development of the production stage is presented. Analogously, in chapter 6, the purification stage is developed. In chapter 7, the process analysis of the alternatives is carried out. In chapter 8, main conclusions extracted from the work are set forth. Finally, the materials and methods used (chapter 9) are shown, and the appendix (chapter 10) is added, where some aspects of this work are complemented.

La presencia de compuestos orgánicos cada vez más tóxicos en las aguas residuales, especialmente provenientes de la industria, ha desafiado los métodos convencionales de tratamiento de aguas residuales. Por esta razón existe una clara necesidad de buscar nuevas técnicas emergentes las cuales pueden tratar los contaminantes orgánicos muy concentrados en agua o no biodegradables. Como no es posible utilizar un único método universal para destruir todos los compuestos orgánicos, se ha probado Catalytic Wet Air Oxidation (CWAO), CWAO promovida por peróxido de hidrógeno, Wet Peroxide Oxidation and Oxidación de Fenton para eliminar compuestos aromáticos pertenecientes a diferentes grupos. Con este propósito un equipo de alta temperatura y alta presión ha sido diseñado y construido. Este equipo puede trabajar en un proceso tanto catalítico como no catalítico. El carbón activo, un material barato, ha sido utilizado como el catalizador heterogéneo (CWAO), mientras el sulfato de hierro ha sido empleado como un catalizador homogéneo (Oxidación de Fenton). Los compuestos estudiados fueron fenol, p-nitrofenol, anilina, nitrobenceno y sulfolano, porque son tóxicos y no biodegradable y al mismo tiempo son frecuentemente encontrados en los efluentes industriales. También se ha probado dos muestras de efluentes industriales reales provenientes de la producción de las resinas fenólicas. El peróxido de hidrógeno ha sido empleado como un oxidante, excepto en CWAO, donde se lo utilizó como un promotor, porque peróxido de hidrógeno es una excelente fuente de radicales hidroxilos muy oxidantes. En primer lugar, cada proceso ha sido probado con el fenol, como contaminante de referencia, para encontrar las variables de operación influyentes para la eficacia del proceso. El objetivo era no solo destruir el compuesto original, sino también convertirlo en dióxido de carbón y agua o al menos convertirlo en compuestos inocuos y fácilmente biodegradables. Posteriormente, el método ha sido también estudiado con otros compuestos. Se observó que es posible obtener la conversión completa para todos compuestos menos el nitrobenceno con el cual se obtiene la conversión máxima de 80% utilizando WPO. Sin embargo, para determinados compuestos se ha encontrado que algunos métodos presentaron desventajas, tales como problemas de corrosión en caso de sulfolano (WPO) o formación de un tapón en reactor en caso de CWAO con anilina sobre carbón activo. A pesar de esto, se puede proponer un método de tratamiento para cada compuesto. El peróxido de hidrógeno resultó ser un oxidante muy eficaz, así se encontró que el 100% de la cantidad estequiométrica de H2O2 era suficiente para mineralizar completamente todos los compuestos, excepto el nitrobenceno. El peróxido de hidrógeno también resultó ser un buen promotor de CWAO, aumentando considerablemente la eficacia del proceso. Cabe destacar que todos los métodos fueron estudiados siempre en el mismo equipo después de realizar pequeñas modificaciones. El método de la oxidación de Fenton en modo continuo, a 200ºC, empleando sulfato de hierro permite una eliminación similar (del 70%) de nitrobenceno al método WPO no catalítico a 550ºC (80%). Para los efluentes industriales reales las técnicas estudiadas han permitido obtener una conversión completa de fenol y la reducción de DQO por encima del 50%. Aunque esto no permite la completa mineralización, probablemente aumenta su biodegradabilidad. / The identification of more and more toxic organic compounds in wastewater, especially from industry, has challenged the conventional wastewater treatment methods. That is why there is a need to look for a new emerging technologies that can treat highly concentrated or non-biodegradable organic water pollutants. As it is impossible to use one universal method to destroy all the organic compounds, we have tested Catalytic Wet Air Oxidation (CWAO), hydrogen peroxide promoted CWAO, Wet Peroxide Oxidation and Fenton's Oxidation to remove aromatic organics belonging to different groups. For this purpose high temperature and high pressure continuous reactor system was designed and constructed. This equipment can be used either for catalytic or noncatalytic process. An activated carbon, that is low cost material, was used as a heterogeneous catalyst (CWAO), while iron sulphate was employed as a homogeneous catalyst (Fenton's Oxidation). Phenol, p-nitrophenol, aniline, nitrobenzene and sulfolane were studied, because these compounds are toxic, mostly non-biodegradable and at the same time, they are commonly found in industrial effluents. Also two samples of real industrial effluents coming from phenolic resins production were tested. Hydrogen peroxide was used as an oxidant, except in CWAO, where it was used as a promoter. This is because hydrogen peroxide is an excellent source of highly oxidative hydroxyl radicals. Firstly, each process was tested for phenol in order to find the influence of operational variables on the process efficiency. The aim was not only to destroy the original compound, but also to convert it to gas carbon dioxide and water, or at least in much more innocuous compounds easily biodegradable. Than the method performance with other compounds was examined. Finally, there can be achieved the complete conversion for every compound except nitrobenzene with highest conversion of about 80% during WPO experiments. However, for some compounds certain methods exhibited drawbacks such as corrosion problems with sulfolane, and plugging in the reactor during CWAO of aniline over activated carbon. In spite of this for every compound a removal technique among the methods studied can be proposed. Hydrogen peroxide resulted to be efficient oxidant, as 100% of stoichiometric quantity of H2O2 was sufficient to mineralise completely all the compounds, except nitrobenzene. Also, hydrogen peroxide is efficient as promoter of CWAO, enhancing greatly process efficacy. It is also interesting that all the methods could be performed in the same equipment after slight modification of the system. And Fenton's oxidation in continuous system in temperature about 200ºC permits similar removal of nitrobenzene (70%) using iron sulphate (II), that during noncatalytic WPO when employing 550ºC (80%). Also for real effluents it was observed that the oxidation techniques studied permitted to obtain complete phenol conversion and COD reduction over 50%. Even if it does not allow a complete mineralisation of organic compounds more refractory that phenol present in the wastewater it can probably increase the biodegradability.

La energía se ha convertido en una necesidad vital para garantizar el desarrollo de las sociedades modernas. Entre las diferentes posibles alternativas para producir energía, el hidrogeno presenta varias características que lo convierten en un atractivo vector energético: primero, se trata de una tecnología más eficiente para transformar la energía química en electricidad -por ejemplo, utilizando pilas de-combustible, las cuales también reducen de manera significativa los niveles de emisión de CO2 -; en segundo lugar, el hidrogeno puede ser producido a partir de una amplia variedad de materias primas, incluyendo recursos renovables y no renovables. Sin embargo, las tecnologías para producir hidrogeno para applicaciones con pilas de combustible aun requieren de un esfuerzo en investigación y desarrollo.El objetivo principal de esta tesis fue de evaluar técnicamente las opciones para preparar y utilizar catalizadores en placas insertados en un reactor de pared catalítica para producir hidrogeno mediante el reformado por vapor de etanol bajo condiciones de alta eficiencia térmica. Para completar el objetivo general y los objetivos específicos, se diseño un plan experimental sistemático, compuesto de tres partes: documentación, experimentación y simulación numérica. La información utilizada se puede clasificar en tres ramas: primero, una revisión detallada de las características generales que presentan las técnicas de reformado, seguido por una revisión descriptiva del reformado por vapor de etanol, enfocado en los principales aspectos de la preparación de catalizadores y la realización de la reacción química. A continuación en segundo lugar, se presenta una descripción acerca de reactores estructurados y los métodos para preparar catalizadores. Por último, en tercer lugar, se expone una explicación centrada en los materiales, equipos y métodos empleados para explorar el rendimiento de los catalizadores. Esta parte incluye la descripción de: algunas de las técnicas analíticas más comunes para caracterizar y evaluar tanto catalizadores como compuestos químicos y la descripción de las herramientas utilizadas en la simulación numérica.El primer bloque de simulación numérica tiene como fin evaluar las posibles restricciones termodinámicas por medio de análisis específicos basados en el equilibrio termodinámico, tanto del reactor como del proceso integrado. Luego, se ejecuta un mapeo del conjunto de condiciones operacionales, compuesto por cuatro variables principales: (temperatura, relación vapor carbón, presión y factor de recobro de hidrogeno en el separador de membrana). Ello con el fin de garantizar una operación auto-térmica del procesador de combustible. Se compara la habilidad y la ventaja entre los diferentes tipos de catalizadores publicados en trabajos previos en base a las condiciones termodinámicas ideales determinadas en el análisis termodinámico.Para los catalizadores en polvo, se realizo experimentos de caracterización y reacción mediante el empleo de un reactor de lecho fijo. Se ha efectuado un estudio sistematico para comparar la actividad y la selectividad de dos tipos de catalizadores, bajo condiciones moderadas de temperatura y relación vapor carbón. Los catalizadores basados en níquel (Ni/La2O3-Al2O3) y cobalto (Co-Fe/ZnO y Co-Mn/ZnO) han sido preparados y probados a las siguientes condiciones: temperatura en el rango de 400-500°C, relación vapor carbono entre 2 y 4, tiempo de contacto desde 4.3 hasta 1100 min·gcat molEtOH-1, cubriendo un rango de conversión de etanol desde 20 hasta 100%. Se ha efectuado un diseño de análisis multifactorial para establecer la influencia de las variables (temperatura, relación vapor carbón, tiempo de contacto y formulación del catalizador) en términos de la conversión de etanol y la selectividad hacia los diferentes productos.Por último, se ha efectuado la caracterización, simulación y experimentación utilizando una configuración de reactor de pared catalítica. Primero, se emplea un modelo en 2D para analizar las características principales del reactor de pared catalítica diseñado y construido para realizar la reacción sobre las placas con catalizador previamente preparadas. En segundo lugar, se expone de manera detallada el método seguido para preparar dos tipos diferentes de placas catalíticas. Estas placas con catalizador son caracterizadas de manera similar al método empleado con los catalizadores en polvo. Luego, se ha realizado un estudio sistemático para comparar la actividad y la selectividad de los dos tipos de placas catalíticas. Por último, mediante un modelo 1D se revelan aspectos fundamentales de la configuración del reactor de pared catalítica utilizando una configuración con dos canales paralelos, en los cuales se ejecutan una reacción endotérmica y otra exotérmica respectivamente.La principal conclusión de este trabajo es que el reformado por vapor de etanol puede ser realizado bajo condiciones de alta eficiencia térmica si se emplea un diseño basado en un reactor de pared catalítica con recobro de calor integrado a una unidad de separación para la purificación del hidrogeno. Las placas catalíticas han demostrado ser un elemento fundamental en este tipo de reactor porque incrementan de manera significativa el transporte de calor que se requiere para sostener las reacciones endotérmicas. / Energy has become a fundamental necessity to guarantee modern society development. Among different alternatives possible to produce energy, hydrogen presents several characteristics which make it an attractive energy vector: first, more efficient processes to transform chemical energy into electricity -such as Fuel Cells that, in addition, will help to reduce significantly CO2 emission levels-; and second, hydrogen can be produced from a large variety of feed stocks, including fossil and renewable resources. However, as hydrogen production technologies for Fuel Cell applications are not available commercially yet, it still requires additional R&D efforts.The principal objective of this thesis was to evaluate technical feasibility for preparing and using catalytic plates in a Catalytic Wall Reactor configuration to produce hydrogen by Steam Reforming of Ethanol under conditions of high thermal efficiency. To fulfill the overall and specific objectives, a systematic experimental plan was designed and executed. It was composed of three main parts: documentation, experimentation and numerical simulation. Background information is divided into three branches, first a detailed overview of technical features for reforming technology, followed by a descriptive review of Steam Reforming of Ethanol key aspects for catalysts preparation and reaction performance. Third is presented a comprehensive examination on structured reactor and catalyst preparation methods. In this part is exposed a detailed explanation of materials, equipments, and methods employed for screening catalyst and evaluating catalytic reactor performance. Also, is presented employed techniques for catalyst characterization and fluid analysis. Finally are described tools for numerical simulation.First component of numerical simulations evaluates possible thermodynamic constrains through specific analyses based on thermodynamic equilibrium of reactor and integrated fuel processor. Then, is performed a mapping for the set of four operational variables (temperature, steam to carbon ratio, pressure, and hydrogen recovery in the membrane separator), that allow an auto-thermal operation of the fuel processor. The suitability and advantages of the different catalysts preparations that are known from recent publications are discussed on the basis of the operation conditions determined on the thermodynamic analysis.Experimental work is performed for powder catalyst characterization and catalytic experimentation using a Packed Bed Reactor (PBR). It has conducted a systematic study to compare the activity and selectivity of two types of catalyst at moderate temperature and steam to carbon (SC) ratios. Nickel-based catalysts (Ni/La2O3-Al2O3) and novel Co-based catalysts (Co-Fe/ZnO and Co-Mn/ZnO) have been prepared and tested at temperatures of 400 and 500 °C, Steam to Carbon (SC) molar ratios of 2 and 4, and contact times from 4.3 to 1100 min·gcat molEtOH-1, covering a range of ethanol conversion from 20 to 100%. A multifactorial design analysis has been conducted to establish the significance of temperature, SC ratio, contact time and catalyst formulation on ethanol conversion and selectivity towards the different reaction products.At last, it is carried out the catalytic plate characterization, simulation and experimentation using a Catalytic Wall Reactor configuration. First, is used a 2D modeling to analyze main characteristics of the Catalytic Wall Reactor designed and constructed to perform reactions on the prepared catalytic plates. Prepared catalytic plates are characterize in a similar way to that employed for the powder catalysts. After that, it was conducted a systematic study to compare the activity and selectivity of two types of catalytic plates. 1D model reveals main aspects on thermal performance for a theoretical Catalytic Wall Reactor using two co-current channels with endothermic and exothermic reactions respectively.Main conclusion from this work is that Steam Reforming of Ethanol can be performed at high thermal efficiency if the design of the fuel processor is based on structured catalytic wall reactors with integrated heat recovery coupled to a separation unit for hydrogen purification. Catalytic plates have proven to be a key component on CWR because improves significantly the heat transfer which is required to sustain endothermic reactions.

Els processos industrials requereixen avaluacions periòdiques per a verificar la seva correcta operació en termes tècnics i econòmics. Aquestes avaluacions són necessàries a causa de els canvis en els mercats i en la legislació ambiental i de seguretat. Per a satisfer aquestes demandes és necessari investigar les alternatives dels processos que permetin l'ús òptim dels recursos existents amb la mínima inversió econòmica possible. Aquesta tasca es coneix com redisseny, que és un procediment per a determinar possibles canvis en un procés existent per a millorar-lo pel en alguna mètrica, tal com econòmica, ambiental, de seguretat, etc. En aquesta tesi es proposa un marc d'ajuda al redisseny per a processos tècnics. Aquest marc fa ús d'una representació jeràrquica de models múltiples del procés que es re dissenyarà en conjunció amb un motor que raonament basat en casos per a ajudar a decidir quins elements del procés han de ser modificats. El marc consisteix en quatre etapes principals: adquisició de la descripció del disseny, identificació de candidats, generació d'alternatives, i adaptació i avaluació d'alternatives.El procés original es modela jeràrquicament emprant conceptes de mitjans-fins i parts-tot. Així el coneixement sobre el comportament, l'estructura, la funció i l'objectiu de cadascuna de les parts del procés es genera i s'emmagatzema automàticament. Donat les noves especificacions o requisits que el procés ha de satisfer, el sistema troba les parts del procés que ha de ser redissenyades. S'utilitza una llibreria de casos per a obtenir seccions alternatives del procés que es puguin adaptar per a substituir parts del procés original. Per tant, el marc proposat permet modelar el procés, identificar els components de procés viables a redissenyar, obtenir components alternatius i finalment adaptar aquests components alternatius en el procés original. Aquest procediment es pot veure com activitat d'enginyeria inversa on es generen models abstractes en diversos nivells a partir d'una descripció detallada d'un procés existent per a reduir la seva complexitat. El marc ha estat implementat i provat en el domini d'Enginyeria Química. / Los procesos industriales requieren evaluaciones periódicas para verificar su correcta operación en términos técnicos y económicos. Estas evaluaciones son necesarias debido a los cambios en los mercados y en la legislación ambiental y de seguridad. Para satisfacer estas demandas es necesario investigar las alternativas de los procesos que permitan el uso óptimo de los recursos existentes con la mínima inversión económica posible. Esta tarea se conoce como rediseño, que es un procedimiento para determinar posibles cambios en un proceso existente para mejorarlo con respecto a alguna métrica, tal como económica, ambiental, de seguridad, etc.En esta tesis se propone un marco de ayuda al rediseño para procesos técnicos. Este marco emplea una representación jerárquica de modelos múltiples del proceso que se rediseñará en conjunción con un motor que razonamiento basado en casos para ayudar a decidir qué elementos del proceso deben ser modificados. El marco consiste en cuatro etapas principales: adquisición de la descripción del diseño, identificación de candidatos, generación de alternativas, y adaptación y evaluación de alternativas. El proceso original se modela jerárquicamente empleando conceptos de medios-fines y partes-todo. Así el conocimiento sobre el comportamiento, la estructura, la función y el objetivo de cada una de las parte del proceso se genera y se almacena automáticamente. Dado las nuevas especificaciones o requisitos que el proceso debe satisfacer, el sistema encuentra las partes del proceso que debe ser rediseñadas. Se utiliza una librería de casos para obtener secciones alternativas del proceso que se puedan adaptar para sustituir partes del proceso original. Por lo tanto, el marco propuesto permite modelar el proceso, identificar los componentes de proceso viables a rediseñar, obtener componentes alternativos y finalmente adaptar estos componentes alternativos en el proceso original. Este procedimiento se puede ver como actividad de ingeniería inversa donde se generan modelos abstractos en diversos niveles a partir de una descripción detallada de un proceso existente para reducir su complejidad. El marco ha sido implementado y probado en el dominio de Ingeniería Química. / Industrial processes require periodic evaluations to verify their correct operation, both in technical and economical terms. These evaluations are necessary due to changes in the markets, and in safety and environmental legislation. In order to satisfy these demands it is necessary to investigate process alternatives that allow the optimal use of existing resources with the minimum possible investment. This task is known as redesign, which is a procedure to determine possible changes to an existing process in order to improve it with respect to some metric, such as economical, environmental, safety, etc.A redesign support framework for technical processes is proposed in this thesis. This framework employs a multiple-model hierarchical representation of the process to be redesigned together with a case-based reasoning engine that helps to decide which elements of the process should be modified. The framework consists of four main stages: acquisition of the design description, identification of candidates, generation of alternatives, and adaptation and evaluation of alternatives.The original process is modelled hierarchically exploiting means-end and part-whole concepts, and thus knowledge about the behaviour, structure, function and intention of each part of the process is automatically generated and stored. Given the new specifications or requirements that the process must fulfil, the system finds the parts of the process which must be redesigned and a case library is used to obtain alternative process sections which can be adapted to substitute parts of the original process. Therefore, the proposed framework allows to model the process, to identify process components suitable for redesign, to obtain alternative components, and finally, to adapt these components into the original process. This procedure can be seen as a reverse engineering activity where abstract models at different levels are generated from a detailed description of an existing process to reduce its complexity. The framework has been implemented and tested on the Chemical Engineering domain.

None

The main goal of this thesis is to develop advanced mathematical programming tools to address the design and planning of sustainable engineering systems and the modeling and optimization of biological systems. First we introduce a novel framework for the coupled use of Geographical Information Systems (GIS), Mixed-Integer Linear Programming (MILP) and decomposition algorithm for GIS based MILP models. Our approaches combine optimization tools, spatial decision support tools, economic and environmental analysis. Second we propose the general framework for sustainable design of energy systems like heat exchanger networks and utility plant. Our method is based on the combined use of the multi-objective optimization tools, Life Cycle Assessment methodology (LCA) and a rigorous dimensionality reduction method that allows identifying key environmental metrics. Finally we introduce multi-objective Mixed-Integer Non-Linear Programming (MINLP) based method for identifying in a rigorous and systematic manner the most probable biological objective functions explaining the operation of metabolic networks. / El objetivo principal de esta tesis es el desarrollo de herramientas de programación matemática para abordar el diseño y planificación de procesos industriales sostenibles y la optimización en el área de la biología de sistemas. Primeramente se establece un nuevo marco para el uso simultáneo de Sistemas de Información Geográfica (GIS), Programación Lineal Entera Mixta (MILP) y algoritmos de descomposición para modelo basados en MILP-GIS. Nuestros enfoques combinan herramientas de optimización, herramientas espaciales para la toma de decisiones y análisis económicos y medioambientales. En segundo lugar, se propone el marco general para el diseño de sistemas de energía sostenibles, como las redes de intercambio de calor y plantas de servicio para la industria del proceso. Nuestro método se basa en el uso combinado de herramientas de optimización multiobjetivo, metodología de Análisis de Ciclo de Vida (LCA) y un riguroso método de reducción de dimensionalidad que permite la identificación de indicadores ambientales clave. Finalmente introducimos un método basado en Programación Multiobjetivo Mixta Entera no Lineal (MINLP) aplicado a la identificación rigurosa y sistemática de las funciones objetivo biológicas más probables que explican el funcionamiento de las redes metabólicas

En la presente tesis doctoral se han realizado estudios estructurales de DNA. Estudios previos han demostrado que los coiled-coils de d(ATATATATATAT) y d(ATATATATAT) tienen unos parámetros geométricos muy diferentes. El objetivo de esta tesis es aclarar las propiedades de los coiled-coils.Con esta finalidad se han estudiado por cristalografía de Rayos X oligonucleótidos con diferentes secuencias y con extremos cohesivos que fijen la geometría de los coiled-coils. Se han utilizado oligonucleótidos con la secuencia d(CG)n(AT)m o (AT)m(CG)n y otros semejantes. En la mayor parte de ellos n=1 y m>1, con lo que el extremo cohesivo es normalmente la secuencia CG. La estructura (a una resolución de 3.1 Å) de los cristales generados por la secuencia d(CGATATATATAT) ha sido resuelta y publicada (De Luchi et al., ChemBiochem 2006, 7, 585-587). La estructura es isomorfa con la estructura de d(AT)6 y los enlaces a puente de hidrogeno entre las bases A y T son de tipo Hoogsteen, como en el caso de la secuencia d(ATATAT). Se han obtenido diferentes tipos de coiled-coils y se han estudiado sus características y propiedades.Hemos analizado las propiedades geométricas de los coiled coils: hemos visto que los parámetros que determinan el numero de oligonucleótidos por vuelta son el "kink angle" θ, y el ángulo de torsión τ. Ha sido estudiada la relación entre estos parámetro, en función del numero de oligonucleótidos por vuelta N y el ángulo de inclinación β del coiled-coil.Hemos intentado determinar si la formación de apareamientos de tipo Hoogsteen puede influir en la geometría de los coiled-coils, los resultados sugieren que los puentes de hidrogeno de tipo Hoosteeen favorecen la formación de coiled-coils, mientras los enlaces de tipo Watson-Crick generan mas fácilmente estructuras estándar de DNA pseudocontinuas. La secuencia d(CGATATGCATAT) genera columnas tradicionales de DNA, las bases centrales G y C, apareándose con enlaces Watson-Crick fuerzan las bases ATs a aparearse de la misma manera, generando así una hélice recta pseudocontinua.Como complemento de estos estudios se han obtenido las curvas de fusión de oligonucleótidos ricos en AT, los resultados, que incluyen una formula que permite un calculo aproximado de la temperatura de fusión de secuencias cortas de DNA, han sido publicados (De Luchi et al., Analytical Biochemistry, 2003, 322, 279-282).También he tenido la oportunidad de refinar la estructura de d(TAGG) en complejo con un derivado antraquinonico que ya había sido resuelta en nuestro laboratorio. Inesperadamente, encontramos que en esta estructura no se forman G-cuádruplex como fue descrito en solución por Kettani et al, las moléculas de fármaco, a través de interacciones de stacking forman un retículo de columnas perpendiculares una a la otra, estabilizado en los "crossing points" por las flexibles y cortas moléculas de DNA. La flexibilidad del DNA gracias a sus siete ángulos de torsión, le permite adoptar una conformación tal que se adapta a la estructura creada por las columnas de fármaco. La capacidad de formar diferentes tipos de enlaces a puente de hidrogeno estabiliza su conformación en este caso no canónica. En esta estructura hemos encontrado los siguientes tipos de enlaces a puente de hidrogeno: estándar Watson-Crick, reverse Watson-Crick, interacciones simétricas Guanina-Guanina.

La legislació europea i espanyola vigent pretén que les empreses redueixin la quantitat de compostos orgànics volàtils que usen en els seus processos industrials. L’origen dels compostos orgànics volàtils en la industria de la pell es troba en les substàncies químiques utilitzades en les diferents etapes del procés de fabricació del cuir. Un dels objectius dels adobers és intentar eliminar o reduir el seu ús i obtenir pells de la mateixa qualitat respectuoses amb el medi ambient. Com que la literatura contenia molt poca informació sobre la presència de COVs a la pell, el primer que ha aportat aquesta tesi és metodologia analítica, sobretot per la caracterització qualitativa, que és essencial per identificar als processos d’adoberia on s’introdueixen els COVs. El mètode HS-SPME-GC-MS és una innovació en el món de l’adoberia introduïda en aquesta tesi. La microextracció en fase sòlida (SPME) és una tècnica de preparació de mostra que s’utilitza per l’extracció de compostos orgànics volàtils i semi volàtils, que està guanyant molta acceptació com a tècnica de preferència per a moltes aplicacions i es pot acoblar perfectament a la cromatografia de gasos. És una tècnica que té com avantatges principals; la rapidesa, sensibilitat, no requereix manipulació de mostra, sense ús de dissolvent, aconsegueix l’extracció i concentració de forma simultània i permet l’extracció de l’analit “in situ”, sense inclús prèvia destrucció de la mostra. Amb tot això es considera molt innovador aplicar la tècnica per l’anàlisi de mostres de pell. Entre els treballs realitzats en aquesta tesi destaquen: S’ha desenvolupat un nou mètode HS-SPME-CG-MS amb patró intern deuterat per detectar i identificar els compostos orgànics volàtils que emeten els articles de pell. Aquest mètode permet determinar d’una manera més simple i ràpida la composició qualitativa i semi quantitativa de les substàncies orgàniques volàtils presents en les mostres. S’ha comprovat que la concentració de COVs a les pells no és estable i tendeix a la disminució amb el temps degut a les pèrdues per volatilització. Unes condicions adequades de seguretat i higiene en l’àmbit laboral en les empreses del sector adober minimitzen els efectes nocius sobre la salut dels treballadors. S’ha desenvolupat un mètode per determinar dimetilfumarat (DMFU) en pell i calçat mitjançant HS-SPME-CG-MS, ja que no hi havia fins el moment cap mètode oficial per la determinació d’aquesta substància. Arrel d’una problemàtica de salut sorgida a Europa provocada per la presència de dimetilfumarat en articles de consum com sabates o sofàs, l’Institut Nacional de Consum, va prohibir la comercialització de qualsevol article que pel seu ús estigués en contacte amb la pell i que contingués dimetilfumarat. S’han comparat formulacions majoritàriament d’acabats que utilitzen productes aquosos amb menys quantitat de solvent en la seva composició. S’han valorat les emissions de COVs de l’article acabat, els assajos de solideses de les pells i l’emissió a l’atmosfera dels productes utilitzats en funció de la productivitat de l’empresa. S’ha investigat la correlació entre el procés d’adobament de la pell i els compostos orgànics volàtils obtinguts en l’anàlisi d’aquestes que permet incidir en l’origen del problema. Com a síntesi de les conclusions del treball es pot afirmar que amb una aplicació adequada dels productes i l’ús de substàncies amb menys solvent a la seva composició, s’aconsegueix reduir considerablement l’emissió de COVs del l’article fabricat i també la quantitat de volàtils que arriben al consumidor final, que actualment ja és molt reduïda però encara es podria limitar més. / Current Spanish and European legislation intends to reduce the amount of volatile organic compounds (VOC) used in industrial processes. The presence of volatile organic compounds in the leather industry arises from the chemicals used in the various stages of the leather manufacturing process. An environmental goal of tanners is to reduce or eliminate VOCs, though not by lowering the quality of their leather products. Since the existing literature contained very little information about the presence of VOCs in leather, the first contribution of this thesis involves analytical methodology, specifically qualitative characterization, which is essential to identify the tanning processes where VOCs are introduced. The HS-SPME-GC-MS method is an innovation in leather analysis introduced by this thesis. The solid phase microextraction (SPME) is a sample preparation technique used for the extraction of volatile and semi-volatile organic compounds that is becoming widely accepted as the technique of choice for many applications and that can be smoothly connected to gas chromatography. The main advantages of this technique are speed, sensitivity, and the fact that it requires no sample handling or solvent extraction. Other advantages include the fact that the concentration and the extraction are reached simultaneously and that it enables on-site extraction of the analyte, even without a prior destruction of the sample. This technique is thus very innovative for application to the analysis of leather samples. The work developed in this thesis includes significant contributions, which are detailed below: Development of a new HS-SPME-GC-MS method with internal standard deuterate to detect and identify volatile organic compounds emitted by leather. This method enables a simpler and faster determination of the qualitative and semi-quantitative composition of the organic compounds in the samples. This shows that the concentration of VOCs in the leather is not stable and tends to decrease over time due to volatility losses. Proper health and safety conditions in the workplace minimize these harmful effects on workers'health. Development of a method for determining dimethylfumarate (DMFU) in leather and footwear through HS-SPME-GC-MS, since there was previously no official method for the detection of this substance. Due to health problems in Europe caused by the presence of dimethylfumarate in consumer goods such as shoes or sofas, the National Institute of Consumption prohibited the sale of any product containing dimethylfumarate that might come into contact with skin. Formulations of finishings were compared using aqueous products with a lower amount of solvent composition. The VOCs emissions from the finished article, the fastness tests on leather, and the total emission of the chemicals against the production of a given company were also evaluated. It was investigated the correlation between the tanning process and the volatile organic compounds obtained in the analysis of leather to explore the source of the problem. This study shows that with the proper application of leather manufacturing chemicals, and reliance on substances with less solvent composition, VOC emissions are significantly reduced. In addition, the amount of volatiles reaching the end consumer, which is currently already very low, can still be further limited.