Les furocoumarines constituent l'une des classes de métabolites secondaires dérivant de la voie de biosynthèse des phénylpropanoïdes. Elles ont été décrites comme étant des phytoaléxines mais sont également très largement utilisées par l'Homme pour leurs propriétés thérapeutiques. Un certain nombre d'études biochimiques ont été réalisées afin d'en comprendre la biosynthèse mais peu de choses sont connues concernant leur déterminisme moléculaire. Dans cette étude, nous nous sommes concentrés sur la caractérisation fonctionnelle de gènes appartenant aux prényltransférases aromatiques potentiellement impliquées dans cette voie de biosynthèse. Les prényltransférases catalysent la première étape de la voie de biosynthèse des furocoumarines linéaires ou angulaires. Elles permettent l'addition d'un groupement dimethylally pyrophosphate (DMAPP) sur l'umbelliférone. En utilisant SfN8DT-1, une prényltransférase aromatique récemment caractérisée, comme sonde, nous avons identifié 7 gènes candidats chez deux familles de plantes (Rutaceae et Apiaceae). Dans la mesure où il a été décrit que ces enzymes étaient des protéines membranaires, nous avons adapté un système d'expression hétérologue basé sur l'utilisation de N. benthamiana. Ce système a été validé par l'expression de deux protéines membranaires : un cytochrome P450 CYP98A22 et une prényltransférase déjà caractérisée SfN8DT-1. Nous avons ensuite utilisé ce système d'expression pour réaliser l'étude des 7 gènes nouvellement isolés. Ces travaux nous ont permis de caractériser la première umbelliferone prenyltransferase de Petroselinum crispum capable de catalyser in vitro et in vivo la prénylation du carbone 6 ou 8 de l'umbelliférone en présence de DMAPP permettant ainsi la synthèse respectivement de demethylsuberosin et d'osthenol. Par ailleurs, une étude réalisée in planta chez le persil a permis de mettre en évidence une relation positive entre le niveau d'expression du gène et la teneur en umbelliférone prénylée. L'étude de la surexpression du gène chez Ruta graveolens a permis de mettre en évidence un lien entre l'expression du gène et la disparition de l'umbelliférone. Enfin nous avons identifié la même activité pour une prényltransférase de Pastinaca sativa, ce qui nous amène à émettre l'hypothèse que l'étape de prénylation n'est pas une étape limitante dans la biosynthèse des furocoumarines angulaires, étant donné que le persil ne produit que des furocoumarines linéaires, tandis que le panais produit des furocoumarines linéaires et angulaires. L'utilisation de ces mêmes systèmes d'expression hétérologue de N. benthamiana et R. graveolens nous a également permis d'identifier une seconde prényltransférase aromatique capable de catalyser l'addition de géranylpyrophosphate (GPP) sur l'umbelliférone et sur l'esculétine / Furanocoumarins constitute one of the classes of secondary metabolites deriving from the phenylpropanoid biosynthetic pathway. These molecules are described as phytoalexins in plants but are also used by humans for their pharmaceutical properties. A large number of biochemical studies were carried out to understand their biosynthetic pathway but little information was available concerning the genes involved in the pathway. In this study, we focused on the characterization of genes encoding for aromatic prenyltransferases which were described to be involved in this pathway. Prenlyltransferases catalyze the entry step to the linear or angular furanocoumarin pathway. Hence they catalyze the addition of a dimethylallyl pyrophosphate (DMAPP) prenyl moiety to umbelliferone. Using a recently characterized aromatic prenyltransferase (SfN8DT-1) as a probe, we isolated 7 different candidate genes from two plant families (Rutaceae and Apiaceae). As these enzymes were described as membrane bound proteins, we adapted a heterologous expression system made up of Nicotiana benthamian aand we validated its efficiency by using two membrane-associated enzymes: a cytochrome P450 (CYP98A22) and the already described prenyltransferase SfN8DT-1. Subsequently, this system was used to perform the functional characterization of the 7 newly identified proteins. This way we succeeded to characterize the first umbelliferone prenyltransferase of Petroselinum crispum that was able to catalyze both the 6-C and 8-C prenylation of umbelliferone with DMAPP producing demethylsuberosin and osthenol respectively. We made evidence that these reactions occurred both in vitro and in vivo. In addition, in planta studies performed in P.crispum showed a positive relationship between the gene expression level and the content of prenylated umbelliferone. The overexpression of this gene was investigated in Ruta graveolens and we could provide evidences of a link between the enzymatic activity and the disappearance of umbelliferone. We also reported a similar activity for a prenyltransferase isolated from Pastinaca sativa, which makes us assume that the prenylation step is not a rate limiting step in the biosynthetic pathway of angular furanocoumarins since parsley is producing only linear furanocoumarins whereas parsnip is producing both linear and angular furanocoumarins. In addition, using the same N. benthamiana and R. graveolens heterologous expression systems, we identified a second aromatic prenyltransferase able to catalyze the addition of geranyl pyrophosphate (GPP) both to umbelliferone and esculetin

Le développement de la thérapie génique dépend des systèmes utilisés pour le transport de gènes vers les cellules eucaryotes. Les systèmes à base de virus sont les plus efficaces. Cependant, il est urgent de trouver une alternative à de tels systèmes viraux pathogènes et oncogènes. Les polymères cationiques sont des vecteurs synthétiques prometteurs ; toutefois, une question cruciale reste en suspens : quelle structure de polymère cationique visée pour une efficacité de transfection élevée et une faible cytotoxicité ? Face à ce questionnement scientifique, de nouveaux polymères cationiques offrant une grande flexibilité en termes de structure et de fonctionnalité sont développés dans cette thèse. Les différents paramètres structuraux pertinents étudiés sont : (i) des entités amines primaire et tertiaire pH-sensibles pour la complexation de l'ADN et pour la libération des polyplexes ADN/polymère, (ii) un groupe alcyne destiné à l’ancragepar chimie click de ligands capables de viser des récepteurs spécifiques de membrane cellulaire pour une reconnaissance efficace des cellules, (iii) des entités polyacrylates à « charge modulable » pour libérer l'ADN et diminuer la cytotoxicité du polymère et (iv) un poly (oxyde d'éthylène) (PEGylation) pour une meilleure stabilité en milieu physiologique et une meilleure biocompatibilté. / The clinical success of gene therapy is really dependent on the development of new efficient gene transfer systems. Viral-based gene transfer systems are remarkably efficient in transfecting body cells. However, viral-based systems raised some concerns in terms of immunogenicity, pathogenicity, and oncogenicity. Cationic polymers are promising candidates as they show low host immunogenicity, are cheaper and easier to produce in a large scale than viral ones. However, a crucial question is still pending: which cationic polymer structures and functionalities give the highest transfection efficiency and the lowest cytotoxicity? In dealing with this scientific issue, new cationic polymers with key structural parameters and functionalities were developped during this PhD thesis. The key structural features studied are : (i) pH sensitive primary and tertiary amine entities for DNA complexation and to ensure the endosomal escape, (ii) an alkyne group to attach ligands capable to target specific cell membrane receptors for an efficient cell recognition and receptor-mediated cellularuptake, (iii) “charge-shifting” amino-based polyacrylates for DNA release and to decrease cytotoxicity and (iv) PEG chains (PEGylation) to achieve high stability, longer circulation in physiological conditions and a better biocompatibility. The synthesis of such multi-structural cationic polymers has been achieved through the combination of RAFT polymerization and thiol-yne click coupling reaction. The structure/complexation and the structure/cells viability relationships have been investigated during this work.

Les nucléases programmables et site-spécifiques comme CRISPR-Cas9 sont des signes avant-coureurs d’une nouvelle révolution en génie génétique et portent en germe un espoir de modification radicale de la santé humaine. Le « multiplexing » ou la capacité d’introduire plusieurs modifications simultanées dans le génome sera particulièrement utile en recherche tant fondamentale qu’appliquée. Ce nouvel outil sera susceptible de sonder les fonctions physiopathologiques de circuits génétiques complexes et de développer de meilleures thérapies cellulaires ou traitements antiviraux. En repoussant les limites du génie génétique, il sera possible d’envisager la réécriture et la conception de génomes mammifères. Le développement de notre capacité à modifier profondément le génome pourrait permettre la création de cellules résistantes aux cancers, aux virus ou même au vieillissement ; le développement de cellules ou tissus transplantables compatibles entre donneurs et receveurs ; et pourrait même rendre possible la résurrection d’espèces animales éteintes. Dans ce projet de recherche doctoral, nous présentons l’état de l’art du génie génétique « multiplex », les limites actuelles et les perspectives d’améliorations. Nous tirons profit de ces connaissances ainsi que de l’abondance des éléments transposables de notre ADN afin de construire une plateforme d’optimisation et de développement de nouveaux outils de génie génétique qui autorisent l’édition génomique à grande échelle. Nous démontrons que ces technologies permettent la production de modifications à l’échelle du génome allant jusqu’à 3 ordres de grandeur supplémentaires que précédemment, ouvrant la voie au développement de la réécriture des génomes de mammifères. En outre, l’observation de la toxicité engendrée par la multitude de coupures double-brins dans le génome nous a amenés à développer un bio-interrupteur susceptible d’éviter les effets secondaires des thérapies cellulaires actuelles ou futures. Enfin, en conclusion, nous exposons les potentielles inquiétudes et menaces qu’apporte le domaine génie génétiques et apportons des pistes de réflexions pour diminuer les risques identifiés. / Programmable and site-specific nucleases such as CRISPR-Cas9 have started a genome editing revolution, holding hopes to transform human health. Multiplexing or the ability to simultaneously introduce many distinct modifications in the genome will be required for basic and applied research. It will help to probe the physio-pathological functions of complex genetic circuits and to develop improved cell therapies or anti-viral treatments. By pushing the boundaries of genome engineering, we may reach a point where writing whole mammalian genomes will be possible. Such a feat may lead to the generation of virus-, cancer- or aging- free cell lines, universal donor cell therapies or may even open the way to de-extinction. In this doctoral research project, I outline the current state-of-the-art of multiplexed genome editing, the current limits and where such technologies could be headed in the future. We leveraged this knowledge as well as the abundant transposable elements present in our DNA to build an optimization pipeline and develop a new set of tools that enable large-scale genome editing. We achieved a high level of genome modifications up to three orders of magnitude greater than previously recorded, therefore paving the way to mammalian genome writing. In addition, through the observation of the cytotoxicity generated by multiple double-strand breaks within the genome, we developed a bio-safety switch that could potentially prevent the adverse effects of current and future cell therapies. Finally, I lay out the potential concerns and threats that such an advance in genome editing technology may be bringing and point out possible solutions to mitigate the risks.

Le travail présenté porte sur le développement d’une nouvelle technologie innovante, nommée PAT Friday®, visant à produire des protéines recombinantes au sein des sécrétions extracellulaires de plantes carnivores génétiquement modifiées. Deux objectifs ont été fixés : Réaliser la preuve de concept de la technologie sur le modèle expérimental Drosera rotundifolia, en transformant la plante avec des gènes marqueurs et humains afin de mettre en évidence la présence des protéines recombinantes dans la glu ; et développer, après évaluation, la technologie sur un modèle potentiellement industrialisable, Nepenthes alata. Les résultats ont indiqué la présence des deux protéines marqueurs GFP et GUS dans les tissus et dans la glu de Drosera rotundifolia transformées. Les plantes ont également été transformées génétiquement avec les gènes humains de l’interféron gamma et du facteur intrinsèque. Les protéines recombinantes humaines ont été mises en évidence au sein des tissus végétaux. Le potentiel industriel du modèle Nepenthes alata a ensuite été étudié : 10 à 15 kg de protéines totales par hectare et par an peuvent être produits, grâce notamment à des récoltes successives non destructrices, et la possibilité de contrôler l’activité des protéases digestives naturelles. L’élaboration d’un protocole de régénération de la plante a été entreprise par embryogénèse somatique et organogénèse indirecte, en vue de sa transformation génétique. La technologie PAT Friday®, avec des étapes simplifiées d’extraction et de purification des protéines d’intérêt produites dans le liquide digestif, offre de nouvelles perspectives dans le domaine des protéines thérapeutiques produites à partir de plantes / The present work focuses on the development of a new innovating technology, called PAT Friday®, aiming at producing recombinant proteins into the extra-foliar fluid of modified carnivorous plants. Two objectives were assigned to this work : 1- to realize a proof of concept of the technology on the experimental model Drosera rotundifolia, transformed with marker and human genes, to confirm the occurence of the recombinant proteins into glu ; and 2 - to evaluate and develop, the technology on the model Nepenthes alata, more adapted to industrial scaling-up. The results indicate the presence of two marker proteins GUS and GFP inside the tissues and into the glu of modified Drosera rotundifolia plants. The same plant species has also been transformed with human gamma interferon and intrinsic factor genes. The corresponding human recombinant proteins have been detected into the plant tissues. Potential industrial scaling-up has been studied with the species Nepenthes alata. The results show a potential productivity of 10 to 15 kg of total proteins per hectare per year, thanks to non-destructive repeated harvests, and possibility to efficiently control the natural proteinase activity. The elaboration of a regeneration protocol has been undertaken through indirect organogenesis and somatic embryogenesis, with a view to transform genetically this plant. PAT Friday® technology, with simplified extraction and purification methods of the proteins of interest targeted into the liquid secretions, opens new perspectives in the field of therapeutical proteins produced in plants

The EcoR124INT restriction-modification (R-M) system contains the genes HsdS3, HsdM and HsdR. S3 encodes the N-terminal domain of the wild-type S subunit and has been shown to dimerise in solution (Smith et al., 1998). Following purification of the subunits of the EcoR124INT R-M system, complexes of the methyltransferase S3/M and restriction endonuclease S3/M/R were formed and shown to have activity in vitro, methylating and hydrolysing a symmetrical DNA recognition sequence, respectively. The DNA mimic OCR (overcome classical restriction) protein inhibited the methyltransferase activity in vitro, with maximum inhibition at a 1: 2 molar ratio of (S3/M)2 to an ocr dimer. Dynamic light scattering (DLS), sedimentation equilibrium (SE) and sedimentation velocity (SV) experiments showed S3 to exist as a dimer and S11 (the central conserved domain of S) to exist as a tetramer in solution. M was found to be dimeric in solution, whilst the R protein was monomeric. A complex of S3/M was found to have a stoichiometry (S3/M)2 and a complex of S3/M/R had a stoichiometry of S3/M/R1, even when a 2: 1 molar ratio of R to S3/M, was added. Small angle neutron scattering (SANS) experiments provided values for the radius of gyration (Rg), which for S3 was comparable to that calculated for the recently published crystal structure of the S subunit from Methanococcus jannaschii (Kim et al., 2005). These experiments also showed a decrease in the Dmax in the presence of the 30 bp DNA recognition sequence from 200A to 140A, suggesting a similar conformational change in the positioning of the subunits as has been detected for the wild-type M. EcoR124I and a related type 1 1/2 system AhdI. This change following DNA binding was also observed by SV experiments. Furthermore ab initio modelling from the SANS data has provided a low-resolution structure for the EcoR124INT MTase and its complex with DNA.

Les cancers du sein et de l’ovaire apparaissent dans 5 à 10% dans un contexte de prédisposition génétique, dont seule une faible part est expliquée par la présence d’un variant pathogène sur les gènes BRCA1, BRCA2 et PALB2. Le séquençage à haut-débit permet d’explorer cette hérédité manquante, mais représente un nouveau défi à la fois informatique, statistique et biologique. Trois approches utilisant cette nouvelle technologie ont été employées pour rechercher de nouveaux facteurs de prédisposition. En premier lieu, les risques associés à 34 gènes connus ou suspectés d’être impliqués dans les prédispositions ont été estimés à partir de l’analyse de 5 131 cas index et le développement d’une nouvelle approche statistique. Aussi la participation des néo-mutations en mosaïque dans le syndrome a été explorée à partir de 1 750 cas index issus de l’étude précédente, avec un logiciel de détection des variants faiblement représentés développé spécifiquement: outLyzer. Enfin, l’exploration par séquençage de l’hérédité manquante a été étendue à un panel de 201 gènes impliqués dans le cancer, à partir de 118 patientes sélectionnées pour la précocité d’apparition de leur maladie, élément fortement évocateur d’un facteur de prédisposition. Les résultats de ces travaux ont permis de valider la pertinence de l’étude de PALB2, RAD51C et RAD51D pour la prise en charge des patients, et suggèrent aussi une implication sous-estimée des variants en mosaïque. Cependant il reste encore très probablement d’autres facteurs génétiques fortement pénétrants à découvrir mais dont la modulation du risque répond à un modèle oligogénique. / Breast and ovarian cancers appear in 5 to 10% of cases in a context of genetic predisposition, of which only a small proportion is explained by the presence of a pathogenic variant on the BRCA1, BRCA2 and PALB2 genes. High throughput sequencing can explore this missing heredity, but represents a new challenge both in computing, statistics and biology. Three approaches using this new technology have been used to investigate new predisposition factors. First, the risks associated with 34 known or suspected genes involved in predispositions were estimated from the analysis of 5,131 index cases and the development of a new statistical approach. Also, the participation of mosaic neo-mutations in the syndrome was explored from 1,750 index cases from the previous study, with a software developed specifically for detecting poorly represented variants: outLyzer. Finally, the exploration by sequencing of the missing heredity was extended to a panel of 201 genes involved in cancer, from 118 patients selected for the early onset of their disease, a highly suggestive element of a predisposition factor. The results of this work validated the relevance of the PALB2, RAD51C and RAD51D study for patient management, and also suggested an underestimated involvement of mosaic variants. However, there are still very likely other highly penetrating genetic factors to be discovered, but whose risk modulation is based on an oligogenic model.

Le récepteur LSR est un acteur important du métabolisme hépatique, puisqu'il joue un rôle dans la clairance des lipoprotéines à ApoB/ApoE riches en triglycérides durant la période postprandiale. Dans cette étude, nous avons montré qu'un traitement in vitro par DHA peut augmenter les niveaux de protéine et d'activité LSR dans les cellules d'hépatome de souris Hepa 1-6. En toute cohérence, un régime supplémenté en DHA a conduit à élever les niveaux de protéine LSR hépatique chez la souris. Mais aucune de ces deux études n'a montré de changement au niveau des ARNm. Ceci suggère que l'enrichissement en DHA influe positivement sur le microenvironnement de LSR et son ancrage à la surface de la cellule. Nous avons ensuite étudié le rôle du récepteur PPAR[alpha] dans la régulation du gène lsr. Une analyse in silico nous a permis d'identifier des éléments PPRE dans la région 5' régulatrice du gène humain et de ses homologues de souris et de rat. Des traitements pharmacologiques par des agoniste et antagoniste spécifiques de PPAR[alpha] ont montré que ce récepteur est impliqué dans la régulation transcriptionnelle de l'expression du LSR dans les cellules Hepa 1 6. Enfin, une analyse transcriptomique a révélé une diminution de l'expression de PPAR[alpha] et d'autres gènes impliqués dans le métabolisme lipidique hépatique chez la souris LSR+/- sous régime standard ou riche en graisses. En conclusion, toutes ces études indiquent que l'activité LSR hépatique est sous le contrôle de facteurs nutritionnels capables d'activer divers mécanismes de régulation, faisant du LSR une cible d'intérêt potentiel pour des stratégies nutritionnelles ou thérapeutiques destinées à prévenir ou traiter les dyslipidémies / Lipolysis stimulated lipoprotein receptor (LSR) plays an important role in the clearance of ApoB/ApoE containing triglyceride-rich lipoproteins during postprandial phase. In this study, we demonstrated that in vitro treatment of mouse hepatoma cells, Hepa 1-6, with docosahexaenoic acid (DHA) led to an increase in LSR protein levels as well as its activity. Furthermore, the mice placed on the diet supplemented with DHA showed an increase in hepatic LSR protein. However, the mRNA levels remained unchanged in both in vitro and in vivo studies, suggesting that DHA enrichment may result in changes in LSR microenvironment that could affect its anchorage at the surface of cell membrane. Specific peroxisome proliferator response elements were identified in the upstream region of human, mouse and rat lsr gene by in silico analysis. We therefore sought to determine the role of the transcription factor, peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR[alpha]), in LSR regulation. In vitro pharmacological studies using PPAR[alpha]-selective agonist and antagonist agents demonstrated that PPAR[alpha] is indeed involved in the transcriptional regulation of LSR expression. Furthermore, qPCR array analysis revealed the downregulation of PPAR[alpha] and various genes involved in hepatic lipid metabolism in LSR+/- mice on standard and high-fat diets. In conclusion, these studies show that the hepatic LSR activity is controlled by dietary factors that can activate various pathways involved in regulating lipid homeostasis, therefore representing LSR as a potential target for either nutritional or therapeutic strategies towards the prevention or treatment of dyslipidemia

Ma thèse a porté sur des complexes de polyélectrolytes en solution et en films LbL pour la transfection de cellules et le contrôle des interactions cellule-surface. Il est possible de doser un agent de transfection et de l'ADN plasmidique dans des films LbL en ajustant le nombre de couches. Les efficacités de transfection avec différentes lignées cellulaires ont été au moins aussi bonnes que celles rapportées dans la littérature, mais sont restées globalement faibles. Différents nanobags ont également été systématiquement testés menant à un protocole de transfection très efficace avec une faible cytotoxicité pour des fibroblastes humains qui sont difficiles à transfecter. Nous avons pu identifier les architectures LbL qui permettent de contrôler l'adhésion cellulaire même en présence de sérum. Cela nous a permis d'introduire une nouvelle technique pour le suivi in situ de la transfection par QCM-D en suivant la mobilité du cytosquelette qui sera poursuivie dans un futur projet. / My PhD work was focused on polyelectrolyte complexes in bulk and in LbL-films for cell transfection and for controlling cell-surface interactions. It is possible to dose transfection agent and plasmid DNA in LbL-films by adjusting the number of layers. Transfection efficiencies with different cell lines were at least as good as reported in the literature, but remained overall weak. Different nanobags were also tested systematically leading to a highly efficient transfection protocol with low cytotoxicity for human fibroblasts which are difficult to transfect. We were able to identify multilayer architectures that allow to control cell adhesion even in the presence of serum. This allowed us also to introduce a new technique for the in-situ monitoring of transfection by QCM-D through monitoring cytoskeleton mobility which will be further pursued in a future research project.