Bien que la persistance du virus H5N1 dans l'environement soit possible, il n'existe aucune méthode bien définie, standardisée, pour détecter du virus à partir de l'eau, du sol ou de la boue. De plus, il n'y a que très peu de données relatives au rôle du virus H5N1 dans l'environnement en pays tropical. Dans ce travail, des méthodes de concentration, d'identification, et de quantification du virus influenza dans l'eau et dans la boue ont été développées, validées puis utilisées pour l'analyse de prélèvements de l'environnement collectés au cours d'investigations d'épidémies de virus H5N1 au Cambodge et pour l'étude de la survie du virus influenza aviaire dans des biotopes aquatiques artificiels reproduisant le plus possible les conditions naturelles observées dans les mares ou les lacs au Cambodge. L'ARN du virus H5N1 été détecté dans 19% des échantillons environnementaux de terrain collectés au décours des épidémies. Des particules virales infectieuses ont été isolées dans un échantillon d'eau d'une ferme. Dans des systèmes expérimentaux, le virus H5N1 infectieux persiste seulement 4 jours dans l'eau de pluie. Mais l'ARN viral peut encore être détecté jusqu'à 20 jours dans l'eau de pluie et 7 jours dans l'eau de mare ou de lac. Dans la boue, les particules virales infectieuses ne semblent pas pouvoir survivre bien que l'ARN puisse persister au moins 2 semaines. La faune et la flore aquatique n'ont aucune influence sur la persistance du virus infectieux dans l'eau. Ces organismes semblent être essentiellement des concentrateurs et des transporteurs passifs du virus plutôt que des hôtes autorisant la réplication du virus. Nos résultats montrent que l'environnement au cours d'épidémies est fortement contaminé par le virus H5N1 et pourrait constituer une source potentielle de contamination humaine et/ou animale. Une restriction de l'accès à l'eau potentiellement contaminée doit être recommandée autour des foyers épidémiques. La surveillance de l'environnement doit être intégrée dans les programmes de lutte contre la grippe aviaire qui doivent par conséquent prendre en considération des mesures de désinfection de l'environnement. / Although the persistence of the H5N1 virus in the environment is possible, there is no well-defined and standardized method for the detection of viruses from water, soil or mud. In addition, there is very little data available regarding the role of H5N1 virus in the environment in the tropics. In this work methods of concentration, identification, and quantification of influenza viruses in water, mud and soils have been developed, validated and used to test environmental samples collected following H5N1 outbreaks in Cambodia and to analyze samples obtained during experiments in artificial aquatic biotopes aiming to reproduce as faithfully as possible the characteristics observed in ponds and lakes in Cambodia. The H5N1 viral RNA was detected in 19% of environmental samples. Among these, infectious viral particles were isolated in a single water sample. In experimental systems, the infectious H5N1 virus survived only 4 days in the rain water. But viral RNA persisted up to 20 days in rain water and 7 days in pond and lake water. In mud, infectious viral particles did not survive even viral RNA could persist for at least 2 weeks. Aquatic flora and fauna have no influence on infectious H5N1 virus persistence in water. These organisms seem to concentrate and to passively carry the virus but do not allow virus replication. Our results showed that following outbreaks, the environment is widely contaminated by H5N1 virus and therefore can act as a potential source of human and/or animal contamination. Restricted access to potentially contaminated water should be recommended during outbreak episodes. Monitoring the environment is recommended in the effort to fight against avian influenza and measures including environment disinfection should also be considered.

Suite à la survenue des cas humains de grippe aviaire au Cambodge, il est devenu nécessaire en termes de santé publique d'évaluer l'ampleur de la transmission dans la population et d'identifier les sources potentielles et les modes de transmission à l'homme afin de pouvoir mettre en place des mesures de contrôle et de prévention efficaces. Les travaux de cette thèse ont pour objectif principal d'étudier la transmission du virus A(H5N1) et les facteurs de risque d'infection humaine. Cette thèse rapporte des résultats des études au Cambodge listées ci-dessous. (1) Des études sérologiques et sur les facteurs de risque de l'infection par le virus A(H5N1) ont été conduites en 2006. (2) Une autre étude sérologique a été faite en 2007. (3) Les investigations séro-épidémiologiques ont été menées en 2008-2010 avec une analyse des données cumulées sur cinq années (2006-2010). (4) Une évaluation des comportements et pratiques en lien avec le risque de transmission du virus A(H5N1) dans la population rurale cambodgienne a été menée entre 2006 et 2007. (5) Les caractérisations du virus A(H5N1) isolés au Cambodge durant 2004-2007 et l'exploration de l'origine de l'introduction du virus au Cambodge ont été réalisées à l'aide des méthodes moléculaires. / Following the occurrence of A (H5N1) human cases in Cambodia, it became necessary in terms of public health to evaluate the extend of the transmission in the population and to identify the potential sources and routes of transmission to human in order to set up efficient control and preventive measures. The main objective of this work is to study the transmission and risk factors for infections in human. The thesis reports the results the studies listed below. (1) Serology studies and studies on risk factors for A (H5N1) infections were conducted in 2006. (2) Another serology study was done in 2007. (3) Sero-epidemiological investigations were also conducted during 2008-2010 with analysis of pooled data from 5 years (2006-2010). (4) An assessment of behaviors and practices with regard to the risk of A (H5N1) transmission in Cambodian rural population was done in 2006-2007. (5) Characterizations of A (H5N1) virus isolated in Cambodia were also carried out using molecular methods.

Le virus H5N1 hautement pathogène a été à l'origine d'importantes pertes humaines, animales et économiques dans tous les pays affectés. Nos études ont été pensées afin d'appréhender le problème complexe de la circulation et de la dissémination du virus H5N1 hautement pathogène de manière intégrée et transdisciplinaire en envisageant les problèmes sous des angles différents mais complémentaires. La première partie de ce manuscrit est consacrée à l'analyse de la dynamique de circulation du virus H5N1 en Asie du sud-est ainsi que dans la région du Cambodge et du Vietnam ce qui a permis de mieux comprendre la structure, la diversité, et l'origine des populations virales retrouvées au Cambodge. Cela a permis de décrire la succession des lignées virales introduites successivement dans le pays et d'en retracer les origines. Ce travail a aussi montré que depuis 2010 une nouvelle lignée endémique au Cambodge avait émergé et évolué à partir d'une lignée mère avant de donner naissance à un nouveau sous-clade (1.1.A). Ce travail s'est également concentré sur l'impact des mouvements de volailles sur la diffusion du virus au Cambodge ainsi que sur l'analyse des marchés de volailles vivantes comme réservoir potentiel du virus H5N1. Le rôle potentiel de l'environnement comme source d'infection humaine et animale a également été exploré dans ce travail. En effet, nos résultats montrent clairement que l'environnement des fermes à la suite d'épidémies ou que les échantillons environnementaux prélevés dans les marchés aux volailles vivantes étaient fortement contaminés par le virus aviaire. L'impact sur la survenue d'épidémies d'une évolution des pratiques des éleveurs, en particulier dans la manipulation des volailles et dans la déclaration de la mortalité, a été évalué et nous avons montré que des progrès avaient été réalisés avec le temps mais qu'il restait encore des progrès à réaliser, en particulier dans la manipulation des volailles. Nous avons également décrit la survenue d'épidémie chez des oiseaux sauvages et des chats au Cambodge et démontré le rôle que pourrait jouer dans la dissémination du virus et dans la contamination humaine une pratique bouddhiste qui consiste à relâcher des passereaux captifs. Mots-clés : virus H5N1, évolution virale, environnement, marchés aux volailles vivantes, Cambodge, Asie du sud-est, oiseaux sauvages, chats, transmission. / The Highly Pathogenic Avian Influenza (HPAI) virus, subtype H5N1, has caused important human, animal and economical losses in all countries affected. This work was designed as a somehow transdisciplinary and integrative project to try addressing the complex problem of HPAI H5N1 virus circulation and spread through different complementary but related angles. The first domain to be addressed was that of the dynamics and evolution of the virus which allowed us to better understand the structure, diversity and origin of the viral populations found in Cambodia. It also allowed to determine the succession of lineages that were introduced in the country and to identify their origin. This work also demonstrated that since 2010 a novel lineage, endemic to Cambodia, has emerged and evolved from the mother lineage to become a genetically distinct sub-clade (1.1.A). This work also focused on the impact of poultry movement networks in the spread of avian influenza in Cambodia and on the analysis of live markets as potential HPAI H5N1 reservoirs. The potential role of the environment as a source of infection for both animals and humans was also explored in the work. Indeed, our data clearly demonstrated that the environment of the farms following an outbreak or the environmental samples collected from life bird markets were highly contaminated by H5N1 virus. The evolution in poultry workers behavior, especially poultry handling and poultry mortality report and their influence on the epidemics in Cambodia was analyzed and data demonstrated some improvements over the time but some key issues, especially in regards poultry handling, should still be addressed. The occurrence of outbreaks in captive wild birds and cats in Cambodia was also observed, whereas the final part of the manuscript demonstrated the potential role of the Merit Release Birds, used during some common Buddhist ritual in Asia, in the dissemination of virus to avian and human population. Key-Words: H5N1 virus, virus evolution, environment, Live Poultry Market, Cambodia, Southeast Asia, wild birds, cats, transmission.

Le virus de l'influenza aviaire hautement pathogène (IAHP) de sous-type H5N1 a causé de nombreuses pertes humaines, animales et économiques à travers le monde, notamment en Asie du Sud-Est. Son potentiel pandémique est une source d'inquiétude majeure en santé publique. Au Cambodge, l'infection est enzootique, et a causé la mort de 16 personnes depuis sa première détection en 2004 dans le pays, dont 8 pour la seule année 2011. Bien que l'hypothèse de la transmission directe hôte-hôte (animal-animal ou animal-homme) soit privilégiée, de récentes études semblent clairement incriminer certains éléments constitutifs de l'environnement dans le cycle de transmission du virus. Cependant, peu de données sont actuellement disponibles sur le sujet. Le travail de cette thèse a consisté en grande partie à apporter quelques réponses aux nombreuses questions soulevées. Des méthodes de détection du virus H5N1 dans l'environnement ont été mises au point, validées, et utilisées pour la détection de virus dans des prélèvements environnementaux collectés sur des sites d'épizooties au Cambodge. Le rôle de passereaux, capturés pour la réalisation de certains rituels bouddhistes en Asie, dans la dissémination du virus aux populations aviaires et humaines, a également été étudié. En parallèle, des données importantes du mode d'évolution du virus H5N1 au sein d'hôtes aviaires, jusqu'alors inexistantes, ont été apportées par l'étude des quasi-espèces du virus. L'ensemble des résultats rassemblés dans cette thèse souligne l'importance du rôle de l'environnement dans la dissémination et la transmission du virus IAHP H5N1. / The Highly Pathogenic Avian Influenza (HPAI) virus, subtype H5N1, has caused important human, animal and economical and losses in all countries affected, especially in Southeast Asia. Its pandemic potential is a major public health concern. In Cambodia, the infection is enzootic, and has caused 16 human fatalities since its first detection in the country in 2004, out of which 8 occurred in 2011. Although the hypothesis of direct host-to-host (animal-to-animal or animal-to-human) transmission is commonly accepted, recent studies clearly identified some environmental components as sources for avian and/or human contamination with H5N1 virus. Nonetheless, only few data are currently available on this topic. The work presented in this thesis aimed at better describing the role of the environment in the transmission cycle of the H5N1 virus. H5N1 virus detection methods in the environment were designed, validated and used for the detection of virus in environmental samples collected during epizootic outbreaks in Cambodia. The role of the Merit Release Birds, used during some common Buddhist rituals in Asia, in the dissemination of the virus to avian and human populations was also studied. In parallel, important and novel data regarding the evolution of the H5N1 virus within avian hosts were provided by quasi-species studies. The findings described in this thesis emphasize the relevance of the role of the environment in the dissemination and transmission of the HPAI H5N1 virus.

Das Auftreten des pandemischen H1N1-Influenzavirus 2009 und die kontinuierliche Übertragung hochpathogener H5N1-Viren (HPAIV) auf den Menschen verdeutlichen die Wichtigkeit zoonotischer Übertragungen. Bis heute sind die Restriktion tierpathogener Influenzaviren und die hohe Virulenz der HPAIV im Menschen nicht vollständig geklärt. Verschiedene Modelle wurden zur Studie von Influenzaviren verwendet, u. a. Zelllinien, die jedoch die Komplexität und Zelltypen der humanen Lunge nur unzureichend wiedergeben. Daher wurde ein humanes ex vivo Lungenkulturmodell etabliert in welchem die komplexe Struktur und die verschiedenen Zelltypen der humanen Lunge erhalten bleiben. Mit Hilfe dieses Modells und primären und permanenten humanen Zellen wurden saisonale, pandemische, porzine, HPAIV und niedrigpathogene aviäre Influenzaviren (LPAIV) systematisch hinsichtlich Replikation, Cytokininduktion und Zelltropismus verglichen. HPAIV replizierten wie auch saisonale und pandemische Viren zu hohen Titern, während sich LPAIV und ein porzines Virus kaum vermehrten. Einhergehend mit dem Vorhandensein aviärer Rezeptoren waren LPAIV dennoch fähig Lungenkulturen und Zellen zu infizieren und es fanden sich keine Unterschiede im Vorhandensein und in der Lokalisation viraler Proteine. Die Infektion mit HPAIV und LPAIV führten im Lungenmodell zu einer erhöhten Induktion von IP10, MIP1β, IFNβ und IL1β, während saisonale und pandemische H1N1-Viren nur geringe Cytokinspiegel hervorriefen. Trotz der hier beobachteten Unterschiede in der Replikation und Cytokininduktion infizierten alle Viren überwiegend Typ II Pneumozyten. Dies impliziert, dass sich die gezeigten Unterschiede zwischen saisonalen und aviären Viren nicht durch Unterschiede im Zelltropismus erklären lassen. Die im Rahmen dieser Studie erzielten Ergebnisse korrelieren gut mit klinischen Beobachtungen. Dies verdeutlicht den Wert humaner ex vivo Kulturen um weitere Einblicke in das pathophysiologische Verhalten von Pathogenen zu bekommen. / The emergence of the pandemic H1N1 influenza A virus in 2009 and the continuous threat by highly pathogenic avian H5N1 human infections underlines the importance of zoonotic transmissions. The inability of most animal influenza viruses to replicate efficiently in the human respiratory tract and the high virulence of highly pathogenic avian H5N1 viruses (HPAIV) are still not fully understood. Several models have been used to study influenza virus infections including human cell lines that lack the complexity and cell diversity of the human lung. Therefore, a human lung explant model in which the three-dimensional structure of the human lung is preserved along with the different cell-cell interactions was established. Using this model and commonly used primary and permanent respiratory cells, replication, cytokine induction and cell tropism of human, avian, swine and pandemic 2009 virus was systematically compared. It was shown that HPAIV as well as seasonal and pandemic 2009 viruses replicated to high titers while a low pathogenic avian (LPAIV) or a classical swine virus only replicated inefficiently. However, along with the presence of avian receptors, LPAIV was able to infect human lung explants and cells and there were no differences in abundance and localization of proteins. Infection of human lung explants with the HPAIV and LPAIV lead to a pronounced induction of IP10, MIP1β, IFNβ and IL1β while seasonal and pandemic 2009 viruses caused only a low cytokine response. Despite their differences in replication and cytokine induction, LPAIV and the seasonal virus both primarily targeted type II pneumocytes suggesting that the observed differences between the two viruses are not due to differences in cell tropism in the human lower respiratory tract. The experimental findings obtained in this study are compatible with clinical observations highlighting the value of ex vivo human lung explants to provide insights into viral pathophysiological behavior in humans.