The research described in this dissertation is divided into two sections. The first section focuses on mass spectrometry-based bottom-up proteomics application to identify fungal protein biomarkers of invasive aspergillosis infection. The second part focuses on instrument development to improve current ionization and dissociation technologies for characterizing topology and substructure of protein complexes. Part I of this dissertation describes the identification and validation of protein biomarkers for Invasive Aspergillosis (IA), a fatal pulmonary infection. Aspergillus fumigatus, the organism responsible for this disease, is an opportunistic fungus. Immunocompromised individuals can suffer from IA due to impaired immune response. The current diagnostic tools are time-consuming and have variable sensitivity and specificity. Hence, treatments for IA are often administered too late. The goal of this research is to use mass spectrometry to identify and validate novel fungal protein biomarkers for IA. To tackle this challenge, several systems were studied. Commercial Aspergillus antigen was used for method development, and to serve as standards for spiking and comparison. Mouse models of different disease manifestations were used in the initial study to compare proteomic differences in carefully controlled disease states. Although it was not successful in providing candidate biomarkers, the mouse samples provided host response protein data. Human patient samples yielded the most promising results. Several Aspergillus proteins have been identified and validated from patient bronchoalveolar lavage fluid, and could have the potential to be later used on a diagnostic platform. Part II describes two instrument development projects: incorporation of a surface-induced dissociation device into a commercial ion mobility time-of-flight mass spectrometer, and the development of a paper spray ionization source. Protein complexes are often studied using collision-induced dissociation (CID), which does not provide enough substructure information. Surface-induced dissociation (SID) allows access to higher energy fragmentation pathways, which generates more useful substructure information. Its potential is demonstrated with three systems here-- one metal cluster and two protein complexes. All systems show that SID can provide more useful structural information than CID under similar conditions. The development of a paper spray (PS) source for protein complex ionization provides another way to study protein complexes. Chapter 9 shows that this ionization method can also be applied to protein complexes. Under the same conditions as its nanospray counterpart, similar mass spectra can be obtained using PS. This exciting result is the first demonstrations that PS can be used for protein complexes while maintaining each protein complex's native structure and conformation.

Asthma is a heterogeneous condition characterised by variable airflow obstruction, airway inflammation and hyper-responsiveness. Fungal sensitisation has been associated with asthma severity; and airways colonisation by the pathogenic fungus Aspergillus fumigatus has been associated with a progressive lung function decline in allergic bronchopulmonary aspergillosis. Interest in the home environment as a source of fungal exposure is increasing; however, there are still no accepted guidelines or standardised methods for the quantification of indoor fungal levels. We sought to i) investigate typical airborne fungal spore concentrations in homes and to compare exposure levels in asthma patients grouped according to either A. fumigatus sensitisation or sputum culture; ii) fully characterise the fungal biota capable of colonising the airways in patients with asthma; and iii) define the clinical characteristics of fungal colonisation. Aspergillus/Penicillium-type conidia exhibited indoor predominance and independence of season, and were highest in old, terraced, non-insulated properties. A. fumigatus was the predominant fungus isolated from sputum and IgE sensitisation to A. fumigatus was associated with reduced post-bronchodilator FEV1 in patients with asthma. Sputum culture of filamentous fungi was also associated with reduced lung function, with predominant fungi comprising Aspergillus and Penicillium species; notably Penicillium piceum and species of Aspergillus section Nigri. Higher levels of airborne A. fumigatus were detected in homes of asthmatics with a positive sputum culture for A. fumigatus. In conclusion, sensitisation to A. fumigatus and airways colonisation by fungi are associated with reduced lung function in moderate to severe asthma; and this study provides a direct link between home exposure and airways colonisation.

Univ., Diss., 2009--Marburg. / Enth. Sonderdr. aus versch. Zeitschriften.

Techn. Universiẗat, Diss., 2005--München.

Aspergilose é a doença fúngica mais comum em cães com alterações clínicas nasais e Aspergillus fumigatus é a espécie mais encontrada em animais com envolvimento primário do trato respiratório superior. Por serem agentes cosmopolitas, diversas espécies de Aspergillus estão freqüentemente presentes na biota anemófila e, portanto, estão também comumente presentes no trato respiratório superior de cães sadios. Devido a isto, resultados positivos no exame de cultivo não são suficientes para firmar o diagnóstico de aspergilose nasal. Já o exame sorológico, serve de bom suporte ao clínico para o diagnóstico de aspergilose nasal canina, principalmente com o emprego da técnica de eletrosinerese, a qual apresenta alta sensibilidade e especificidade. Apesar da aspergilose nasal canina ser relatada com relativa freqüência em diversos países, a literatura veterinária brasileira não registra a ocorrência desta doença. Esta situação sugere que a mesma não está sendo colocada como casuística diferencial no diagnóstico das prováveis moléstias de cães portadores de descarga nasal em âmbito nacional. Os objetivos principais deste trabalho foram a pesquisa de anticorpos circulantes anti-Aspergillus fumigatus através do teste sorológico de eletrosinerese e o cultivo fúngico de amostras obtidas de 83 cães com descarga nasal, atendidos no Hospital de Clínicas Veterinárias da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, no período de agosto de 2006 a julho de 2007. O objetivo secundário foi verificar uma possível concordância entre os resultados obtidos por estas duas técnicas laboratoriais. Doze cães (14,4%) tiveram resultados positivos no teste sorológico de eletrosinerese. Não houve nenhuma associação significativa entre a variável sorologia (positiva e negativa) com as demais variáveis (raça, sexo, conformação craniana e faixa etária). Quatorze gêneros foram isolados no cultivo fúngico. Não houve concordância entre os exames sorológico e cultivo, posto que dos 12/83 animais que tiveram exame sorológico positivo, apenas 2/12 (16,6%) cães tiveram cultivo fúngico positivo para Aspergillus fumigatus. Cultivo fúngico realizado a partir de amostras colhidas por swab direto da descarga nasal deve ser analisado com cautela para se estabelecer o diagnóstico de aspergilose nasal canina. A partir dos resultados obtidos neste trabalho e dos relatos encontrados em vários outros países, pode-se concluir que a doença provavelmente não seja rara no Brasil, e que os clínicos veterinários deveriam incluir esta entidade nosológica como casuística potencial no diagnóstico diferencial das doenças do trato respiratório superior de cães, o que certamente possibilitará estudos comparativos (clínicos e epidemiológicos) de dados obtidos de diversas regiões do Brasil. / Aspergillosis is the most common fungal disease in dogs with nasal disorders and Aspergillus fumigatus is the most often specie found in animals with primary involvement of the upper respiratory tract. As cosmopolitans agents, diverse species of Aspergillus are frequently found in the anemophilous biota, therefore, it is also found in the upper respiratory tract of healthy dogs. Due this, fungal culture positive results are not sufficient to confirm nasal aspergillosis in dogs. Nevertheless, serological tests can serve as a good support to the clinicians for the diagnosis of canine nasal aspergillosis, specially with electrosyneresis technique, which presents high sensitivity and specificity. Despite canine nasal aspergillosis have been frequently described in different countries, in the Brazilian veterinary literature does not register any occurrence. This finding can suggest that nasal aspergillosis has not been included in the differential diagnosis of dogs with nasal discharge in this country. The main aims of this study were the search for the presence of anti-Aspergillus fumigatus circulating antibodies means electrosyneresis of technique and to obtain positive cultures of Aspergillus fumigatus from 83 dogs with nasal discharge, presented at the Hospital de Clínicas Veterinárias da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, from August, 2006 to July, 2007. Another purpose of this study was to observe whether a correlation could be established between the methods. Twelve dogs (14,4%) were identified as serological positive. No significant association was observed among the serological test (positive and negative) and dog’s features (breed, sex, head conformation and age). Fourteen fungi genus were isolated in cultures. There was no correlation between the serological test and the culture. Only 2 from a contingent of 12 dogs with positive serological test had simultaneous positives cultures to Aspergillus fumigatus. Cultures obtained from samples collected with swab from nasal discharge must be analyzed with caution to establish the diagnosis of canine nasal aspergillosis. Taken into account the herein presented results and looking into the results from reports elsewhere, we conclude that canine nasal aspergillosis probably is not rare in our environment, and veterinarians must include this entity in the differential diagnosis of dog´s upper respiratory tract disorders. The data generated by the present dissertation will undoubtedly contribute to further studies and for comparative trials about the frequency of the disease in dogs from other regions of Brazil.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Aspergillus fumigatus é o principal agente etiológico da aspergilose invasiva, infecção fúngica oportunista com altas taxas de mortalidade afetando, principalmente, pacientes com neutropenia profunda e prolongada. Durante o processo de invasão e disseminação características desta infecção sistêmica, os conídios do fungo inalados e não eliminados pelas células do sistema imune inato diferenciam-se em hifas que, por sua vez, são angioinvasivas. Pouco se conhece sobre as moléculas da parede celular envolvidas na patogênese do A. fumigatus e/ou secretadas por este patógeno. Neste contexto, este trabalho procura ampliar o entendimento desta doença através do estudo de proteínas diferencialmente expressas na superfície de A. fumigatus durante a morfogênese. Foi utilizada uma abordagem proteômica e foram estudados extratos de superfície de células de A. fumigatus em diferentes estágios durante o processo de filamentação. Estas células foram denominadas, de acordo com o tempo de cultivo e a morfologia, como: TG6h (tubo germinativo), H12h ou H72h (hifas). As proteínas de superfície celular foram extraídas, a partir de células intactas, por tratamento brando com o agente redutor DTT (ditiotreitol). Observou-se que o perfil funcional das proteínas expressas por H12h e H72h foi similar, com exceção de proteínas relacionadas à resposta ao estresse, enquanto o perfil para TG6h apresentou diferenças significativas para vários grupos funcionais de proteínas quando comparado às hifas. Desta forma, foram realizados experimentos de proteômica diferencial entre tubo germinativo (TG6h) e a hifa madura (H72h), pela técnica de DIGE (differential gel electrophoresis). Os resultados revelaram que entre as proteínas diferencialmente expressas, aquelas relacionadas às vias de biossíntese e outras denominadas multifuncionais encontraram-se superexpressas em TG6h. Em relação às proteínas de resposta a estresse, observou-se que algumas HSPs eram mais expressas neste morfotipo, enquanto a MnSOD, relativa à resposta ao estresse oxidativo, era mais abundante na hifa. Com exceção da PhiA, integrante da parede celular, as proteínas identificadas como diferencialmente expressas na superfície do A. fumigatus não possuem sinal para secreção identificável, enquadrando-se nas proteínas atípicas de superfície. Foi verificada a integridade da membrana celular após tratamento com DTT, bem como a marcação por biotina das proteínas extraídas, o que comprovou sua localização superficial na célula fúngica. Hipóteses de que estas proteínas sejam endereçadas à parede celular por via secretória alternativa sustentam estes dados. Estas evidências foram confirmadas pelo fato de não terem sido encontradas as mesmas proteínas da superfície na análise do secretoma do A. fumigatus. Além disso, todas as proteínas caracterizadas no secretoma apresentavam sinal de secreção determinado pelo FunSecKB (www.proteomics.ysu.edu/secretomes/fungi.php). A análise do secretoma foi realizada utilizando-se a cepa selvagem AF293 e a mutante ∆prtT, mutante para um fator de transcrição que atua na regulação da secreção de proteases. Os resultados revelam a ALP1 como expressa na cepa selvagem, assim como outras proteases importantes para virulência e desenvolvimento da célula fúngica, estando suprimidas quando o gene prtT foi deletado. / Aspergillus fumigatus is the main etiologic agent of invasive aspergillosis (IA), a opportunistic a life-threatening disease for immunocompromised hosts, especially those with acute and prolonged neutropenia. During the invasion and dissemination, which occurs in this systemic infection, the A. fumigatus conidia, after its inhalation, germinates into angioinvasive hyphae in case the innate immune response fails in eliminate these cells. Little is known about the cell wall molecules and/or the secreted proteins involved on the A. fumigatus pathogenesis, at this context the present work aims to amplify the knowledge about the aspergillosis by studying the differentially surface proteins of A. fumigatus during the filamentation process. These cells were denominated according to their morphology and their growth time as: TG6h (germ tubes), H12h and H72h (hyphae). The surface proteins were mildly extracted from intact cells using the reducing agent DTT (dithiothreitol). The functional profile of the H12h and H72h were similar except for the stress response proteins, while the TG6h presented significant differences for several functional groups. On this base, the DIGE (differential gel electrophoresis) was performed using the surface extracted proteins of the germ tubes (TG6h) and mature hyphae (H72h) cells. The results indicate that multiple functional proteins and proteins related to the biosynthesis pathways were overexpressed at TG6h. Some stress response proteins as the HSPs were overexpressed on this morphotype while the MnSOD, oxidative stress responsive protein, was most abundant at the hyphae. PhiA, an integrant protein of the cell wall, was the only protein with a secretion signal sequence. All other proteins identified on the cell surface lack an identifiable secretion sign, and are denominated atypical proteins. The plasma membrane integrity was verified after the mild extraction using DTT, and also the biotinylation of the cell extracted proteins, which ensured these proteins surface localization on the fungal cell. There are hypothesis that some proteins can be transport to the cell wall by alternative pathways and support the results found for this work. These evidences were confirmed by the fact that the proteins identified at the surface were not the same identified on the A. fumigatus secretome. Besides, all proteins identified on the secretome presented secretion signal determinate by the FunSecKB (www.proteomics.ysu.edu/secretomes/fungi.php). The secretome analysis was performed using the wild type AF293 and the ∆prtT mutant, lacking a transcription factor that regulates proteases secretion. The results demonstrate ALP1 overexpressed on the wild type and also other proteases important to virulence and development of the fungal cell suppressed when prtT was deleted.

Aspergilose é a doença fúngica mais comum em cães com alterações clínicas nasais e Aspergillus fumigatus é a espécie mais encontrada em animais com envolvimento primário do trato respiratório superior. Por serem agentes cosmopolitas, diversas espécies de Aspergillus estão freqüentemente presentes na biota anemófila e, portanto, estão também comumente presentes no trato respiratório superior de cães sadios. Devido a isto, resultados positivos no exame de cultivo não são suficientes para firmar o diagnóstico de aspergilose nasal. Já o exame sorológico, serve de bom suporte ao clínico para o diagnóstico de aspergilose nasal canina, principalmente com o emprego da técnica de eletrosinerese, a qual apresenta alta sensibilidade e especificidade. Apesar da aspergilose nasal canina ser relatada com relativa freqüência em diversos países, a literatura veterinária brasileira não registra a ocorrência desta doença. Esta situação sugere que a mesma não está sendo colocada como casuística diferencial no diagnóstico das prováveis moléstias de cães portadores de descarga nasal em âmbito nacional. Os objetivos principais deste trabalho foram a pesquisa de anticorpos circulantes anti-Aspergillus fumigatus através do teste sorológico de eletrosinerese e o cultivo fúngico de amostras obtidas de 83 cães com descarga nasal, atendidos no Hospital de Clínicas Veterinárias da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, no período de agosto de 2006 a julho de 2007. O objetivo secundário foi verificar uma possível concordância entre os resultados obtidos por estas duas técnicas laboratoriais. Doze cães (14,4%) tiveram resultados positivos no teste sorológico de eletrosinerese. Não houve nenhuma associação significativa entre a variável sorologia (positiva e negativa) com as demais variáveis (raça, sexo, conformação craniana e faixa etária). Quatorze gêneros foram isolados no cultivo fúngico. Não houve concordância entre os exames sorológico e cultivo, posto que dos 12/83 animais que tiveram exame sorológico positivo, apenas 2/12 (16,6%) cães tiveram cultivo fúngico positivo para Aspergillus fumigatus. Cultivo fúngico realizado a partir de amostras colhidas por swab direto da descarga nasal deve ser analisado com cautela para se estabelecer o diagnóstico de aspergilose nasal canina. A partir dos resultados obtidos neste trabalho e dos relatos encontrados em vários outros países, pode-se concluir que a doença provavelmente não seja rara no Brasil, e que os clínicos veterinários deveriam incluir esta entidade nosológica como casuística potencial no diagnóstico diferencial das doenças do trato respiratório superior de cães, o que certamente possibilitará estudos comparativos (clínicos e epidemiológicos) de dados obtidos de diversas regiões do Brasil. / Aspergillosis is the most common fungal disease in dogs with nasal disorders and Aspergillus fumigatus is the most often specie found in animals with primary involvement of the upper respiratory tract. As cosmopolitans agents, diverse species of Aspergillus are frequently found in the anemophilous biota, therefore, it is also found in the upper respiratory tract of healthy dogs. Due this, fungal culture positive results are not sufficient to confirm nasal aspergillosis in dogs. Nevertheless, serological tests can serve as a good support to the clinicians for the diagnosis of canine nasal aspergillosis, specially with electrosyneresis technique, which presents high sensitivity and specificity. Despite canine nasal aspergillosis have been frequently described in different countries, in the Brazilian veterinary literature does not register any occurrence. This finding can suggest that nasal aspergillosis has not been included in the differential diagnosis of dogs with nasal discharge in this country. The main aims of this study were the search for the presence of anti-Aspergillus fumigatus circulating antibodies means electrosyneresis of technique and to obtain positive cultures of Aspergillus fumigatus from 83 dogs with nasal discharge, presented at the Hospital de Clínicas Veterinárias da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, from August, 2006 to July, 2007. Another purpose of this study was to observe whether a correlation could be established between the methods. Twelve dogs (14,4%) were identified as serological positive. No significant association was observed among the serological test (positive and negative) and dog’s features (breed, sex, head conformation and age). Fourteen fungi genus were isolated in cultures. There was no correlation between the serological test and the culture. Only 2 from a contingent of 12 dogs with positive serological test had simultaneous positives cultures to Aspergillus fumigatus. Cultures obtained from samples collected with swab from nasal discharge must be analyzed with caution to establish the diagnosis of canine nasal aspergillosis. Taken into account the herein presented results and looking into the results from reports elsewhere, we conclude that canine nasal aspergillosis probably is not rare in our environment, and veterinarians must include this entity in the differential diagnosis of dog´s upper respiratory tract disorders. The data generated by the present dissertation will undoubtedly contribute to further studies and for comparative trials about the frequency of the disease in dogs from other regions of Brazil.

Submitted by RAYZA MORGANNA FARIAS CAVALCANTI null (rayzaaires@hotmail.com) on 2017-05-12T13:58:30Z No. of bitstreams: 1 Rayza Morganna Farias Cavalcanti - Dissertação.pdf: 2306411 bytes, checksum: 60982615938f2943b9d769d2c7cc2ae6 (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-05-12T14:31:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 cavalcanti_rmf_me_araiq.pdf: 2306411 bytes, checksum: 60982615938f2943b9d769d2c7cc2ae6 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-12T14:31:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 cavalcanti_rmf_me_araiq.pdf: 2306411 bytes, checksum: 60982615938f2943b9d769d2c7cc2ae6 (MD5) Previous issue date: 2017-04-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O Bioma Caatinga, caracterizado por apresentar condições extremas de habitat, é fonte de novas espécies, como microrganismos endofíticos, com potencial para síntese de compostos bioativos. Esses microrganismos são responsáveis por produzir uma série de metabólitos de interesse biotecnológico como, por exemplo, enzimas. Entretanto, a tanase, enzima que hidrolisa ésteres e ligações laterais de taninos hidrolisáveis, produzindo glicose e ácido gálico ou ácido elágico, ainda é pouco explorada quanto à produção por microrganismos endofíticos. Essas enzimas são de grande interesse biotecnológico para aplicações em indústrias alimentícias, químicas, de bebidas e farmacêuticas. Diante disto, este estudo visou à prospecção de tanases produzidas por fungos endofíticos associados às plantas ricas em taninos encontradas no Bioma Caatinga. A partir das cascas das plantas angico (Anadenanthera colubrina Vell.), aroeira (Myracrodruon urundeuva Allemao), baraúna (Schinopsis brasiliensis Engl.), cajueiro (Anacardium occidentale L.) e catingueira (Caesalpinia pyramidalis Tul), coletadas no estado da Paraíba, foi possível isolar 16 fungos endofíticos para seleção dos produtores de tanase. Dentre os isolados, as espécies Aspergillus niger ANG18 e Aspergillus fumigatus CAS21 apresentaram maior produção de tanase. No processo de otimização em Fermentação Submersa (FSbm) A. niger ANG18 apresentou maior nível enzimático quando cultivado em meio Khanna, com 2% de ácido tânico, por 24 horas, a 37ºC e 120 rpm, enquanto que A. fumigatus CAS21 os maiores níveis foram atingidos quando cultivado em meio mineral, adicionado de peptona, 2% de ácido tânico, por 24 horas, a 37ºC e 120 rpm. Em Fermentação em Estado Sólido (FES), A. niger ANG18, cultivado em folhas de eucalipto, umidificado com sais de Khanna (1:1) por 96 horas a 37ºC, apresentou maior produção de tanase quando comparado a A. fumigatus CAS21. Contudo, A fumigatus CAS21 apresentou a maior produção da enzima de interesse em FSbm, a qual foi purificada 4,9 vezes com taxa de recuperação de 10,2%, e caracterizada bioquimicamente. A tanase de A. fumigatus CAS21 tem massa molecular nativa de 60,34 kDa, com 39,1% de conteúdo de carboidratos. Apresentou temperatura ótima de atividade no intervalo de 30 a 40ºC e tempo de meia vida (t50) de 120 minutos e 90 minutos a 30ºC e 45ºC, respectivamente. O valor de pH ótimo aparente de atividade foi 5,0, mantendo-se ativa quando incubada no pH 5,0-6,0 por 24 horas. A atividade enzimática foi aumentada na presença ureia, e inibida na presença de íons de ferro e concentrações de ácido gálico acima de 5mM. Os parâmetros cinéticos foram analisados e a enzima mostrou maior afinidade pelo substrato propil galato (Km = 3,61 mM) quando comparado ao ácido tânico (Km = 6,38 mM) e ao metil galato (Km = 6,28 mM). Contudo, a maior eficiência catalítica foi obtida para o substrato ácido tânico. A aplicação do extrato bruto para tratamento de efluentes de curtume do couro de bode reduziu em 89% o teor de taninos presentes após 2 horas de incubação. Deste modo, o fungo endofítico A. fumigatus CAS21 isolado de planta da Caatinga mostrou-se como um interessante produtor de tanase com propriedades importantes para aplicação industrial. / Caatinga Biome is characterized by extreme habitat conditions and presents source of new species like endophytic microorganisms with potential bioactive compounds synthesis. These microorganisms are responsible to produce metabolites with biotechnological interest, such as enzymes. However, tannase, an enzyme that promote esters and side bonds of hydrolyzes hydrolyzable tannins, producing glucose and gallic acid or ellagic acid, is still little explored in terms of its production by endophytic microorganisms. These enzymes have great biotechnological importance for applications in food, chemical, beverage and pharmaceutical industries. In view of this, this study aims to prospect the production of tannases by endophytic fungi associated with tannins rich plants from the Caatinga Biome. Barks of angico, aroeira, barauna, cashew and catingueira plants were collected in the State of Paraíba and 16 endophytic fungi strains were isolated for the selection of tannase producers. The species Aspergillus niger ANG18 and Aspergillus fumigatus CAS21 showed higher tannase production among the isolated microorganisms. In the process of optimization in Submerged Fermentation (SbmF) A. niger ANG18 presented a higher enzymatic level when grown in Khanna medium, with 2% tannic acid, for 24 hours at 37ºC and 120 rpm, while A. fumigatus CAS21 presented better levels when grown in mineral medium, with addition of peptone, 2% of tannic acid, for 24 hours, at 37ºC and 120 rpm. Under solid state fermentation (SSF), A. niger ANG18 cultivated in eucalypt leaves, humidified with Khanna salts (1:1) for 96 hours at 37ºC, presented higher tannase level when compared to A. fumigatus CAS21. However, A. fumigatus CAS21 showed the highest production of tannase under FSbm, which was purified 4.9 fold with recovery of 10.2%, and biochemically characterized. The A. fumigatus CAS21 tannase has a native molecular mass of 60.34 kDa, with 39.1% carbohydrate content. It presents optimum temperature of activity in the range from 30 to 40ºC and half-fife (t50) of 120 minutes and 90 minutes at 30ºC and 45ºC, respectively. The optimum apparent pH of activity was 5.0 and its activity was maintained when incubated at pH 5.0-6.0 for 24 hours. The tannase activity was improved in the presence of urea, and inhibited in the presence of iron ions and gallic acid above 5 mM. The kinetic parameters were analyzed and the enzyme showed higher affinity for the propyl gallate substrate (Km = 3.61 mM) compared to tannic acid (Km = 6.38 mM) and methyl gallate (Km = 6.28 mM). On the other hand, the best catalytic efficiency was obtained for the substrate tannic acid. The application of the crude filtrate to treat tannery effluents from goat leather reduced the tannin content 89% after 2 hours of incubation. Thus, the endophytic fungi A. fumigatus CAS21 isolated from Caatinga plant was an interesting producer of tannase with important properties for industrial application.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Aspergillus fumigatus é o principal agente etiológico da aspergilose invasiva, infecção fúngica oportunista com altas taxas de mortalidade afetando, principalmente, pacientes com neutropenia profunda e prolongada. Durante o processo de invasão e disseminação características desta infecção sistêmica, os conídios do fungo inalados e não eliminados pelas células do sistema imune inato diferenciam-se em hifas que, por sua vez, são angioinvasivas. Pouco se conhece sobre as moléculas da parede celular envolvidas na patogênese do A. fumigatus e/ou secretadas por este patógeno. Neste contexto, este trabalho procura ampliar o entendimento desta doença através do estudo de proteínas diferencialmente expressas na superfície de A. fumigatus durante a morfogênese. Foi utilizada uma abordagem proteômica e foram estudados extratos de superfície de células de A. fumigatus em diferentes estágios durante o processo de filamentação. Estas células foram denominadas, de acordo com o tempo de cultivo e a morfologia, como: TG6h (tubo germinativo), H12h ou H72h (hifas). As proteínas de superfície celular foram extraídas, a partir de células intactas, por tratamento brando com o agente redutor DTT (ditiotreitol). Observou-se que o perfil funcional das proteínas expressas por H12h e H72h foi similar, com exceção de proteínas relacionadas à resposta ao estresse, enquanto o perfil para TG6h apresentou diferenças significativas para vários grupos funcionais de proteínas quando comparado às hifas. Desta forma, foram realizados experimentos de proteômica diferencial entre tubo germinativo (TG6h) e a hifa madura (H72h), pela técnica de DIGE (differential gel electrophoresis). Os resultados revelaram que entre as proteínas diferencialmente expressas, aquelas relacionadas às vias de biossíntese e outras denominadas multifuncionais encontraram-se superexpressas em TG6h. Em relação às proteínas de resposta a estresse, observou-se que algumas HSPs eram mais expressas neste morfotipo, enquanto a MnSOD, relativa à resposta ao estresse oxidativo, era mais abundante na hifa. Com exceção da PhiA, integrante da parede celular, as proteínas identificadas como diferencialmente expressas na superfície do A. fumigatus não possuem sinal para secreção identificável, enquadrando-se nas proteínas atípicas de superfície. Foi verificada a integridade da membrana celular após tratamento com DTT, bem como a marcação por biotina das proteínas extraídas, o que comprovou sua localização superficial na célula fúngica. Hipóteses de que estas proteínas sejam endereçadas à parede celular por via secretória alternativa sustentam estes dados. Estas evidências foram confirmadas pelo fato de não terem sido encontradas as mesmas proteínas da superfície na análise do secretoma do A. fumigatus. Além disso, todas as proteínas caracterizadas no secretoma apresentavam sinal de secreção determinado pelo FunSecKB (www.proteomics.ysu.edu/secretomes/fungi.php). A análise do secretoma foi realizada utilizando-se a cepa selvagem AF293 e a mutante ∆prtT, mutante para um fator de transcrição que atua na regulação da secreção de proteases. Os resultados revelam a ALP1 como expressa na cepa selvagem, assim como outras proteases importantes para virulência e desenvolvimento da célula fúngica, estando suprimidas quando o gene prtT foi deletado. / Aspergillus fumigatus is the main etiologic agent of invasive aspergillosis (IA), a opportunistic a life-threatening disease for immunocompromised hosts, especially those with acute and prolonged neutropenia. During the invasion and dissemination, which occurs in this systemic infection, the A. fumigatus conidia, after its inhalation, germinates into angioinvasive hyphae in case the innate immune response fails in eliminate these cells. Little is known about the cell wall molecules and/or the secreted proteins involved on the A. fumigatus pathogenesis, at this context the present work aims to amplify the knowledge about the aspergillosis by studying the differentially surface proteins of A. fumigatus during the filamentation process. These cells were denominated according to their morphology and their growth time as: TG6h (germ tubes), H12h and H72h (hyphae). The surface proteins were mildly extracted from intact cells using the reducing agent DTT (dithiothreitol). The functional profile of the H12h and H72h were similar except for the stress response proteins, while the TG6h presented significant differences for several functional groups. On this base, the DIGE (differential gel electrophoresis) was performed using the surface extracted proteins of the germ tubes (TG6h) and mature hyphae (H72h) cells. The results indicate that multiple functional proteins and proteins related to the biosynthesis pathways were overexpressed at TG6h. Some stress response proteins as the HSPs were overexpressed on this morphotype while the MnSOD, oxidative stress responsive protein, was most abundant at the hyphae. PhiA, an integrant protein of the cell wall, was the only protein with a secretion signal sequence. All other proteins identified on the cell surface lack an identifiable secretion sign, and are denominated atypical proteins. The plasma membrane integrity was verified after the mild extraction using DTT, and also the biotinylation of the cell extracted proteins, which ensured these proteins surface localization on the fungal cell. There are hypothesis that some proteins can be transport to the cell wall by alternative pathways and support the results found for this work. These evidences were confirmed by the fact that the proteins identified at the surface were not the same identified on the A. fumigatus secretome. Besides, all proteins identified on the secretome presented secretion signal determinate by the FunSecKB (www.proteomics.ysu.edu/secretomes/fungi.php). The secretome analysis was performed using the wild type AF293 and the ∆prtT mutant, lacking a transcription factor that regulates proteases secretion. The results demonstrate ALP1 overexpressed on the wild type and also other proteases important to virulence and development of the fungal cell suppressed when prtT was deleted.

Aspergilose é a doença fúngica mais comum em cães com alterações clínicas nasais e Aspergillus fumigatus é a espécie mais encontrada em animais com envolvimento primário do trato respiratório superior. Por serem agentes cosmopolitas, diversas espécies de Aspergillus estão freqüentemente presentes na biota anemófila e, portanto, estão também comumente presentes no trato respiratório superior de cães sadios. Devido a isto, resultados positivos no exame de cultivo não são suficientes para firmar o diagnóstico de aspergilose nasal. Já o exame sorológico, serve de bom suporte ao clínico para o diagnóstico de aspergilose nasal canina, principalmente com o emprego da técnica de eletrosinerese, a qual apresenta alta sensibilidade e especificidade. Apesar da aspergilose nasal canina ser relatada com relativa freqüência em diversos países, a literatura veterinária brasileira não registra a ocorrência desta doença. Esta situação sugere que a mesma não está sendo colocada como casuística diferencial no diagnóstico das prováveis moléstias de cães portadores de descarga nasal em âmbito nacional. Os objetivos principais deste trabalho foram a pesquisa de anticorpos circulantes anti-Aspergillus fumigatus através do teste sorológico de eletrosinerese e o cultivo fúngico de amostras obtidas de 83 cães com descarga nasal, atendidos no Hospital de Clínicas Veterinárias da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, no período de agosto de 2006 a julho de 2007. O objetivo secundário foi verificar uma possível concordância entre os resultados obtidos por estas duas técnicas laboratoriais. Doze cães (14,4%) tiveram resultados positivos no teste sorológico de eletrosinerese. Não houve nenhuma associação significativa entre a variável sorologia (positiva e negativa) com as demais variáveis (raça, sexo, conformação craniana e faixa etária). Quatorze gêneros foram isolados no cultivo fúngico. Não houve concordância entre os exames sorológico e cultivo, posto que dos 12/83 animais que tiveram exame sorológico positivo, apenas 2/12 (16,6%) cães tiveram cultivo fúngico positivo para Aspergillus fumigatus. Cultivo fúngico realizado a partir de amostras colhidas por swab direto da descarga nasal deve ser analisado com cautela para se estabelecer o diagnóstico de aspergilose nasal canina. A partir dos resultados obtidos neste trabalho e dos relatos encontrados em vários outros países, pode-se concluir que a doença provavelmente não seja rara no Brasil, e que os clínicos veterinários deveriam incluir esta entidade nosológica como casuística potencial no diagnóstico diferencial das doenças do trato respiratório superior de cães, o que certamente possibilitará estudos comparativos (clínicos e epidemiológicos) de dados obtidos de diversas regiões do Brasil. / Aspergillosis is the most common fungal disease in dogs with nasal disorders and Aspergillus fumigatus is the most often specie found in animals with primary involvement of the upper respiratory tract. As cosmopolitans agents, diverse species of Aspergillus are frequently found in the anemophilous biota, therefore, it is also found in the upper respiratory tract of healthy dogs. Due this, fungal culture positive results are not sufficient to confirm nasal aspergillosis in dogs. Nevertheless, serological tests can serve as a good support to the clinicians for the diagnosis of canine nasal aspergillosis, specially with electrosyneresis technique, which presents high sensitivity and specificity. Despite canine nasal aspergillosis have been frequently described in different countries, in the Brazilian veterinary literature does not register any occurrence. This finding can suggest that nasal aspergillosis has not been included in the differential diagnosis of dogs with nasal discharge in this country. The main aims of this study were the search for the presence of anti-Aspergillus fumigatus circulating antibodies means electrosyneresis of technique and to obtain positive cultures of Aspergillus fumigatus from 83 dogs with nasal discharge, presented at the Hospital de Clínicas Veterinárias da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, from August, 2006 to July, 2007. Another purpose of this study was to observe whether a correlation could be established between the methods. Twelve dogs (14,4%) were identified as serological positive. No significant association was observed among the serological test (positive and negative) and dog’s features (breed, sex, head conformation and age). Fourteen fungi genus were isolated in cultures. There was no correlation between the serological test and the culture. Only 2 from a contingent of 12 dogs with positive serological test had simultaneous positives cultures to Aspergillus fumigatus. Cultures obtained from samples collected with swab from nasal discharge must be analyzed with caution to establish the diagnosis of canine nasal aspergillosis. Taken into account the herein presented results and looking into the results from reports elsewhere, we conclude that canine nasal aspergillosis probably is not rare in our environment, and veterinarians must include this entity in the differential diagnosis of dog´s upper respiratory tract disorders. The data generated by the present dissertation will undoubtedly contribute to further studies and for comparative trials about the frequency of the disease in dogs from other regions of Brazil.