A biomassa do bagaço da cana-de-açúcar é composta de material lignocelulósico, principalmente celulose e hemicelulose, os quais são constituídos por açúcares de alta energia que podem ser convertidos a etanol. No entanto, a associação recalcitrante dessa biomassa impõe um grande desafio para a produção de biocombustíveis de segunda geração, devido à dificuldade em recuperar esses açúcares sob a forma de monômeros com elevado grau de pureza. Na natureza, muitos microrganismos realizam a degradação da biomassa de plantas através da ação de múltiplas CAZymes. Dentre esses, os fungos filamentosos se destacam devido a sua capacidade de produzir misturas enzimáticas altamente específicas para os substratos com que se deparam e, por essa razão, são a principal fonte das enzimas utilizadas nos coquetéis enzimáticos comercializados, em especial a espécie T. reesei. Contudo, esses coquetéis precisam ser otimizados e, para tanto, é necessário investir no estudo de outros fungos, como o A. fumigatus. Apesar de patogênico, o mesmo é considerado um importante produtor de enzimas lignocelulolíticas, cujas eficiências são aumentadas devido ao efeito sinérgico entre elas. Dessa forma, uma melhor compreensão dos mecanismos utilizados por esse fungo durante a exposição a biomassas vegetais é necessária. Nesse sentido, a determinação das atividades de celulases e xilanases após diferentes tempos de incubação foi realizada nos sobrenadantes das culturas do A. fumigatus crescido em SEB e em frutose, resultando em valores 21, 59 e 271 vezes maiores para as celulases e 150, 541 e 74 vezes para as xilanases, após 24, 48 e 72 horas de cultivo, respectivamente, na presença do bagaço. Para verificar se as enzimas estavam efetivamente hidrolisando a biomassa, foi realizada a dosagem dos açúcares redutores nos sobrenadantes das culturas em SEB, tendo sido observado um aumento na concentração desses açúcares à medida que o tempo de exposição ao bagaço aumentava. Com o propósito de compreender o mecanismo envolvido na hidrólise do bagaço, foi realizada a análise transcricional do A. fumigatus por RNA-seq, quando esse fungo foi crescido na presença desse substrato, assim como em frutose. A análise dos dados revelou 144 CAZymes induzidas em SEB, frente a 65 reprimidas nessa biomassa. Dentre os genes induzidos, foram identificados muitos potencialmente envolvidos na desconstrução da lignocelulose, como aqueles que codificam endoglucanases, celobiohidrolases, glucosidades, xilanases, xilosidases, manosidases, LPMOs, pectinases, entre outros. Para verificar se essas proteínas estavam sendo secretadas pelo fungo, o secretoma do mesmo foi analisado por espectrometria de massas LC/MS. Com isso, identificou-se uma gama muito maior de proteínas na presença de SEB (130) em comparação ao crescimento em frutose (44), sendo a maioria CAZymes (59%). Todos esses resultados evidenciam o potencial do A. fumigatus na hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar, podendo suas enzimas contribuir para a produção de coquetéis enzimáticos mais eficientes e, consequentemente, para a produção de etanol de segunda geração / Sugarcane bagasse biomass is composed of lignocellulosic material, mainly cellulose and hemicellulose, which are composed of high energy sugars that can be converted into ethanol. However, the recalcitrant association of this biomass imposes a major challenge for the production of second-generation biofuels, due to the difficulty in recovering these sugars in the form of monomers with high purity. In nature, many microorganisms perform the degradation of plant biomass through the action of multiple CAZymes. Among them, filamentous fungi stand out for their ability to produce highly specific enzymatic mixtures for the substrates they are in the presence of and, therefore, they are the main source of enzymes used in commercialized enzymatic cocktails, especially T. reesei. However, these cocktails need to be optimized and, for this reason, it is necessary to invest in the study of other fungi, such as the A. fumigatus. Although pathogenic, it is considered an important producer of lignocellulolytic enzymes, whose efficiencies are increased due to the synergistic effect between them. Thus, a better understanding about the mechanisms used by this fungus during exposure to plant biomass is necessary. In this sense, the determination of cellulases and xylanases activities after different incubation times was performed after collection of supernatants from A. fumigatus grown in SEB and fructose cultures, resulting in 21, 59 and 271-fold higher values for cellulases, and 150, 541 and 74-fold higher values for xylanases, after 24, 48 and 72 hours of cultivation, respectively, in presence of the bagasse. To verify if the enzymes were effectively hydrolyzing the biomass, the supernatants from SEB cultures were collected and the reducing sugars were quantified. An increase in the concentration of these sugars was observed as the exposure time to the bagasse increased. In order to understand the mechanism involved in bagasse hydrolysis, the transcriptional analysis of A. fumigatus grown in the presence of this substrate and in fructose was performed by RNA-seq. Data analysis revealed 144 CAZymes induced by SEB, compared to 65 repressed by this biomass. Among the induced genes, many potentially involved in the lignocellulose deconstruction, such as those encoding for endoglucanases, cellobiohydrolases, glucosidases, xylanases, xylosidases, mannosidases, LPMOs, pectinases, among others, were identified. To verify if these proteins were being secreted, the secretome of the fungus was analyzed by LC/MS mass spectrometry. Hence, a much larger range of proteins was identified in the presence of SEB (130) as compared to growth in fructose (44), most of them being CAZymes (59%). All these results show the potential of A. fumigatus in the hydrolysis of sugarcane bagasse and its enzymes can contribute to the production of more efficient enzymatic cocktails and, consequently, to the production of second-generation ethanol

O fungo Aspergillus fumigatus é o segundo maior causador de infecções fúngicas invasivas em pacientes imunocomprometidos e a principal espécie causadora da aspergilose invasiva, doença de alta taxa de mortalidade que atinge principalmente os pulmões e que pode se disseminar pelo organismo. Durante o processo de infecção, o fungo precisa adaptar-se ao organismo do hospedeiro e um dos obstáculos encontrados é a mudança na concentração de dióxido de carbono (CO2), que, de 0,033% no ambiente, chega a até 6% no interior do hospedeiro. As anidrases carbônicas são enzimas envolvidas na hidratação reversível do CO2 e já foram apontadas como importantes na virulência de patógenos como Plasmodium falciparum, Mycobacterium tuberculosis, Helicobacter pylori, Cryptococcus neoformans e Candida albicans. Esse trabalho teve como objetivo avaliar o papel da enzima anidrase carbônica no desenvolvimento e virulência do fungo A. fumigatus, que apresenta quatro homólogos desta enzima (cafA, cafB, cafC e cafD). Para isso, foram utilizadas linhagens de A. fumigatus com os homólogos da enzima deletados (?cafA, ?cafB, ?cafC, ?cafD e ?cafA?cafB) e a linhagem selvagem (?akuBku80), da qual foram originadas as mutantes. Foram realizadas avaliações fenotípicas da estrutura dos conidióforos das diferentes linhagens, determinação da sensibilidade frente a diferentes agentes estressantes (antifúngicos, promotores de apoptose, estresse iônico, nitroativo, oxidativo, e de parede celular) e determinação da expressão gênica global em diferentes concentrações de CO2. Foi verificado que a deleção de cada um dos homólogos da anidrase carbônica de A. fumigatus não interfere na estrutura dos conidióforos deste fungo. Por outro lado, a deleção induziu alteração da sensibilidade do fungo frente a alguns compostos estressantes (ácido acético e peróxido de hidrogênio). Ainda, a análise da expressão gênica revelou um gene envolvido na adaptação do fungo ao aumento da concentração de CO2, o gene cipC, que não apresenta homólogos nas células de mamíferos. Este gene foi caracterizado neste trabalho por meio de sua deleção na linhagem selvagem (?akuBku80) de A. fumigatus e avaliação fenotípica microscópica e de sensibilidade a agentes estressantes (antifúngicos, promotores de apoptose, estresse iônico, nitroativo, oxidativo, e de parede celular). A deleção do gene não interferiu na estrutura do fungo, porém aumentou sua sensibilidade a alguns compostos (calcoflúor e menadiona). Foram realizados, ainda, testes de virulência em modelo animal utilizando-se o mutante ?cipC, os quais revelaram que a deleção deste gene atenua a virulência do fungo. Assim, foi possível concluir que as anidrases carbônicas não são relevantes para o desenvolvimento e virulência de A. fumigatus; porém, este fungo modifica a expressão de seus genes de modo a adaptar-se às variações na concentração atmosférica de CO2. O gene cipC está envolvido nesse processo de adaptação e é importante para o desenvolvimento do fungo e sua virulência, tornando-se um alvo para o estudo de novas terapias para o tratamento da aspergilose invasiva. / The fungus Aspergillus fumigatus is the second cause of fungal infections in immunocompromised patients and it is the main specie which causes invasive aspergillosis, a disease with high mortality rate that mainly affects the lungs and it can spread through the body. During the infectious process, the fungus must adapt to the host and one of the obstacles is the drastic change of the carbon dioxide (CO2) concentration, which is 0.033% in the environment and until 6% inside the host. The carbonic anhydrases are enzymes which are involved in the reversible hydration of carbon dioxide and they have been pointed as important in the virulence of pathogens such as Plasmodium falciparum, Mycobacterium tuberculosis, Helicobacter pylori, Cryptococcus neoformans and Candida albicans. This work aimed to evaluate the role of the enzyme carbonic anhydrase in the development and virulence of the fungus A. fumigatus, which has four homologues of this enzyme (cafA, cafB, cafC e cafD). Therefore, strains, which have the homologues of the enzyme deleted (?cafA, ?cafB, ?cafC, ?cafD and ?cafA?cafB) were used in parallel with the wild strain (?akuBku80), which originated the mutant ones. We did structure phenotypic evaluations of the different strains of conidiophores, sensibility determination against different stressors (antifungal agents, apoptosis, ionic, nitrosative, oxidative, and cell wall stress promoters) and global gene expression determination at different carbon dioxide concentrations. It was verified that the carbonic anhydrases homologues deletion of A. fumigatus did not interfere on the n structure (conidiophore) of this fungus, in the tested conditions. On the other hand, the deletion caused a change in sensibility of the fungus against some stressors (acetic acid and hydrogen peroxide). The gene expression experiments showed a gene involved in the adaptation to the increase of CO2 concentration, the cipC gene. This gene does not have homologues in the mammalian cells. The cipC gene was characterized in this work by its deletion in the A. fumigatus wild strain (?akuBku80) and microscopic phenotypic evaluation and sensibility tests against stressors (antifungal agents, apoptosis, ionic, nitrosative, oxidative, and cell wall stress promoters). The gene deletion did not interfere on the fungus conidiophore structure but increase its sensibility to some compounds (calcoflúor white and menadione). Virulence tests in animal model using the ?cipC mutant were done and they showed that the deletion of this gene attenuates the fungus virulence. In conclusion, the carbonic anhydrases are not relevant to development and virulence of the fungus, which modifies the gene expression to adapt to the variations of atmospheric CO2 concentration. Besides, the cipC gene seems to be involved in this adaptation process. Moreover, the cipC gene showed to be important to the development of the fungus and its virulence, which makes the gene a target for the study of new therapies for the treatment of invasive aspergillosis.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A incidência de infecções fúngicas invasivas vem aumentando nos últimos anos. Estas infecções, em geral, apresentam altas taxas de mortalidade. A profilaxia com antifúngicos ainda é a estratégia mais comum na contenção da mortalidade e prevenção contra infecções fúngicas invasivas, porém, apresenta baixa eficiência, e relatos de resistência às drogas. Além disso, a terapia antifúngica é limitada a um pequeno grupo de drogas, como os polienos, azóis e equinocandinas. Desta forma, a busca de novos alvos de drogas é fundamental para o desenvolvimento de novos antifúngicos. Estudos in silico indicaram quatro genes como potenciais alvo de drogas em fungos patogênicos. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi verificar a expressão das proteínas codificadas por dois destes possíveis genes alvo, a proteína erg6, na fração microssomal, e trr1, na fração citosólica, em hifas de A. fumigatus. Visando alcançar este objetivo, foram primeiramente padronizadas todas as etapas de fracionamento celular visando isolar estas duas subfrações celulares de A. fumigatus. Posteriormente, foi otimizado o protocolo de extração e reidratação de proteínas microssomais bem como reidratação de proteínas citosólicas. Estes extratos foram submetidos a diferentes protocolos de fracionamento proteico em um sistema de eletroforese OFFGEL (OGE). Os resultados de Western immunoblot mostraram que estas duas proteínas, erg6 e trr1, são de fato expressas na fase filamentosa de A. fumigatus. O extrato proteico da fração microssomal submetido ao OGE em doze subfrações apresentou três subunidades da proteína erg6, reconhecidas pelo anticorpo monoclonal, com massas moleculares e pI distintos: uma subunidade de aproximadamente 79 kDa com pI entre 5,91 e 6,49, e outras duas subunidades de aproximadamente 35 kDa e 32 kDa, ambas com pI entre 6,49 e 7,08. A enzima erg6 foi descrita como um homotetrâmero em outros fungos. Porém, nossos resultados sugerem que, em A. fumigatus, a erg6 possui uma estrutura heterotetramérica. Quanto à proteína trr1, tanto no extrato total quanto nas frações resultantes do fracionamento em OGE, uma banda única de aproximadamente 40 kDa, com pI na faixa de 4,79 e 5,33, foi reconhecida pelo anticorpo policlonal. Desta forma, esta proteína parece ter uma estrutura homodimérica, assim como descrito em outros micro-organismos. / The invasive fungal infections incidence has increased in recent years. These infections usually presents high mortality rates. Antifungal prophylaxis remains the most common clinical strategy to decrease mortality and prevent invasive fungal infections, however, it has low efficiency and drug resistance reports. Furthermore, antifungal therapy is limited to a small group of drugs such as polyenes, azoles, and echinocandins. Thus, the search for new drug targets is imperative for the new antifungal agents development. In silico studies have indicated four genes as potential drug target in pathogenic fungi. In this context, our aim was to investigate the expression of two proteins encoded by two putative target genes, erg6 in the microsomal fraction, and trr1 in the cytosolic fraction of A. fumigatus hyphae. To achieve this goal, we first standardized all steps of cell fractionation to isolate these two fractions of A. fumigatus hyphae. Subsequently, was optimized the protein extraction and rehidratation protocols of these two subfractions, such as cytosolic proteins rehidratation. These extracts were submitted to different protocols for protein fractionation in an OFFGEL electrophoresis system (OGE). The Western immunoblot results showed that these two proteins, erg6 and trr1, are expressed in filamentous phase of A. fumigatus. The microsomal protein extract submitted to the OGE in twelve fractions, showed three erg6 protein subunits recognized by monoclonal antibody, with distincts molecular weight and pI: a subunit with approximately 79 kDa, with pI in the range of 5,91 and 6,49, and others two subunits with 35 kDa and 32 kDa, both with pI between 6,49 and 7,08. The enzyme erg6 was described as a homotetramer in other fungi, however, our results suggest that in A. fumigatus the erg6 has a heterotetrameric structure. Regarding trr1 protein, in both, total and fractionated (OGE) extracts, a single band of approximately 40 kDa, with pI in the range of 4.79 and 5.33, was recognized by the polyclonal antibody, suggesting that this protein appears to have a homodimeric structure, as described in other microorganisms.

Aspergilose Pulmonar Invasiva é uma doença fúngica oportunista, causada principalmente por Aspergillus fumigatus, que acomete pacientes imunodeprimidos. Para melhor compreensão dessa micose inicialmente estabelecemos em camundongos C57BL/6 um modelo experimental de depleção de neutrófilos por inoculação intraperitoneal de anticorpos anti-GR-1/Ly-6G, confirmado por contagem total e diferencial de leucócitos sanguíneos. A seguir, avaliamos a evolução da infecção pulmonar experimental utilizando duas amostras de A. fumigatus, caracterizadas previamente em fraca (amostra 699) e forte (amostra 1753) produtoras de elastase. Nenhum dos animais imunocompetentes e infectados evoluiu para o óbito, no período de 7 dias de observação. Os animais neutropênicos, infectados por ambas as amostras, apresentaram 100% de mortalidade após 5 dias, com curvas de sobrevivência praticamente sobrepostas, sugerindo que a maior contribuição para a virulência foi a condição imunológica e não a atividade de elastase da amostra fúngica. Para análise do comprometimento pulmonar, os animais foram sacrificados nos tempos 24, 48 e 72 horas pós-infecção. Durante a evolução da infecção experimental foi observada uma redução da carga fúngica nos pulmões dos animais, para ambas as amostras de A. fumigatus, mas não foi observada uma redução da carga fúngica, diferenciada e estatisticamente significativa, entre os grupos de animais neutropênicos e imunocompetentes. O padrão celular do infiltrado inflamatório observado nos pulmões dos animais neutropênicos, infectados por qualquer uma das amostras de A. fumigatus, mostrou predominância de células mononucleares, em infiltrados difusos, indícios de angioinvasão e invasão brônquica com ruptura de fibras elásticas em ambas as estruturas, além de exuberância de filamentação dos conídios para ambas as amostras fúngicas, desde os tempos iniciais da infecção experimental. O processo inflamatório observado nos pulmões dos animais imunocompetentes, infectados por ambas as amostras de fungos, foi constituído nos tempos iniciais por neutrófilos e se tornou exuberante após 72 horas, com predomínio de macrófagos. Foi observada integridade de vasos sanguíneos e discreta ruptura de parede brônquica no parênquima pulmonar. Para estes animais, salienta-se a ausência de transformação dos conídios de A. fumigatus em hifas para a amostra 699, em todos os períodos de observação. A contagem total de leucócitos no lavado broncoalveolar (LBA) foi significativamente maior, 72 horas pós-infecção, para os animais neutropênicos e imunocompetentes, infectados por ambas as amostras do fungo. A contagem diferencial revelou a presença de macrófagos e neutrófilos, com a primeira célula sempre em maior quantidade no LBA dos animais neutropênicos em comparação com os animais imunocompetentes, independentemente do período da infecção e da amostra fúngica infectante. Ao contrário, o número de neutrófilos foi sempre mais relevante nos animais imunocompetentes. Por microscopia eletrônica de transmissão foi observado que a interação do fungo (conídios ou hifas) com as células de defesa do LBA envolveu íntima adesão e fusão entre os componentes de superfície de ambas as células. A presença de hemoglobina no LBA foi oriunda de lesão alvéolo-capilar causada pelo crescimento e invasão provocados pelas amostras fúngicas ou por lesão determinada pela própria reação inflamatória. Concluímos que os neutrófilos são essenciais na defesa contra A. fumigatus, pois na ausência dessa população celular os fungos rapidamente invadem e lesam o parênquima pulmonar. No entanto, deve-se considerar que a simples presença do fungo em animais imunocompetentes induz a migração de neutrófilos para o sítio da infecção, os quais também causam dano tecidual. As amostras de A. fumigatus com perfis distintos de produção de elastase não refletiram em diferenças significantes para a mortalidade ou gênese das lesões pulmonares observadas em camundongos neutropênicos, sugerindo que embora a elastase contribua para a ruptura das fibras elásticas observadas no tecido pulmonar, outros fatores de virulência, como a morfogênese, podem assumir um papel mais relevante para a patogênese da API experimental. / Invasive Pulmonary Aspergillosis (IPA) is an opportunistic fungal disease, caused mainly by Aspergillus fumigatus, that affects immunocompromised patients. To better understand this mycoses, we originally established in C57BL/6 mice an experimental model of neutrophils depletion by intraperitoneal inoculation of antibodies anti GR-1/Ly-6G, confirmed by total and differential leukocyte counts from blood. Next, we evaluated the evolution of experimental pulmonary infection using two strains of A. fumigatus, previously characterized as weak (strain 699) and strong (strain 1753) elastase producers. None of immunocompetent infected mice died with 7 days of observation, while neutropenic mice, infected with both strains, showed 100% mortality after 5 days, with survival curves nearly overlap, suggesting that the major contribution to the virulence was the immune status instead of elastase activity of each fungal strain. For analysis of lung parenchyma, mice were sacrificed 24, 48 and 72 hours post-infection. During the course of experimental infection it was observed a reduction of fungal burden in the lungs, for both strains of A. fumigatus, but this reduction was not statistically significant between the infected groups (neutropenic and immunocompetent). The cellular pattern of the inflammatory infiltrate observed in lungs from neutropenic mice, infected with both strains of A. fumigatus, revealed a predominance of mononuclear cells, a diffuse pattern and clear evidences of angioinvasion, bronchial disruption with break of elastic fibers in both structures, besides exuberance of conidia filamentation for both fungal strains, since the early period of experimental infection. The inflammatory process observed in lungs from immunocompetent mice, infected with both fungal strains, was composed on early times by neutrophils and became exuberant after 72 hours, with predominance of macrophages. It was observed integrity of blood vessels and moderate bronchial wall disruption in lung parenchyma. A relevant observation was the lack of transformation of conidia in hyphae for 699 A. fumigatus strain, in all periods of observation. Total leukocytes count in bronchoalveolar lavage (BAL) was significantly higher at 72 hours post-infection for both groups infected with both strains. The differential count revealed the presence of macrophages and neutrophils, with the former always in greater percentage in BAL from neutropenic mice and the latter always more elevated in immunocompetent group. Analysis by transmission electron microscopy demonstrated that the interaction of fungal structures (conidia or hyphae) with the defense cells (neutrophlis or macrophages) of BAL involved an intimate adhesion and fusion between the surface components from both cells. The presence of hemoglobin in BAL was a result of alveolar injury caused by the fungal development and invasion, but also by injuries determined by the inflammatory process itself. We concluded that neutrophils have a critical role against A. fumigatus since the pathogen quickly invades and damages the lung parenchyma in its absence. However, we must consider that the mere presence of A. fumigatus in immunocompetent mice induces the neutrophils migration to the infection site, which can also cause a tissue injury. Strains of A. fumigatus with distinct patterns of elastase production did not reflect in significant differences in mortality or origin of pulmonary lesions observed in neutropenic mice, suggesting that although elastase contributes to elastic disruptions observed in pulmonary tissue, another virulence factors, such as morphogenesis, can assume a more relevant role for pathogenesis of experimental IPA.

Made available in DSpace on 2017-05-12T14:47:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Luciana_ Graciano.pdf: 1359694 bytes, checksum: 9321745e3e0faea5a21d91af3579b01a (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / The optimization of xylanase production of a new Aspergillus fumigatus Fresen strain (OI-1RT) was obtained by statistical approaches. The Plackett-Burman Design evaluation showed that the following components of Czapeck medium were biologically significant: sodium nitrate, potassium phosphate, magnesium sulfate and corn straw. These factors were selected to implement the 24 Central Composite Rotational Delineation with the proposed model validation. The response surface plots have indicated a trend for increased xylanase activity with increasing concentrations of maize straw. An additional test was carried out with different concentrations of maize straw and the optimized xylanase activity was 530 U ml-1 in the presence of 6.5% (w / v) of residual biomass, which was 11 times higher than the one obtained only with the Plackett-Burman Planning (45.8 U mL-1). The thermostability of the enzyme was kept at 90% at 50 °C for 6 hours. Enzyma tic hydrolyses tests were performed to obtain reducing sugars from maize straw, hydrolyzed maize straw and beechwood xylan. This procedure has been performed for 96 hours with 2 U ml-1 for xylanase (crude extract) and resulted in net production of 3.89, 20.96 and 21.64 μmol mL-1 for reducing sugars, respectively. This indicated possible biotechnological applications to the crude extract with xylan-degrading enzymes (xylanase). / As xilanases são glicosídeo hidrolases (GHs) com diferentes propriedades físico-químicas e várias aplicações biotecnológicas, como na indústria têxtil, alimentícia e de papel e celulose. Xilanases podem ser utilizadas para a degradação de fontes de carbono renováveis, tais como os resíduos agroindustriais. Desta forma, é possível aproveitar a capacidade energética de compostos disponíveis em abundância e que poderiam ser descartados levando à poluição de solos e corpos hídricos. Atualmente, existe uma busca por estratégias que permitam a otimização de processos biotecnológicos para utilizar a capacidade energética presentes na biomassa para geração de produtos de valor agregado, como a produção de xilitol e do etanol celulósico. Ferramentas bioquímico-moleculares e planejamentos estatísticos de otimização de processos são exemplos de estratégias que visam melhorar o desempenho catalítico de enzimas. Neste contexto, este trabalho objetivou aproveitar resíduos agroindustriais para a indução de xilanases usando duas abordagens. Na primeira, foi realizada a clonagem e expressão do gene xynA1 (CCNA_02894) de Caulobacter crescentus em Escherichia coli com a obtenção de uma proteína recombinante fusionada a uma cauda de histidina carboxi-terminal (XynA1), que foi posteriormente purificada e caracterizada quanto a suas propriedades bioquímicas e cinéticas. Nesta análise, verificou-se que dentre as várias fontes de carbono testadas para indução da XynA1 em C. crescentus, os substratos palha de milho, palha de milho hidrolisada e o sabugo de milho foram os mais eficientes para induzir a atividade xilanásica. Além disso, a caracterização da XynA pura, obtida por cromatografia de afinidade em colunas préempacotadas de níquel-sepharose de elevado desempenho, mostrou que a XynA1 possui atividade enzimática e atividade específica de 18,26 U mL-1 e 2,22 e U mg-1usando xilano de beechwood como substrato na reação. A atividade de XynA1 foi inibida por EDTA e íons metálicos tais como Cu 2+ e Mg 2+. Em contraste, ß-mercaptoetanol, ditiotreitol (DTT), e Ca2+ induziram a atividade da enzima recombinante. Os dados cinéticos para XynA1 revelaram valores de KM e Vmáx de 3,77 mg mL-1 e 10,2 μM min-1, respectivamente. Finalmente, a enzima apresentou um pH ótimo igual a 6 e temperatura ótima de 50 °C. Além disso, 80% da atividade de XynA1 foi mantida a 50 °C por 4 hor as de incubação. Isso sugere estabilidade térmica para aplicação em processos biotecnológicos. Na segunda etapa do trabalho, foi realizada a otimização da produção xilanásica por um novo isolado vii termotolerante de Aspergillus fumigatus Fresen. (OI-1R-T), obtido de bioma de Mata Atlântica, usando metodologias estatísticas de delineamento experimental como Planejamento Plackett-Burman (Plackett-Burman Design-PBD) e Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR). Verificou-se, nesses ensaios, uma atividade xilanásica de 530 U mL-1 na presença de 6,5% de palha de milho no meio de cultivo otimizado. Ensaios de hidrólises enzimáticas da palha de milho, palha de milho hidrolisada e do xilano de beechwood foram realizados durante 96 horas com 2 U mL-1 de atividade xilanásica do extrato bruto otimizado no mesmo resíduo, resultando em uma produção líquida de 3,89, 20,96 e 21,64 μmol mL-1 de açúcares redutores, respectivamente. Assim, sugere-se que a enzima fúngica, mesmo em extrato bruto, também poderia ser aplicada em processos biotecnológicos diversos.

Aspergilose Pulmonar Invasiva é uma doença fúngica oportunista, causada principalmente por Aspergillus fumigatus, que acomete pacientes imunodeprimidos. Para melhor compreensão dessa micose inicialmente estabelecemos em camundongos C57BL/6 um modelo experimental de depleção de neutrófilos por inoculação intraperitoneal de anticorpos anti-GR-1/Ly-6G, confirmado por contagem total e diferencial de leucócitos sanguíneos. A seguir, avaliamos a evolução da infecção pulmonar experimental utilizando duas amostras de A. fumigatus, caracterizadas previamente em fraca (amostra 699) e forte (amostra 1753) produtoras de elastase. Nenhum dos animais imunocompetentes e infectados evoluiu para o óbito, no período de 7 dias de observação. Os animais neutropênicos, infectados por ambas as amostras, apresentaram 100% de mortalidade após 5 dias, com curvas de sobrevivência praticamente sobrepostas, sugerindo que a maior contribuição para a virulência foi a condição imunológica e não a atividade de elastase da amostra fúngica. Para análise do comprometimento pulmonar, os animais foram sacrificados nos tempos 24, 48 e 72 horas pós-infecção. Durante a evolução da infecção experimental foi observada uma redução da carga fúngica nos pulmões dos animais, para ambas as amostras de A. fumigatus, mas não foi observada uma redução da carga fúngica, diferenciada e estatisticamente significativa, entre os grupos de animais neutropênicos e imunocompetentes. O padrão celular do infiltrado inflamatório observado nos pulmões dos animais neutropênicos, infectados por qualquer uma das amostras de A. fumigatus, mostrou predominância de células mononucleares, em infiltrados difusos, indícios de angioinvasão e invasão brônquica com ruptura de fibras elásticas em ambas as estruturas, além de exuberância de filamentação dos conídios para ambas as amostras fúngicas, desde os tempos iniciais da infecção experimental. O processo inflamatório observado nos pulmões dos animais imunocompetentes, infectados por ambas as amostras de fungos, foi constituído nos tempos iniciais por neutrófilos e se tornou exuberante após 72 horas, com predomínio de macrófagos. Foi observada integridade de vasos sanguíneos e discreta ruptura de parede brônquica no parênquima pulmonar. Para estes animais, salienta-se a ausência de transformação dos conídios de A. fumigatus em hifas para a amostra 699, em todos os períodos de observação. A contagem total de leucócitos no lavado broncoalveolar (LBA) foi significativamente maior, 72 horas pós-infecção, para os animais neutropênicos e imunocompetentes, infectados por ambas as amostras do fungo. A contagem diferencial revelou a presença de macrófagos e neutrófilos, com a primeira célula sempre em maior quantidade no LBA dos animais neutropênicos em comparação com os animais imunocompetentes, independentemente do período da infecção e da amostra fúngica infectante. Ao contrário, o número de neutrófilos foi sempre mais relevante nos animais imunocompetentes. Por microscopia eletrônica de transmissão foi observado que a interação do fungo (conídios ou hifas) com as células de defesa do LBA envolveu íntima adesão e fusão entre os componentes de superfície de ambas as células. A presença de hemoglobina no LBA foi oriunda de lesão alvéolo-capilar causada pelo crescimento e invasão provocados pelas amostras fúngicas ou por lesão determinada pela própria reação inflamatória. Concluímos que os neutrófilos são essenciais na defesa contra A. fumigatus, pois na ausência dessa população celular os fungos rapidamente invadem e lesam o parênquima pulmonar. No entanto, deve-se considerar que a simples presença do fungo em animais imunocompetentes induz a migração de neutrófilos para o sítio da infecção, os quais também causam dano tecidual. As amostras de A. fumigatus com perfis distintos de produção de elastase não refletiram em diferenças significantes para a mortalidade ou gênese das lesões pulmonares observadas em camundongos neutropênicos, sugerindo que embora a elastase contribua para a ruptura das fibras elásticas observadas no tecido pulmonar, outros fatores de virulência, como a morfogênese, podem assumir um papel mais relevante para a patogênese da API experimental. / Invasive Pulmonary Aspergillosis (IPA) is an opportunistic fungal disease, caused mainly by Aspergillus fumigatus, that affects immunocompromised patients. To better understand this mycoses, we originally established in C57BL/6 mice an experimental model of neutrophils depletion by intraperitoneal inoculation of antibodies anti GR-1/Ly-6G, confirmed by total and differential leukocyte counts from blood. Next, we evaluated the evolution of experimental pulmonary infection using two strains of A. fumigatus, previously characterized as weak (strain 699) and strong (strain 1753) elastase producers. None of immunocompetent infected mice died with 7 days of observation, while neutropenic mice, infected with both strains, showed 100% mortality after 5 days, with survival curves nearly overlap, suggesting that the major contribution to the virulence was the immune status instead of elastase activity of each fungal strain. For analysis of lung parenchyma, mice were sacrificed 24, 48 and 72 hours post-infection. During the course of experimental infection it was observed a reduction of fungal burden in the lungs, for both strains of A. fumigatus, but this reduction was not statistically significant between the infected groups (neutropenic and immunocompetent). The cellular pattern of the inflammatory infiltrate observed in lungs from neutropenic mice, infected with both strains of A. fumigatus, revealed a predominance of mononuclear cells, a diffuse pattern and clear evidences of angioinvasion, bronchial disruption with break of elastic fibers in both structures, besides exuberance of conidia filamentation for both fungal strains, since the early period of experimental infection. The inflammatory process observed in lungs from immunocompetent mice, infected with both fungal strains, was composed on early times by neutrophils and became exuberant after 72 hours, with predominance of macrophages. It was observed integrity of blood vessels and moderate bronchial wall disruption in lung parenchyma. A relevant observation was the lack of transformation of conidia in hyphae for 699 A. fumigatus strain, in all periods of observation. Total leukocytes count in bronchoalveolar lavage (BAL) was significantly higher at 72 hours post-infection for both groups infected with both strains. The differential count revealed the presence of macrophages and neutrophils, with the former always in greater percentage in BAL from neutropenic mice and the latter always more elevated in immunocompetent group. Analysis by transmission electron microscopy demonstrated that the interaction of fungal structures (conidia or hyphae) with the defense cells (neutrophlis or macrophages) of BAL involved an intimate adhesion and fusion between the surface components from both cells. The presence of hemoglobin in BAL was a result of alveolar injury caused by the fungal development and invasion, but also by injuries determined by the inflammatory process itself. We concluded that neutrophils have a critical role against A. fumigatus since the pathogen quickly invades and damages the lung parenchyma in its absence. However, we must consider that the mere presence of A. fumigatus in immunocompetent mice induces the neutrophils migration to the infection site, which can also cause a tissue injury. Strains of A. fumigatus with distinct patterns of elastase production did not reflect in significant differences in mortality or origin of pulmonary lesions observed in neutropenic mice, suggesting that although elastase contributes to elastic disruptions observed in pulmonary tissue, another virulence factors, such as morphogenesis, can assume a more relevant role for pathogenesis of experimental IPA.

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Made available in DSpace on 2015-05-14T12:59:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 819195 bytes, checksum: 00bb6e156c9bc61f631332e47253375e (MD5) Previous issue date: 2011-06-22 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Due increase of incidence of fungal infections for Candida albicans and Aspergillus spp. in immunocompromised patients, and emerging resistant strains to conventional antifungals, it is accentuated the need for new antifungal. Essential oils have been tested for antimycotic activity and possess potential as antifungal agents. This work investigated the activity of essential oil of Cymbopogon winterianus against Candida albicans, Aspergillus flavus and A. fumigatus, by MIC and MFC; time-kill methods and morphological changes in the C. albicans, inhibition of the fungal mycelial growth and analysis of conidia germination of Aspergillus flavus and A. fumigatus when exposed to several concentrations of oil and by cellular leakage and assessed the bind of essential oil with ergosterol. The results shown that essential oil had concentrationdependent antifungal activity, alters the morphology in C. albicans, inhibits conidia germination and the radial mycelia growth of Aspergillus flavus and Aspergillus fumigatus, causes cellular leakage of all strains of fungal species tested and binds to ergosterol. These results make essential oil of Cymbopogon winterianus a potential agent in controlling fungi growth that cause infections, like hospital-acquired infections. / Devido ao aumento na incidência de infecções fúngicas por Candida albicans e Aspergillus spp. em pacientes imunocomprometidos, e ao surgimento de cepas resistentes aos antifúngicos convencionais, é crescente a necessidade de novos antifúngicos. Óleos essenciais têm sido testados contra fungos, e possuem potencial como agentes antifúngicos. Este trabalho investigou a atividade do óleo essencial de Cymbopogon winterianus contra Candida albicans, Aspergillus flavus e A. fumigatus, através da Concentração Inibitória Mímima (CIM), da Concentração Fungicida Mínima (CFM), do tempo de morte e de mudanças morfológicas em C. albicans; da inibição do crescimento radial fúngico e da análise da germinação dos conídios de Aspergillus flavus e A. fumigatus quando expostos a várias concentrações do óleo e através da lise celular e da ligação do óleo essencial com o ergosterol. Os resultados mostraram que o óleo essencial tem atividade antifúngica dependente da concentração, altera a morfologia de C. albicans, inibe a germinação de conídios e o crescimento micelial radial de Aspergillus flavus e Aspergillus fumigatus, causa lise celular de todas as cepas dos fungos testados e se liga ao ergosterol. Estes resultados fazem do óleo essencial de Cymbopogon winterianus um potencial agente no controle do crescimento de fungos que podem causar infecções, como aquelas que acontecem no ambiente hospitalar.

Submitted by Maike Costa (maiksebas@gmail.com) on 2017-09-13T12:15:49Z No. of bitstreams: 1 arquuivototal.pdf: 3577415 bytes, checksum: 0e9d2a60e77718e50720d15b7cad6fb1 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-13T12:15:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquuivototal.pdf: 3577415 bytes, checksum: 0e9d2a60e77718e50720d15b7cad6fb1 (MD5) Previous issue date: 2016-02-18 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / In recent decades fungal infections have increased, and their high rates of morbidity and mortality have brought them much attention. Immunocompromised patients are more susceptible to microorganism infections; in particular, fungal species of the genus Aspergillus spp. Among the current infectious filamentous fungi they have a rather high incidence. Antifungal treatments have been subjected to numerous studies, and the increasing number of resistant fungal species has been highlighted. Thus, we see the importance of seeking new, more effective, and less toxic therapeutic sources. The aim of this study was to evaluate the in vitro antifungal activity and structure activity relationships of coumarin compounds against Aspergillus species. For this the MIC of 24 coumarin compounds was determined and subsequent SAR studies were performed with computer software. 12 of the 24 tested coumarin derivatives have antifungal activity, with 5 has shown excelent activity. Thus two derivatives, 7-hydroxy-6-nitrocoumarin (Cou-UNO2), and 4-acetoxycoumarin (Cou-UMB16), with better MIC values were evaluated via inhibition of mycelial growth and conidial germination, and by mechanism of action testing. The products were evaluated in combination with antifungals standards. The results showed that 12 of the 24 tested coumarin derivatives have antifungal activity, with MIC values ranging from 1024-16μg/ml. SAR studies have showed that the presence of a short aliphatic chain, and/or electronegative groups like ring substituents are favorable for antifungal activity. The coumarin derivatives with better MIC values (16μg/ml); Cou-UNO2 and Cou-UMB16 were capable of inhibiting both the mycelial growth and conidial germination of Aspergillus spp. Their activity is on the structure of the fungal cell wall. Cou-NO2, in a sub-inhibitory concentration, enhanced the in vitro effects of azoles, and in combination with azoles (voriconazole and itraconazole) there was an additive effect. Cou-UMB16 in combination with azoles (voriconazole and itraconazole) had synergistic or additive effects depending on the strain used. Thus this study concludes that coumarin derivatives have antifungal activity against the species A. flavus and A. fumigatus. The coumarin Cou-UMB16 and Cou-UNO2 have able to inhibit the mycelial growth and conidio germination and that this activity is due to its action on the fungal cell wall and the presence of electronegative groups as substituents of the benzopyrone ring favors this activity. / As infecções fúngicas, nas últimas décadas, têm se destacado devido ao seu crescente aumento e suas elevadas taxas de morbidade e mortalidade. Pacientes imunocomprometidos são os que possuem maior susceptibilidade a estes micro-organismos. Dentre estas infecções fúngicas, as espécies pertencentes ao gênero Aspergillus spp. possuem alta incidência entre os fungos filamentosos. A terapêutica antifúngica tem sido alvo de numerosos estudos e nestes tem sido destacado o crescente aumento de espécies fúngicas resistentes. Dessa forma, destaca-se a importância da busca de novas fontes terapêuticas que se apresentem mais eficazes e com menos tóxicas ao hospedeiro. Assim o objetivo deste estudo foi avaliar a atividade antifúngica in vitro e relação estrutura atividade (SAR) dos compostos cumarínicos frente às espécies do gênero Aspergillus. Para tal foi determinada a CIM de 24 compostos cumarínicos e posteriormente realizado estudos SAR com softwares computacionais. Dos 24 compostos ensaiados, 12 demonstraram possuir atividade antifúngica e 5 obtiveram forte atividade antifúngica. Destes derivados cumarínicos com forte atividade antifúngica, dois merecem destaque, 7-hidroxi-6-nitrocumarina (Cou-UNO2) e 4-acetóxicumarina (Cou-UMB16), com melhores valores de CIM, foram avaliados via testes de inibição do crescimento micelial, germinação dos conídios e testes de determinação do mecanismo de ação. Por fim os produtos foram avaliados em combinação com antifúngicos padrões. Os resultados demonstraram que 12 derivados cumarínicos dos 24 ensaiados possuem atividade antifúngica, com valores de CIMs variando entre 1024-16μg/mL. A SAR demonstra que a adição de grupos eletronegativos, como substituintes do anel benzopirona, favorece a atividade antifúngica destes compostos. Os derivados cumarínicos com melhores CIM (16μg/mL), 7-hidroxi-6-nitrocumarina (Cou-UNO2) e 4-acetóxicumarina (Cou-UMB16) foram capazes de inibir o crescimento micelial e a germinação dos conídios de Aspergillus spp. E estes possuem ação sobre a estrutura da parede celular fúngica. Em uma concentração subinibitória, Cou-UNO2 potencializou a ação in vitro dos derivados azólicos e em combinação com os derivados azólicos (voriconazol e itraconazol) observou-se um efeito aditivo. Já Cou-UMB16 em combinação com os derivados azólicos (voriconazol e itraconazol) obteve um efeito sinérgico a aditivo, dependendo da linhagem utilizada. Logo este estudo conclui que os derivados cumarínicos possuem atividade antifúngica contra as espécies de A. flavus e A. fumigatus. As cumarinas Cou-UNO2 e Cou-UMB16 foram capazes de inibir o crescimento micelial e a germinação dos conídios e que esta atividade seja devido a sua ação sobre a parede celular fúngica. E que esta atividade é favorecida pela presença de moléculas eletronegativas no anel básico da cumarina (1,2-benzopirona).

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A incidência de infecções fúngicas invasivas vem aumentando nos últimos anos. Estas infecções, em geral, apresentam altas taxas de mortalidade. A profilaxia com antifúngicos ainda é a estratégia mais comum na contenção da mortalidade e prevenção contra infecções fúngicas invasivas, porém, apresenta baixa eficiência, e relatos de resistência às drogas. Além disso, a terapia antifúngica é limitada a um pequeno grupo de drogas, como os polienos, azóis e equinocandinas. Desta forma, a busca de novos alvos de drogas é fundamental para o desenvolvimento de novos antifúngicos. Estudos in silico indicaram quatro genes como potenciais alvo de drogas em fungos patogênicos. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi verificar a expressão das proteínas codificadas por dois destes possíveis genes alvo, a proteína erg6, na fração microssomal, e trr1, na fração citosólica, em hifas de A. fumigatus. Visando alcançar este objetivo, foram primeiramente padronizadas todas as etapas de fracionamento celular visando isolar estas duas subfrações celulares de A. fumigatus. Posteriormente, foi otimizado o protocolo de extração e reidratação de proteínas microssomais bem como reidratação de proteínas citosólicas. Estes extratos foram submetidos a diferentes protocolos de fracionamento proteico em um sistema de eletroforese OFFGEL (OGE). Os resultados de Western immunoblot mostraram que estas duas proteínas, erg6 e trr1, são de fato expressas na fase filamentosa de A. fumigatus. O extrato proteico da fração microssomal submetido ao OGE em doze subfrações apresentou três subunidades da proteína erg6, reconhecidas pelo anticorpo monoclonal, com massas moleculares e pI distintos: uma subunidade de aproximadamente 79 kDa com pI entre 5,91 e 6,49, e outras duas subunidades de aproximadamente 35 kDa e 32 kDa, ambas com pI entre 6,49 e 7,08. A enzima erg6 foi descrita como um homotetrâmero em outros fungos. Porém, nossos resultados sugerem que, em A. fumigatus, a erg6 possui uma estrutura heterotetramérica. Quanto à proteína trr1, tanto no extrato total quanto nas frações resultantes do fracionamento em OGE, uma banda única de aproximadamente 40 kDa, com pI na faixa de 4,79 e 5,33, foi reconhecida pelo anticorpo policlonal. Desta forma, esta proteína parece ter uma estrutura homodimérica, assim como descrito em outros micro-organismos. / The invasive fungal infections incidence has increased in recent years. These infections usually presents high mortality rates. Antifungal prophylaxis remains the most common clinical strategy to decrease mortality and prevent invasive fungal infections, however, it has low efficiency and drug resistance reports. Furthermore, antifungal therapy is limited to a small group of drugs such as polyenes, azoles, and echinocandins. Thus, the search for new drug targets is imperative for the new antifungal agents development. In silico studies have indicated four genes as potential drug target in pathogenic fungi. In this context, our aim was to investigate the expression of two proteins encoded by two putative target genes, erg6 in the microsomal fraction, and trr1 in the cytosolic fraction of A. fumigatus hyphae. To achieve this goal, we first standardized all steps of cell fractionation to isolate these two fractions of A. fumigatus hyphae. Subsequently, was optimized the protein extraction and rehidratation protocols of these two subfractions, such as cytosolic proteins rehidratation. These extracts were submitted to different protocols for protein fractionation in an OFFGEL electrophoresis system (OGE). The Western immunoblot results showed that these two proteins, erg6 and trr1, are expressed in filamentous phase of A. fumigatus. The microsomal protein extract submitted to the OGE in twelve fractions, showed three erg6 protein subunits recognized by monoclonal antibody, with distincts molecular weight and pI: a subunit with approximately 79 kDa, with pI in the range of 5,91 and 6,49, and others two subunits with 35 kDa and 32 kDa, both with pI between 6,49 and 7,08. The enzyme erg6 was described as a homotetramer in other fungi, however, our results suggest that in A. fumigatus the erg6 has a heterotetrameric structure. Regarding trr1 protein, in both, total and fractionated (OGE) extracts, a single band of approximately 40 kDa, with pI in the range of 4.79 and 5.33, was recognized by the polyclonal antibody, suggesting that this protein appears to have a homodimeric structure, as described in other microorganisms.