La digestion anaérobie est un processus naturel de dégradation de la matière organique réalisé par l’action concertée de plusieurs populations microbiennes. Grâce au développement des techniques moléculaires et des projets de métagnéomique, notre connaissance de la diversité de ce monde microbien a été approfondie. Ainsi, de nombreuses nouvelles lignées bactériennes et archées ont été découvertes. L’association de ces techniques moléculaires nous a permis d’explorer et comparer la diversité des micro-organismes présents dans 3 digesteurs anaérobies des STEP Corbeil, Creil et Evry. Les analyses montrent des profils comparables pour Corbeil et Evry mais différents de ceux de Creil. Au sein du domaine Bacteria, les populations dominantes appartiendraient aux divisions des Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria, et Chloroflexi. Certaines populations minoritaires dans un digesteur deviennent dominantes dans l’autre (exemple des Spirochaetes à Corbeil). Concernant le domaine Archaea, la nouvelle lignée Arc I (ou WSA2) domine à Corbeil et à Evry. Celle ci n’a pas été détectée à Creil où les Methanosarcinales sont dominants. La découverte d’une nouvelle division candidate WWE3 par une approche metagénomique montre que les méthodes PCR-dépendantes reflètent une image infidèle de la diversité des écosystèmes. / Anaerobic digestion is a natural process, where, under anaerobic conditions, a consortium of microorganisms converts organic material into methane. The development of PCR-dependant techniques and also metagenomic approaches extended our view of population diversity of this consortium and permitted the discovery of novel bacterial and archaeal lineages. In this study, we analyse and compare the prokaryotic diversity of 3 anaerobic municipal sludge digesters: Corbeil, Creil and Evry. Phylogenetic analysis of 16S rDNA sequences shows similar profiles for Evry and Corbeil, while Creil is different. Within the bacterial domain, four predominant phylogenetic groups are detected: Bacteroidetes, Proteobacteria, Firmicutes and Chloroflexi. However, bacterial divisions which are minorities in some digesters, may dominate in others , such as Spirochaetales in Corbeil. Within the archaeal domain, the Arc I lineage (WSA2) is predominant in Evry and Corbeil digesters while it is absent in Creil, where Methanosarcinales is the dominant group. The discovery of the novel bacterial candidate division WWE3 by a metagenomic approach confirms that our view of the microbial diversity within these complex ecosystem remains incomplete.

L'étude des bactéries pathogènes opportunistes d'origine environnementale ayant des modes de vie variés, libre et autonome ou contraint à une niche spécifique représentée par l'hôte, présente un intérêt dans la compréhension de l'adaptation des bactéries à leurs hôtes et de l'apparition de nouveaux pathogènes. Le genre Aeromonas regroupe des bactéries communes des milieux aquatiques, principalement des eaux douces. Elles sont capables d'entretenir différents types de relations avec leurs hôtes (parasitisme/symbiose) et peuvent être hébergées par un large spectre d'organismes. Chez l'homme, elles sont la cause d'une large variété d'infections (gastroentérite, bactériémie, infection de la peau et des tissus mous, etc.) mais les difficultés d'identification des souches et une taxonomie confuse engendrent une méconnaissance de la pathogénicité réelle des différentes espèces décrites.Le but de ce travail était d'étudier les mécanismes d'évolution génomique et génétique à l'origine de la remarquable capacité d'adaptation des Aeromonas à leurs hôtes, notamment à l'homme. Une analyse comparative de la diversité génétique et génomique d'une large collection de 195 souches représentative des différentes espèces du genre et d'origines variées (humaine, animale et environnementale) a été menée. La diversité génétique a été appréhendée au moyen d'une approche multilocus incluant l'étude des séquences de 7 gènes de ménage (dnaK, gltA, gyrB, radA, rpoB, tsf, zipA). En parallèle, nous avons étudié la variabilité des copies multiples du gène rrs en explorant leur diversité génétique par une méthode d'électrophorèse en condition dénaturante (PCR-TTGE) et la variabilité du nombre et de la répartition des opérons rrn dans le chromosome de ces bactéries par électrophorèse en champ pulsé.Ces différentes approches nous ont permis de mettre en évidence : i) une diversité très élevée des 7 gènes de ménage analysés ainsi que l'existence de transferts latéraux, ii) l'existence de sous-groupes de souches adaptées à un hôte ou à une localisation anatomique particulière, iii) un nombre important d'opérons rrn (8 à 11), iv) l'existence de profils de distribution chromosomique des opérons rrn spécifique d'espèce ou de groupes d'espèces proches, v) une forte proportion (41,5%) des souches présentant une hétérogénéité de séquences des différentes copies du gène rrs. Nos résultats montrent également la valeur taxonomique de l'étude de la diversité génétique et génomique à l'aide des approches proposées au sein du genre Aeromonas.Nous montrons que : i) l'ARN ribosomique 16S est un marqueur informatif pour étudier les modes d'évolution et conduire des études de taxonomie mixte et consensuelle dans le genre Aeromonas à condition d'étudier la diversité de ses multiples copies, ii) A. caviae présente des caractéristiques génétiques particulières témoignant d'un processus d'adaptation en cours à une niche écologique que nous supposons être l'intestin humain. Nos résultats supportent également un mode d'évolution des bactéries du genre Aeromonas dit en complexes d'espèces accompagné de phénomènes de spéciation pouvant en partie expliquer les difficultés rencontrées pour établir une taxonomie claire du genre Aeromonas. / Abstract :Studying opportunistic pathogenic bacteria with an environmental origin and a wide variety of lifestyles, either free-living or host-adapted, is useful to improve the understanding of bacterial adaptation to hosts and the emergence of novel pathogens. The genus Aeromonas groups water-living bacteria, mainly in freshwater. They are able to support several types of relations with their hosts (parasitism/ symbiosis) and are harbored by a large spectrum of hosts. In human, they are involved in a wide range of infections (gastroenteritis, bacteraemia, wound and soft tissue infection, etc.) but difficulties in identifying strains and a confused taxonomy results in incomplete knowledge of the real strain pathogenicity of each described species.The aim of this work was to study the mechanisms of genomic and genetic evolution related to the outstanding ability of Aeromonas adaptation to host, including human. We led a comparative analysis of the genetic and genomic diversity on a large strain collection (195 strains) representative of the species of the genus and from various sources (human, animal, environmental). We studied the genetic diversity using a 7 housekeeping gene multilocus strain analysis (dnaK, gltA, gyrB, radA, rpoB, tsf, zipA). We also described the variability in the i) rrs multiple gene copies using a PRC-TTGE method and ii) the number and distribution of the rrn operons within the chromosome using a pulse field gel electrophoresis. Our results also showed the taxonomic value of the study of genetic and genomic diversity using the approaches proposed in the genus Aeromonas.These various approaches enabled us to highlight: i) a high genetic diversity in the housekeeping genes together with horizontal gene transfers events, ii) some clusters that were either host-adapted or adapted to particular anatomical locations, iii) a high number of rrn operons (from 8 to 11), iv) the presence of patterns of rrn operon that were either species-specific or specific to groups of closely related species, v) a high frequency (41,5%) of strains harboring sequence heterogeneities between rrs copies. We showed that: i) 16 rRNA is a valuable marker for studying the modes of evolution of aeromonads and the taxonomy within the genus Aeromonas provided that multiple copy diversity is taken into account, ii) A. caviae displays particular genetic characteristic that suggested an ongoing process of adaptation to a niche that we supposed to be human digestive tract. Our results also support an evolution mode in complex of species with some speciation process that could at least in part explain difficulties for determining a clarified taxonomy within the genus Aeromonas.

Cette dernière décennie a connu un engouement fort pour les microflores complexes particulièrement pour les flores associées symbiotiquement à leur hôte comme les flores du tractus digestif. Les flores digestives ouvrent en effet de nombreuses opportunités tant sur le plan médical que sur les plans industriel et biotechnologique. Dans ce manuscrit, sont présentés divers travaux sur les flores digestives de Galliformes : étude du mode d'action des antibiotiques en tant que facteurs de croissance chez le poulet, recherche de substitutifs aux antibiotiques chez le poulet et recherche d'un putatif pathogène des entérites non spécifiques chez la dinde. Ont également été développés dans cet écrit de nouveaux outils utiles à l'identification bactérienne. Une nouvelle technique de criblage de clones, nommée CSbyDG, basée sur une discrimination de profiles DGGE à trois bandes, a prouvée son efficacité à cribler des banques de clones d'ADNr 16S. Pour permettre le regroupement des profiles obtenus en CSbyDG, un programme informatique codé en Visual Basic Application pour Excel a été développé. Ce programme, nommé ProReg XL Tool, est à même de regrouper des profiles électrophorétiques identiques. Ses domaines d'applications sont donc beaucoup plus larges que le seul regroupement de profiles de CSbyDG. A terme, la CSbyDG devrait permettre, par différents portages, d'identifier une bactérie en quelques heures.

Exploité depuis toujours, le sel a connu, au temps de la Gabelle notamment, des heures de gloire certaines, faisant de lui un métal blanc précieux, recherché et coûteux. Cependant, de nos jours, il est considéré comme un minéral essentiel, certes, mais aussi dangereux pour la santé si surconsommé. Ainsi, les paludiers d'aujourd’hui doivent mettre en avant le caractère authentique de leur produit et leur savoir-faire ancestral, symboles de qualité dans l'esprit des contemporains, pour réussir à maintenir leur activité et leur part de marché. L'objectif de cette étude était ainsi de définir des pistes qui garantiraient aux paludiers la protection de leur travail, par exemple dans le cadre d'une démarche d'appellation d'origine contrôlée ou protégée. Pour ce faire, un partenariat avec des sauniers de la Côte Atlantique Française (Ile de Ré, Ile de Noirmoutier, presqu'Ile de Guérande, salines de Saint-Armel) a permis de collecter divers échantillons (eaux des marais, sels). Dans un premier temps, une recherche de microorganismes et une étude sur les traces d'ADNr-16S présent sur les cristaux de sel, ont permis de caractériser une partie du microbiote halophile se développent au niveau des bassins de production du sel de mer, alors que leur teneur en sel peut aller jusqu'à 25 %. Dans un second temps, une recherche de composés volatils a été conduite afin de déterminer si l'environnement pouvait influencer l'empreinte olfactive des eaux des marais et du sel lors de sa formation et / ou de sa récolte. Un protocole d'extraction et d'analyses a été développé et a permis la mise en évidence d'un profil en composés volatils propre à chaque bassin. Parmi les composés volatils détectés, de nombreux norisoprénoïdes, provenant probablement de la dégradation de caroténoïdes produits par les microorganismes halophiles, ont ainsi été identifiés : pour le « bassin » Ile de Ré, 21 composés volatils ont été identifiés dont 8 composés dérivés des caroténoïdes (CDC) ; pour le « bassin » de Noirmoutier, 13 composés dont 7 CDC ; pour le « bassin » de Saint-Armel, 54 composés dont 25 CDC ; pour le « bassin » Guérandais, 19 composés dont 10 CDC.D'une façon générale, les résultats obtenus aussi bien d'un point de vue microbiologique que chimique, ont révélé une forte corrélation entre les marais salants et le sel qu'ils produisent : les microorganismes spécifiques d'un environnement laissent des empreintes sur les eaux et le sel, ce qui permettrait notamment aux paludiers de caractériser leur produit en vue d'une protection basée sur de véritables marqueurs propres à chaque marais (pour des origines distantes de quelques kilomètres, des différences sont déjà notables entre salines tant au niveau « odeur » qu'au niveau microbiote). / Salt has always been exploited in living memory. It has known its heyday at several occasions throughout history, particularly during the period of the French Gabelle, and therefore came to be seen as a precious white metal both sought after and expensive. Yet, nowadays, although it has been considered as an essential mineral, it has also turned up to be unhealthy when taken in excessive amounts. Consequently, salt workers of our day and age have to highlight the genuine nature of their product as well as their ancestral skills, for they both stand out as tokens of quality for our contemporaries. Meeting the expectations of the consumer is the only way for them to keep up with their work and maintain their share on the market. Thus, this study aimed to define ways for salt workers to have their work preserved, for instance throughout a Protected Designation of Origin. Therefore, a partnership with Atlantic French salt workers (from Ré Island, Noirmoutier, Guérande and Saint-Armel) has been established, allowing us to collect samples of salt marsh water and salts.First, an overview of microorganism population and 16S-rDNA in each water or salt sample permitted to define what kinds of microorganism populations were to be found in salt marshes. Secondly, a search for volatile components was led so as to determine whether the environment might affect the olfactory footprint of salt marshes and of salt itself during its formation and its harvest. A process of extraction and analysis has been developed, shedding light on a link between the origin and the olfactory footprint of salt. As an example, the halophilous microorganisms which are extremely rich in carotenoid (hence the red-orange colour of some marshes) are partly responsible for the presence of norisoprenoids in the volatile components which have been identified: 21 compounds were identified in Ré Island (including 8 norisoprenoids), 13 in Noirmoutier (including 7 norisoprenoids), 54 in Saint-Armel (including 25 norisoprenoids),19 in Guérande (including 10 norisoprenoids).For each area, DNA traces and volatile profiles were identified. Therefore, a strong link can be established between salt marshes and the salt they produce. It appears that the differences between salt flats regarding either their smell or their microbiota is always noteworthy, even when marshes are only a few miles apart. Thus, the specific pool of the identified microorganisms which leave prints on the salt would allow saltworkers to define their product so as to ensure a form of protection based on specific markers which are proper to each marsh.

Dans le cadre des législations européennes relatives au traitement des déchets et aux énergies renouvelables, la méthanisation apparaît comme une alternative prometteuse pour la stabilisation et la valorisation des Ordures Ménagères Résiduelles (OMR). D'un point de vue opérationnel l'hétérogénéité et les difficultés de mise en mouvement d'une matrice aussi complexe que les OMR sont à l'origine de pertes de rendement voire de l'arrêt d'installations de méthanisation. Les performances de méthanisation sont en particulier limitées par l'étape d'hydrolyse des fractions lignocellulosiques qui représentent la majorité du potentiel méthanogène des OMR. Dans ce contexte, l'objectif principal du travail de thèse, était l'étude d'un procédé de percolation dans lequel le déchet n'est pas mis en mouvement. Au travers de ce travail nous avions également pour ambition de produire des connaissances à caractère plus générique sur l'hydrolyse afin d'en améliorer les performances. Des expériences préliminaires ont d'abord permis la définition d'un système expérimental adéquat pour l'étude à l'échelle laboratoire de l'hydrolyse des OMR. La représentativité d'un déchet reconstitué, reproductible et d'utilisation aisée, a notamment été vérifiée en termes de potentiel méthanogène, de profil hydrolytique et de flore microbienne. Suite à la définition de ce système expérimental, son comportement hydrolytique a été comparé à celui d'un test de lixiviation de référence (NF EN 12457-4) afin de valider l'intérêt opérationnel de la percolation pour l'hydrolyse des OMR. De façon inattendue, l'extraction de 38,90% de la matière carbonée initiale du déchet a ainsi été mise en évidence lors de l'hydrolyse par percolation contre 17,84% lors de l'hydrolyse par lixiviation, renforçant l'intérêt suscité par la percolation pour l'hydrolyse des OMR. L'optimisation des performances d'hydrolyse par percolation a ensuite été réalisée par le criblage de huit paramètres opérationnels afin de déterminer leur influence sur les performances d'hydrolyse des OMR, au travers de deux plans d'expérience. L'ajout d'alcalinité (12 gHCO3-.L-1) et la recirculation du percolat pendant 6 h par jour ont ainsi permis d'augmenter significativement les performances d'hydrolyse, passant de 17 à 43% d'extraction de la matière organique (DCO) initiale du déchet (autrement dit de 26 à 69% de la matière biodégradable initiale). L'étude des communautés microbiennes et de leur activité a également été réalisée. Le séquençage des pyrotags d'ADNr 16S a ainsi permis de mettre en évidence le caractère dominant des Classes Clostridia et Bacteroidia au sein des communautés hydrolytiques. Le couplage de cette démarche qualitative à une approche quantitative par qPCR sur une série de biomarqueurs taxonomiques et fonctionnels a permis de montrer qu'il existe une corrélation positive entre l'ajout de carbonates, la neutralisation du pH, la quantité de matière hydrolysée à 14 jours et soit l'abondance de la Classe Bacteroidia soit celle des gènes de la famille hydA, impliqués dans la fermentation. Finalement, l'analyse microbiologique a été approfondie au jour 4, c'est-à-dire durant la phase d'hydrolyse intense, grâce à une approche de métatranscriptomique. L'analyse des transcrits fonctionnels indique que l'alcalinité influence l'activité des microorganismes de la Classe Clostridia dès le jour 4 des essais d'hydrolyse. Plus spécifiquement, l'ajout de carbonates semble corrélé à une modification du métabolisme des sucres chez des microorganismes non cultivables apparentés à Clostridium cellulolyticum et à l'augmentation de l'expression de l'opéron nif, impliqué dans la fixation de l'azote, chez différents groupes de microorganismes. / In the framework of the European green policy, anaerobic digestion appears as a promising technology for stabilization and valorization of Municipal Solid Waste (MSW). In practice, mechanical mixing of a complex and heterogeneous matrix such as MSW induces major operational constraints. Anaerobic digestion performances are especially limited by hydrolysis of lignocellulosic fractions which represent the main part of MSW methanogenic potential. In this context, this PhD project was aiming to characterize and optimize of a percolation process in which MSW stands still. Preliminary experiments were conducted in order to define an experimental system suitable for lab-scale study of MSW hydrolysis. Therefore, the representativeness of an easy-to-use and reproducible reconstituted waste was verified in terms of methanogenic potential, hydrolytic profiles and associated microbial communities. Following system definition, hydrolysis behavior by percolation was compared to a reference lixiviation test (NF EN 12457-4). Surprisingly, hydrolysis by percolation permitted the extraction of 39% of carbonated matter initially contained in waste whereas 18% were extracted during hydrolysis by lixiviation, thus validating operational benefit of percolation for MSW hydrolysis. Optimization of hydrolysis performance was then conducted through the screening of eight operational parameters for their influence on MSW hydrolysis performances thanks to two Designs Of Experiment (DOE). Cumulative effect of alkalinity addition (12 gHCO3-.L-1) and percolate recirculation (6 hour.day-1) significantly improved hydrolysis yield, from 17 to 43% of extracted organic matter compared to the initial content of waste (corresponding to an extraction of 26 and 69% of biodegradable matter). Structure and activity of hydrolytic microbial communities were also studied. 16S rDNA-pyrotags sequencing brought out the dominance of classes Clostridia and Bacteroidia. Additionally, a quantitative approach led by qPCR revealed a correlation between carbonates addition, pH neutralization, amounts of hydrolyzed matter at day 14 and either class Bacteroidia or genes from hydA family, involved in fermentation. Finally, metatranscriptomic approach was conducted at day 4 in order to further study microbial activity during the intense hydrolysis phase. According to functional analysis, alkalinity seems have positive influence on class Clostridia activity. More specifically, carbonates addition seems correlated to a modification of carbohydrates metabolism of organisms affiliated to Clostridium cellulolyticum and to transcriptional up-regulation of nif operon, involved in nitrogen fixation, among various types of microorganisms.