La pyocyanine (PYO) est une phénazine de couleur bleu-vert, produite spécifiquement par la bactérie pathogène opportuniste Pseudomonas aeruginosa (Pa). La toxicité aérobie de la PYO envers les cellules de mammifères, les levures et les bactéries a été décrite de longue date, mais la compréhension des mécanismes d'action est encore lacunaire, en particulier en conditions de limitation en O2 (conditions rencontrées dans le contexte infectieux). De plus, il a récemment été montré que la PYO peut apporter des effets bénéfiques pour la souche productrice en hypoxie. Au cours de ce travail, nous avons réexaminé les effets de la PYO sur un large panel de bactéries dont son propre producteur (Pa) ainsi que sur un modèle cellulaire eucaryote Saccharomyces cerevisiae exposées à différentes tensions en O2. Nos données suggèrent que la toxicité aérobie de la PYO envers S. cerevisiae est multifactorielle, impliquant à la fois une interaction avec le complexe III de la chaîne respiratoire et l'induction d'un stress oxydatif. Pour la première fois, nous avons mis en évidence une toxicité de la PYO exacerbée en anaérobiose chez un eucaryote (S. cerevisiae). Le mécanisme d'action impliquerait le PYO radical. Nous avons également montré que la PYO peut inhiber la croissance aérobie et anaérobie des microorganismes concurrents, plus particulièrement S. aureus en bloquant le complexe III de la chaîne respiratoire. A l'inverse, la PYO peut stimuler la respiration de Pa surtout dans les conditions mimant le contexte infectieux (hypoxie, vie ralentie). Le complexe III et/ou les oxydases terminales cbb3 serait impliqué favorablement. En conclusion, la PYO jouerait à la fois un rôle de poison hypoxique mais aussi un rôle de navette redox bénéfique pour la survie et la virulence de Pa en hypoxie.

Pseudomonas aeruginosa et Stenotrophomonas maltophilia, pathogènes opportunistes majeurs, pourraient acquérir leur résistance aux antibiotiques dans l'environnement, sous la pression exercée par les métaux lourds par co-sélection de résistance. Nous avons tout d'abord évalué la distribution et l'abondance de ces espèces dans un large panel de sols d'origine géographique différente (France et Afrique) et évalué l'influence d'activités anthropiques susceptibles d'exposer les sols en éléments métalliques sur cette distribution. Alors que la présence de P. aeruginosa est sporadique et plutôt liée à un apport exogène, S. maltophilia est présente dans tous les sols étudiés, suggérant son endémicité. L'évaluation des résistances des souches isolées de ces sols a également montré des différences entre les deux espèces. Les souches environnementales de P. aeruginosa sont pour la plupart caractérisées par un phénotype sauvage alors que celles de S. maltophilia présentent une grande diversité de phénotypes en fonction des sites, parfois similaires à ceux de souches cliniques. Cette diversité peut être attribuée à l'adaptation aux conditions environnementales très différentes rencontrées mais il est difficile d'attribuer précisément aux métaux un rôle dans la co-sélection de ces résistances. L'étude menée sur la communauté bactérienne d'un sol contaminé a également permis de mettre en évidence une forte proportion de bactéries résistantes à différents antibiotiques représentée par des espèces qualifiées de pathogènes opportunistes ainsi que la présence du gène blaIMP, permettant la résistance à l'imipénème, utilisé en milieu clinique pour le traitement de clones multi-résistants.

The opportunistic bacterial pathogen Pseudomonas aeruginosa uses type IV pili (T4P) for adherence to, and rapid colonization of, surfaces via twitching motility. T4P are formed from thousands of pilin (PilA) subunits. Two groups of P. aeruginosa pilins were described previously (I and II), distinguished by protein length and sequence. PilA_I was glycosylated with an O-antigen subunit through the action of PilO/TfpO, encoded downstream of pilA_I. To determine if additional pilin variants existed, analysis of the pilin locus of >300 P. aeruginosa strains from a variety of environments was conducted. Three additional pilin alleles were discovered, each of which was invariantly associated with a unique, previously unidentified, downstream gene(s): pilA_III+tfpY, pilAIV+tfpW+tfpX, pilA_V+tfpZ. This survey also revealed that strains with group I T4P were more commonly associated with respiratory infections than strains with other pilins, suggesting that glycosylated T4P may confer a colonization advantage in this environment. The newly identified group IV pilin, represented by strain Pa5196, migrated aberrantly through SDS-PA gels, suggesting it was also glycosylated, a hypothesis confirmed by periodic acid-Schiff staining and mass spectrometry (MS) analyses. Disruption of Pa5196 O-antigen biosynthesis did not prevent the production of glycosylated pilins, demonstrating that these pilins were modified in a novel manner, unlike group I pilins. Using MS, nuclear magnetic resonance spectroscopy and site-directed mutagenesis, the Pa5196 pilins were shown to be uniquely modified with homo-oligosaccharides of mycobacterial-like α-1,5-D-arabinofuranose at multiple locations. Residues Thr64 and Thr66, located on the αβ-loop region of the protein, appear to be the preferred, but not exclusive sites of modification, each being modified with up to four D-Araf sugars. This region of the pilin is partially surface-exposed in the pilus, therefore modification of these sites may influence the surface chemistry of the fibre. Residues Ser81, Ser82, Ser85 and Ser89, located in the β-strand region, were also modified, mainly with mono- and disaccharides. Bioinformatic analyses and mutagenesis of TfpW suggest that this novel protein is an arabinosyltransferase necessary for PilA_IV modification. This research has increased our understanding of the complexity of this virulence factor, and may aid in development of new therapeutics for P. aeruginosa and mycobacterial infections.

Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic, nosocomial pathogen for which antibiotic resistance and biofilm development is common. Quorum sensing communication is known to be a major controlling factor in virulence gene expression, biofilm development, antibiotic resistance factors, and specifically MexAB-OprM multi-drug efflux pump expression in P.aeruginosa. MexAB-OprM efflux pumps contribute to antibiotic resistance of tetracycline and other antibiotics in pseudomonads and other organisms. P.aeruginosa infections are problematic in cystic fibrosis and burn patients; it is also the number one causative agent of respiratory infections for intensive care unit patients. Present day antibiotics are losing the battle against these infections. In theory, quorum sensing inhibitors (QSI) reduce pathogencity of the organism; making it less virulent, thus allowing either the host immune system to clear the infection or use of a QSI in combination with an antibiotic to clear more persistent pathogens. For these reasons two alternative modes of treatment were explored in this study: quorum sensing inhibition by folk-medicinal plant extracts and an example of combination drug therapy, the “thyme-tetracycline effect”. Fifty folk-medicinal plant extracts were screened for potential anti-quorum sensing activity using two quorum sensing inhibition (QSI) reporter strains, Pseudomonas aeruginosa QSIS2 and Chromobacterium violaceum 12725. These were used to test specifically for C4-C6 and C12 HSL quorum sensing inhibition. Of the fifty plants tested, thirty plant families were represented. Eleven plant extracts (basil, chaparral, clove, cranberry, oregano, pomegranate, rosemary, sage, sassafras, thyme and witch hazel) showed C4 HSL quorum sensing inhibition as determined by both assays. Interestingly, five of the plants were from the Lamiaceae family. Thymus vulgaris (thyme), also from the Lamiaceae family, was chosen for further assessment. Previous research has shown that thyme extract can synergistically augment tetracycline activity against tetracycline-resistant Pseudomonas aeruginos, creating the “thyme-tetracycline effect.” Disc diffusion assay, thin layer chromatography (TLC), and TLC bioassay techniques were used to show that thymol is the active component in the thyme extract that augments tetracycline activity against resistant Pseudomonas. This study also showed that thymol is a potent C4 HSL quorum sensing inhibitor. The collective data suggests a potential mode of action for the thyme-tetracycline effect: thymol appears to prevent MexAB-OprM efflux pump gene expression. By blocking MexAB-OprM expression, tetracycline antibiotic accumulation can occur within the cell, thus allowing cellular damage.

Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans have shown antagonistic relationships, both in vivo and in vitro. The interaction between P. aeruginosa and C. albicans is one of the many prokaryotic-eukaryotic interactions existing in nature and needs more research due to their complex pathogenicity in humans. In this work, we have studied growth dynamics of Candida in a mixed population of Pseudomonas and Candida, and their receptor and ligand specificities, both from an ecological and a molecular point of view. Initially, growth, viability, and morphogenesis of Candida were studied in the presence of Pseudomonas and the conditioned medium of Pseudomonas using two Candida strains, namely CAF2 and tup1 mutant. The killing effect of Pseudomonas was more pronounced on the hyphal form of Candida. However, growth of Candida was inhibited by Pseudomonas irrespective of its morphological form. The conditioned medium had no effect on the growth rate of Candida. Nevertheless, it completely inhibited the germination of Candida. The attachment of Pseudomonas to Candida was studied using different strains of both, and with Pseudomonas cells harvested at different stages of its growth. The percent attachment varied with the age of the textit Pseudomonas culture. A lecB mutant of Pseudomonas showed a two-fold reduction in attachment compared to the wild type PAK strain. Carbohydrate inhibition studies confirmed that LecB is not directly involved in the attachment mechanism, but indirectly involves through regulating the expression of other proteins required for attachment. A genomic DNA library of Pseudomonas PAO1 was screened for clones that had acquired the ability to attach to C. albicans. A clone was isolated with a small increase in attachment and was subjected to genetic analysis. It contained nucleotides 458565 to 475917 of the Pseudomonas genome including some genes of the Pil-Chp gene cluster. Seven transposon mutants that represent mutations in ChpA,B,C,D,E operon and three other ORFs were selected, and their attachment ability was tested. All seven mutants showed a reduction in attachment indicating that this was a non specific effect, which could be attributed to the in vitro manipulation of the bacteria. We conclude that the attachment of Pseudomonas to Candida is multi-factorial.

The opportunistic bacterial pathogen Pseudomonas aeruginosa uses type IV pili (T4P) for adherence to, and rapid colonization of, surfaces via twitching motility. T4P are formed from thousands of pilin (PilA) subunits. Two groups of P. aeruginosa pilins were described previously (I and II), distinguished by protein length and sequence. PilA_I was glycosylated with an O-antigen subunit through the action of PilO/TfpO, encoded downstream of pilA_I. To determine if additional pilin variants existed, analysis of the pilin locus of >300 P. aeruginosa strains from a variety of environments was conducted. Three additional pilin alleles were discovered, each of which was invariantly associated with a unique, previously unidentified, downstream gene(s): pilA_III+tfpY, pilAIV+tfpW+tfpX, pilA_V+tfpZ. This survey also revealed that strains with group I T4P were more commonly associated with respiratory infections than strains with other pilins, suggesting that glycosylated T4P may confer a colonization advantage in this environment. The newly identified group IV pilin, represented by strain Pa5196, migrated aberrantly through SDS-PA gels, suggesting it was also glycosylated, a hypothesis confirmed by periodic acid-Schiff staining and mass spectrometry (MS) analyses. Disruption of Pa5196 O-antigen biosynthesis did not prevent the production of glycosylated pilins, demonstrating that these pilins were modified in a novel manner, unlike group I pilins. Using MS, nuclear magnetic resonance spectroscopy and site-directed mutagenesis, the Pa5196 pilins were shown to be uniquely modified with homo-oligosaccharides of mycobacterial-like α-1,5-D-arabinofuranose at multiple locations. Residues Thr64 and Thr66, located on the αβ-loop region of the protein, appear to be the preferred, but not exclusive sites of modification, each being modified with up to four D-Araf sugars. This region of the pilin is partially surface-exposed in the pilus, therefore modification of these sites may influence the surface chemistry of the fibre. Residues Ser81, Ser82, Ser85 and Ser89, located in the β-strand region, were also modified, mainly with mono- and disaccharides. Bioinformatic analyses and mutagenesis of TfpW suggest that this novel protein is an arabinosyltransferase necessary for PilA_IV modification. This research has increased our understanding of the complexity of this virulence factor, and may aid in development of new therapeutics for P. aeruginosa and mycobacterial infections.

Escapin is an L-amino acid oxidase that produces antimicrobial metabolites collectively called “Escapin Intermediate Products” (EIP-K). EIP-K and H2O2 together were previously shown to be bactericidal towards diverse planktonic bacteria. The present work investigates the ability of EIP-K and H2O2 to antagonize bacterial biofilms, using Pseudomonas aeruginosa as a model. The project had three aims: 1) determine the most effective concentrations of EIP-K and H2O2 necessary to break down existing P. aeruginosa biofilms, using a crystal violet assay; 2) examine the ability of EIP-K + H2O2 to inhibit biofilm formation, using triphenyl tetrazolium chloride dye; and 3) determine the effect of EIP-K + H2O2 on the viability, biomass and structure of biofilms cultivated in flow cells using confocal laser scanning microscopy (CLSM). Results showed that EIP-K + H2O2 significantly reduced biofilm biomass relative to controls and that the compounds are effective at nanomolar concentrations.

Los biotensioactivos son compuestos producidos por microorganismos que poseen actividad superficial, baja toxicidad, carácter biodegradable y efectividad a temperaturas y valores de pH extremos. Los ramnolípidos, son un tipo de biotensioactivos con interesantes actividades biológicas, que parecen estar relacionadas con su interacción con las membranas. En esta tesis doctoral se estudia la interacción de la fracción dirramnolipídica purificada de cultivos de Pseudomonas aeruginosa con membranas modelo y membranas biológicas, la interacción con albúmina de suero bovino, utilizada como proteína modelo, y por último, se evalúa el papel de este biotensioactivo en la estabilización de liposomas sensibles a pH y su aplicación en la introducción de compuestos en células animales. Para el desarrollo de este trabajo de investigación se han utilizado técnicas como calorimetría, FT-IR, difracción de rayos X, dispersión de luz dinámica y microscopía electrónica. / Rhamnolipids are bacterial biosurfactants produced by Pseudomonas spp. These compounds have been shown to present several interesting biological activities. It has been suggested that the interaction with the membrane could be the ultimate responsible for these actions. This thesis presents a detailed molecular level study of the dirhamnolipid interactions with artificial phospholipids membranes and biological membranas, and the dirhamnolipid interactions with bovine serum albumin, used as a general globular protein model. Furthemore, this work includes the characterization of phosphatidylethanolamine/diRL pH-sensitive liposomes described as efficient systems for cytoplasmic delivery of foreign compounds into living cells. It has been employed a number of physical techniques such as calorimetry, FTIR, small angle X-ray (SAX) diffraction and dynamic light scattering.

Le système de sécrétion de type III est présent chez plusieurs pathogènes à Gram négatif chez qui cette véritable nanomachine est impliquée dans le transport de molécules de virulence directement des bactéries vers le cytoplasme des cellules-cible. Pseudomonas aeruginosa, bactérie dont l'aiguille de sécrétion de type III est étudiée dans cette thèse, est responsable de nombreuses maladies nosocomiales ainsi que d'infections chez les patients atteints de mucoviscidose. Ce système de sécrétion est composé d'une base ancrée dans la double membrane bactérienne et d'une structure creuse en forme d'aiguille qui est un homopolymère d'une petite protéine.<br /><br />Dans le cytoplasme bactérien, la protéine PscF qui forme l'aiguille de type III chez P. aeruginosa est stabilisée avant sa sécrétion par 2 chaperonnes distinctes; PscE et PscG. Ceci est nécessaire à la fonctionnalité du système de sécrétion de type III.<br /><br />La structure cristallographique à 2.0A de résolution du complexe hétérotrimérique PscE:PscF55-85-PscG révèle que le domaine C-terminal de la protéine de l'aiguille PscF, impliqué dans le processus de polymérisation, est enfoui dans une cavité hydrophobe de la protéine PscG repliée de façon semblable à un domaine TPR. Ceci montre que le repliement macromoléculaire nécessaire pour stabiliser la protéine de l'aiguille de type III est différent de celui décrit chez le pilus de type IV et le flagelle. Les résidus qui précèdent l'hélice C-terminale de PscF sont maintenus dépliés par des interactions hydrophobes avec PscG. Ainsi, avant sa sécrétion, PscF est maintenue partiellement dépliée par ses chaperonnes. Elle transiterait ensuite sous forme partiellement dépliée à travers l'aiguille avant de se replier lors de sa polymérisation.<br /><br />La rupture des interactions spécifiques entre PscG et PscF entraîne une nette baisse de la cytotoxicité de la bactérie envers une lignée de macrophages, ce qui indique que cet hétérotrimère essentiel, qui possède des homologues chez une grande variété de pathogènes, est une cible thérapeutique attractive pour le développement de nouveaux médicaments.

La colonisation chronique des poumons par P. aeruginosa est une cause majeure d'infection<br />et de mortalité chez les patients atteints de mucoviscidose (CF). Pour la bactérie pathogène, la<br />capacité à adhérer aux cellules hôtes est essentielle pour initier l'infection, et les<br />glycoconjugés présents à la surface des cellules épithéliales sont autant de cibles pour les<br />récepteurs bactériens. Chez les patients CF, des modifications surviennent dans les<br />glycoconjugués des surfaces épithéliales ainsi que dans les mucines pulmonaires et salivaires.<br />Une augmentation d'oligosaccharides fucosylés de type Lewis est observée, souvent<br />accompagnée de sialylation et/ou sulfatation.Une lectine soluble, PA-IIL, reconnaissant<br />spécifiquement le fucose, a été identifiée dans le cytoplasme de P. aeruginosa. Cette lectine,<br />également présente sur la surface de la bactérie, pourrait être impliquée dans la<br />reconnaissance de l'hôte et/ou dans la formation du biofilm responsable de la résistance de la<br />bactérie contre les antibiotiques. Les travaux développés dans la thèse portent sur l'étude<br />structurale et thermodynamique de l'interaction de PA-IIL avec des ligands naturels et des<br />glycomimétiques de synthèse. Des tests d'interaction ELLA (Enzyme-Linked Lectin Assays)<br />ont été mis en place afin d'évaluer les propriétés inhibitrices de ces composés. Ces travaux<br />constituent une première approche dans la conception de composés dérivés des sucres<br />pouvant servir comme alternative aux antibiotiques utilisés dans les infections survenants<br />chez les patients atteints de mucoviscidose. (Projet financé par l'association: Vaincre la<br />Mucoviscidose)