L’objectif de cette thèse a été d’étudier un traitement de surface innovant basé sur un contact avec un mélange réactionnel gazeux F2/O2. (oxyfluoration) déjà utilisé industriellement sur polymères mais sans application jusqu’à présent au niveau des fibres naturelles. Ces travaux se sont inscrits dans le cadre d’un projet collaboratif ayant pour objectif d’étudier et de développer les applications industrielles de ce traitement sur des fibres naturelles d’origines végétales (coton, lin) et animales (laine et soie). Le but a été d’intégrer principalement des fonctions oxygénées. La compréhension des mécanismes en jeu a été réalisé via la combinaison de plusieurs techniques d’analyse de surface, parmi lesquelles les techniques de microscopie (MEB, AFM) et les techniques spectroscopiques (XPS, ToF-SIMS). Grâce à la complémentarité de ces différentes techniques d’analyses il est apparu que le traitement d’oxyfluoration ne dégrade pas la surface et introduit en surface une quantité significative d’oxygène peu dépendante de la composition initiale du support mais avec des fonctions chimiques par contre variables selon la structure chimique initiale. Les résultats obtenus, notamment lors de tests de stabilité, ont montré que le fluor, également détecté en surface après le traitement, n’est pas réellement intégré dans la structure chimique des supports. La comparaison à des traitements plasmas a montré que le traitement présente moins de variabilité, ce qui a été confirmé en envisageant, via un plan d’expériences, l’ensemble des modifications possibles dans un contexte d’application industrielle. L’étude d’un transfert industriel a ensuite été mise en œuvre dans le cas du remplacement des traitements de préparation avant teinture du coton et l’efficacité a été testée en fonction des résultats des tests métiers. Le manque de variabilité du traitement n’a pas permis d’identifier de conditions suffisamment optimales pour proposer le remplacement des traitements actuels malgré les avantages d’un traitement en phase gazeuse et à pression atmosphérique / The objective of this thesis was to study a new surface treatment based on contact with a gaseous reaction mixture F2/O2. (oxyfluorination) already used industrially on polymers but not yet applied to natural fibres. This work was part of a collaborative project aimed at studying and developing the industrial applications of this treatment on natural fibres of vegetable (cotton, linen) and animal (wool and silk) origin. The aim was to integrate mainly oxygenated functions. The understanding of the mechanisms involved was achieved by combining several surface analysis techniques, including microscopy techniques (SEM, AFM) and spectroscopic techniques (XPS, ToF-SIMS). Thanks to the complementarity of these different analysis techniques, it appeared that the oxyfluorination treatment does not degrade the surface and introduces a significant quantity of oxygen on the surface, which is not very dependent on the initial composition of the support but with chemical functions that vary according to the initial chemical structure. The results obtained, particularly in stability tests, have shown that fluorine, also detected on the surface after treatment, is not really integrated into the chemical structure of the supports. The comparison with plasma treatments showed that the treatment has less variability, which was confirmed by considering, via a design of experiments, all the possible modifications in an industrial application context. The study of an industrial transfer was then implemented in the case of the replacement of preparation treatments before dyeing cotton and the effectiveness was tested according to the results of the business tests. The lack of treatment variability did not allow to identify sufficiently optimal conditions to propose the replacement of current treatments despite the advantages of gas phase and atmospheric pressure treatment

Durch die Untersuchungen der vorliegenden Arbeit ist es erfolgreich gelungen die beiden gram-positiven Mikroorganismen Lysinibacillus sphaericus JG-A12 und Lysinibacillus sphaericus JG-B53 unter geregelten und idealen Kultivierungsbedingungen im Bioreaktor in hinreichenden Biomasseausbeuten zu kultivieren. Aus der Biomasse beider Stämme ist es anschließend gelungen, die primären Zellwandkomponenten bestehend aus Membranlipiden, Peptidoglykan mit sekundären Zellwandpolymeren und S-Layer-Proteinen in reiner Form und in guten Ausbeuten zu extrahieren. Diese Zellwandkomponenten wurden dann unter Verwendung von biochemischer und strukturanalytischer Methoden charakterisiert. Dabei ist es erstmals gelungen, die Membranlipide beider genutzter Mikroorganismen in Bezug auf deren Zusammensetzungen der enthalten hydrophoben Fettsäuren und der hydrophilen phosphathaltigen Kopfgruppen zu charakterisieren. Durch die vergleichend durchgeführten Metallbindungsversuche im Batch-Verfahren konnten Bindungspräferenzen intakter Zellen von Lysinibacillus sphaericus JG-A12 und Lysinibacillus sphaericus JG-B53 und deren isolierten Zellwandkomponenten mit den Metallen As, Au, Cd, Eu, Pb, Pd, Pt bzw. U untersucht werden. Dabei konnten sowohl in den Untersuchungen intakter Zellen und der primären Zellwandbestandteile deutlich höhere Metallsorptionsraten und Metallentfernungseffizienzen für Lysinibacillus sphaericus JG-B53 festgestellt werden als dies bei Lysinibacillus sphaericus JG-A12 nachzuweisen war. Dies macht diesen Stamm für potentielle technische Anwendungen als metallselektives biosorptives Material weitaus interessanter. Die Untersuchungen der Einzelkomponenten in Suspension lieferten jedoch nur begrenzt Informationen zur Interaktion der Metalle mit den Schichten wie sie unter natürlichen Bedingungen in der Zelle vorkommen. Daher wurden unter Verwendung der QCM-D erstmals die primären Zellwandkomponenten beider Mikroorganismen (S-Layer und Peptidoglykan) sowie von Referenzlipiden an Grenzflächen erfolgreich im nanoskaligen Bereich abgeschieden und online verfolgt. Dadurch war es möglich vereinfachte Einzelschichtsysteme der gram-positiven bakteriellen Zellwand nachzubilden. In den Untersuchungen konnten stabile Schichten generiert werden, welche vergleichbar zu dem Schichtsystem vitaler Zellen sind. Zusätzlich konnte bei den Abscheidungen der S-Layer-Proteine SlfB und Slp1 der positive Effekt von Polyelektrolytmodifizierungen auf das Rekristallisationsverhalten, die Schichtstabilität und den Bedeckungsgrad auf der technischen Oberfläche aufgezeigt werden. Zur Untersuchung der Metallinteraktion zellulärer Einzelschichtsysteme wurden in dieser Arbeit exemplarisch nach den erfolgreichen Untersuchungen zur Rekristallisation, die S-Layer-Proteine als erste Interaktionsschicht des Gesamtzellsystems mit der QCM-D untersucht. Diese stabilen und intakten Schichten konnten analog zu den Schichtuntersuchungen der reinen biologischen Komponenten und nach den QCM-D Metallinteraktionsstudien mit den S-Layer Strukturen mittels der Rasterkraftmikroskopie (AFM) untersucht und bildgebend dargestellt werden. In weiteren spektroskopischen Untersuchungen (TRLFS) der Zellwandkomponenten konnten die lumineszierenden Eigenschaften von Europium ausgenutzt werden, um das Metallbindungsverhalten der einzelnen Komponenten als auch des Gesamtsystems der Zellen beider Mikroorganismen zu bestimmen. Somit konnte Europium als spektroskopische Sonde eingesetzt werden um Rückschlüsse die Biomolekül-Metallwechselwirkungen zu ermöglichen. Dabei konnten vor allem mit den beiden oberflächennahen Zellschichten Lösung teilweise sehr starke Metall-Biomolekül-Wechselwirkungen beobachtet werden.

Nanofibres are found in a broad variety of hierarchical biological systems as fundamental structural units, and nanofibrillar components are playing an increasing role in the development of advanced functional materials. Accurate determination of the mechanical properties of single nanofibres is thus of great interest, yet measurement of these properties is challenging due to the intricate specimen handling and the exceptional force and deformation resolution that is required. The atomic force microscope (AFM) has emerged as an effective, reliable tool in the investigation of nanofibrillar mechanics, with the three most popular approaches—AFM-based tensile testing, three-point deformation testing, and nanoindentation—proving preferable to conventional tensile testing in many (but not all) cases. Here, we review the capabilities and limitations of each of these methods and give a comprehensive overview of the recent advances in this field.

Compartmentalization of cell membranes, in particular of the apical membrane of columnar epithelia, is the topic of this thesis. The first part characterizes the apical membrane and its specialized organization and morphology, whereas the second part focuses on the formation of this unique plasma membrane domain during epithelial polarization. The apical membrane of columnar epithelia is enriched in glycosphingolipids, a class of lipids that are known to interact with cholesterol to form liquid ordered domains, also termed "rafts", in cell membranes. Imaging the apical surface of untreated and raft lipid depleted MDCK cells with atomic force microscopy revealed that raft lipids are involved in the formation and/or maintenance of microvilli, actin based protrusions of the apical plasma membrane, indicating a regulatory link between membrane domains and the cytoskeleton. Furthermore, antibody patching and photobleaching experiments performed during the work of this thesis suggest that the organization into raft and non-raft domains is very different in the apical membrane of MDCK cells compared to the plasma membrane of a fibroblast. In fact, the data support the hypothesis that the apical membrane could be a percolating raft membrane in which rafts constitute the major phase and non-raft domains exist as isolated entities. The second part of this thesis analyses the segregation of apical and basolateral membrane domains during epithelial polarization. This segregation can either be achieved by generating scaffolded domains prior to junction formation or by polarized secretory and endocytic membrane traffic after the establishment of cell junctions. While most apical and basolateral marker proteins in MDCK cells follow the latter mechanism, this thesis reports that the apical marker gp135 is confined to the dorsal face already in single attached cells. The unknown antigen was purified and identified as podocalyxin. Analysis of a series of domain mutants revealed that the C-terminal PDZ-binding motif of podocalyxin is mainly responsible for its special localization, which it shares with the PDZ protein NHERF-2. Knocking down podocalyxin by RNA interference resulted in retardation of cell growth and epithelial polarization. Taken together, the data suggest that podocalyxin and NHERF-2 could be part of an early apical polarity scaffolding system based on PDZ-binding and PDZ-containing proteins.

Specifically binding ions induce the transition of anionic polyacrylate coils from extended conformation to collapsed globules passing through a cascade of intermediate states when solution conditions approach the L-type precipitation threshold. It is the conformation of these intermediate states on surfaces and in solution which is at the focus of this thesis. In comparing the surface and solution conformations of intermediate states, we were able to qualitatively and quantitatively underline the effects of sample history. Two types of quantitative comparisons have been emphasized. In real space, the radius of gyration values of adsorbed molecules have been evaluated incorporating fully the x, y and z axes. These values have been compared with radius of gyration values of the very same sample solution obtained using SLS. In reciprocal space, a novel image processing protocol has been used to generate the 2D form factor curve wherein the correlation maxima have been compared with corresponding maxima obtained for the very same sample solution using small angle scattering techniques like the SANS. The influence of bivalent ions, respectively, Strontium, Lead and Calcium, on the shape of polyacrylate coils is studied. In the last case, temperature has been introduced as a secondary parameter to shed further light on the mechanism by which polyelectrolytebivalent ion complexation takes place. Both scattering and AFM experiments reveal formation of necklace-like structures as intermediates for NaPA-Sr2+ system. Since the mol. wt. of the NaPA coils used was relatively large in this case, adsorption on mica surfaces was strong. Under such conditions, the molecules undergo a z collapse upon flux drying but do not get altered in x and y directions. The ratio Rg(AFM)/Rg(SLS) was found to be in the range 0.7-0.9. The remaining (insignificant) differences in the Rg Abstract ii values arise due to the fact that AFM gives the square root of number averaged mean squared radius of gyration while SLS gives the square root of z-averaged mean squared radius of gyration. The differences in radius of gyration values observed in solution and on surfaces were more prominent for NaPA-Pb2+ system. Again, although both scattering and AFM reveal necklace-like structures as intermediates, the ratio Rg(AFM)/Rg(SLS) was now found to be nearly 0.6. The fact that Rg(AFM) is the square root of number averaged and Rg(SLS) is the square root of z-averaged mean squared radius of gyration, alone cannot explain this low value. Since the mol. wt. of NaPA coils used in this case was quite low, adsorption on mica surfaces was weak. Under such conditions, the molecule does not only undergo a z collapse upon flux drying, but also shrinks in the x and y directions due to capillary forces. Finally, with NaPA-Ca2+ system, the picture did not show a one-to-one correspondence between solution and surface conformations at all. In fact, it showed a one-step-ahead correspondence. As already stated, the coil to globule transition was induced by increasing the equilibration temperature from 15°C to 30°C in this case. SANS could not identify any necklace-like intermediates in solution at the equilibration temperature of 15°C while AFM scans at this temperature showed the beginning of formation of pearls. Likewise, at the equilibration temperature of 30°C, SANS could identify necklace-like intermediates in solution with a large majority of dumbbells while AFM scans at this temperature showed a mix of dumbbells, sausage-like structures and globules. Indeed, we were witnessing an accelerated coil to globule transition on surfaces as compared to the situation in solution resulting in a pre-emption in the formation of intermediate states on surfaces. Since the ratio Rg(AFM)/Rg(SLS) (given the square root of number averaged and the square root of z-averaged mean Abstract iii squared values respectively) at the equilibration temperature of 30°C showed a range of 0.7-0.9 indicating strong adsorption of the relatively high mol. wt. NaPA coil on mica surfaces, our suspect were the substrate-sample interaction forces. The AFM scans were therefore analysed with 2D form factor curves, a better protocol when no assumptions about the shape of adsorbed molecules are made a priori, to trace the effects of sample history. The thesis establishes the general utility of AFM to capture the essential features of a collapsing coil which the very coil exhibits in solution. The shape of the coil on surface and in solution may not be exactly the same, yet reveal the same characteristics. The comparative advantages and disadvantages of salt pre-treated mica surfaces and chemically modified mica surfaces have been brought out. Finally, a definitive new insight is gained as regards the mechanism of coil collapse induced by specifically binding ions. The entropic nature of the process as well as the visualized shape of the collapsing intermediates does not support a mechanism along an electrostatically driven shrinking with linear, rod-like arrays of pearls as intermediates. On a molecular level, it is the liberation of water molecules and Na+ ions which promotes binding of bivalent ions to COO- residues. This binding in turn increases the hydrophobicity of the polyacrylate chains. As a consequence, the chains shrink due to an increased propensity for polymerpolymer contacts (and finally precipitate).

In der Arbeit wird das Reibungsverhalten an Polymerbürsten im nanoskopischen und makroskopischen Kontakt beschrieben. Besonderes Augenmerk liegt auf den durch Reibung hervorgerufenen Deformationen.

Single-molecule force spectroscopy (SMFS) is a unique approach to study the mechanical unfolding of proteins. SMFS unfolding experiments yield insight into how interactions stabilize a protein and guide its unfolding and refolding pathways. In contrast to various water-soluble proteins whose unfolding and refolding patterns have been characterized, only α-helical membrane proteins have been probed by SMFS. It was shown that α-helical membrane proteins unfold via many intermediates; this differs from the two-state unfolding process usually observed in water-soluble proteins. In membrane proteins, upon mechanically pulling the peptide end of the protein, single and grouped α-helices and polypeptide loops unfold in steps until the entire protein is unfolded. Whether the α-helices and loops unfold individually or cooperatively to form an unfolding intermediate depends on the interactions established within the membrane protein and the membrane. Each unfolding event relates to an unfolding intermediate with the sequence of these intermediates defining the unfolding pathway of the protein. β-barrel-forming membrane proteins are the second major group of membrane proteins and have not yet been studied by SMFS. To fill this void this study was designed to characterize interactions, unfolding, and refolding of the β-barrel forming outermembrane protein G (OmpG).Folding of transmembrane proteins, despite the important part these proteins play in every biological process in a cell, is studied in only a few examples. Of those only a handful were β-stranded membrane proteins (Tamm et al., 2004; Kleinschmidt et al., 2006). Current models describe that transmembrane β-barrels fold into the lipid membrane via two major steps. First the unfolded polypeptide interacts with the lipid surface where it then folds and inserts into the membrane (Kleinschmidt et al., 2006; Huysmans et al., 2010). Conventionally, thermal or chemical denaturation is used to study folding of membrane proteins. In most cases membrane proteins were solubilized in detergent or exposed to urea to be studied, conditions that are not compatible with In vivo conditions. This suggests that the folding pathways described so far may not be a realistic representation of such pathways in nature. SMFS represents a unique approach to study the unfolding and refolding of membrane proteins into the lipid membrane (Kedrov et al., 2006; Kessler et al., 2006). Using SMFS makes it possible to study unfolding and refolding of membrane proteins in their nativephysiological environment with controlled pH, electrolyte, temperature, and most importantly in the absence of any chemical denaturant or detergent. In this thesis, SMFS was utilized to unfold and refold OmpG in E coli lipid extract. Bulk unfolding experiments suggested that OmpG unfolds and folds reversibly and much faster than α-helical proteins (Conlan et al., 2000). The folding process is thought to be a coupled two-state membrane partition-folding reaction. To the contrary, the mechanical unfolding of OmpG consisted of many sequential unfolding intermediates. Our SMFS refolding experiments showed that a partially unfolded OmpG molecule also refolds via several sequential steps. The predominant refolding steps are defined by individual β-hairpins that could later assemble the transmembrane β-barrel of OmpG. In conclusion, the most probable unfolding and refolding pathways of OmpG as a membrane β-barrel protein go through the β-hairpins as the structural segments or unfolding-refolding intermediates and the process is a multi step one rather than the simple two state process. We also used SMFS to study the physical interactions that switch the functional state and gating of OmpG. The structural changes that gate OmpG have been previously described by X-ray crystallography (Yildiz et al., 2006). They showed when the pH changes from neutral to acidic the flexible extracellular loop L6 folds into the pore and closes the OmpG pore. Here, SMFS was used to structurally localize and quantify the interactions that are associated with the pH-dependent closure. At an acidic pH, a pH-dependent interaction at loop L6 was detected. This interaction changed the unfolding of loop L6 and β-strands 11 and 12, which connect loop L6. All other interactions detected within OmpG were found to be unaffected by changes in pH. These results provide a quantitative and mechanistic explanation of how pHdependent interactions change the folding of a peptide loop to gate the transmembrane pore. It has also been shown how the stability of OmpG is optimized so that pH changes modify only those interactions necessary to gate the transmembrane pore and there are no global changes in protein conformation or mechanical properties. In the next step of interactions study, dynamic SMFS (DFS) was applied to quantify the parameters characterizing the energy barriers in energy landscape for unfolding of the OmpG. Some of these parameters are: free energy of activation and distance of the transition state from the folded state. The pH-dependent functional switching of OmpG directs the protein along different regions at the unfolding energy landscape. The two functional states of OmpG sequential folding take the same unfolding pathway as β-hairpins I–IV. After the initial unfolding events, the unfolding pathways diverge. In the open state, the unfolding of β-hairpin V in one step precedes the unfolding of β-hairpin VI. In the closed state, β-hairpin V and β-strand S11 with a part of extracellular loop L6 unfold cooperatively, and subsequently β-strand S12 unfolds with the remaining loop L6. These two unfolding pathways in the open and closed states join again in the last unfolding step of β-hairpin VII. Also, the conformational change from the open to the closed state witnesses a difference in Xu and κ in the energy landscape that translates to rigidified extracellular loop L6 at the gating area. Thus, a change in the conformational state of OmpG not only bifurcates its unfolding pathways but also tunes its mechanical properties for optimum function.:Table of Contents INTRODUCTION:1 1.1 THE FIRST UNIT OF LIFE STARTED WITH MEMBRANE:1 1.2.1 CELL MEMBRANE STRUCTURE: 2 1.3 MEMBRANE PROTEINS:3 1.3.1 α-­‐HELICAL MEMBRANE PROTEINS:5 1.3.2 β-­‐BARREL MEMBRANE PROTEIN:5 1.4 MEMBRANE PROTEINS FOLDING:12 1.4.1 MODELS FOR α-­‐HELICAL MEMBRANE PROTEIN FOLDING:13 1.4.2 MODELS FOR β-­‐BARREL MEMBRANE PROTEIN FOLDING:15 1.5. GATING STUDY OF MEMBRANE PROTEINS:18 ATOMIC FORCE MICROSCOPY:19 2.1 ATOMIC FORCE MICROSCOPE:19 2.1.1 HISTORY:19 2.1.2 PRINCIPLE:19 2.1.3 THE CANTILEVER:20 2.1.4 AFM MODES 23 2.2 SINGLE-­‐MOLECULE FORCE SPECTROSCOPY:25 2.2.1 DYNAMIC FORCE SPECTROSCOPY,(DYNAMIC SMFS):27 2.3 WHAT IS THE ADVANTAGE OF USING ATOMIC FORCE MICROSCOPY IN MEMBRANE PROTEIN STUDIES?:29 FOLDING MECHANISM OF OMPG:31 3.1 UNFOLDING PATTERN: ONEβ-­‐HAIRPIN AFTER THE OTHER:31 3.1.1 OUTER MEMBRANE PROTEIN G (OMPG):31 3.1.2 MECHANICAL UNFOLDING PATHWAYS OF THE MEMBRANE β-­‐BARREL PROTEIN OMPG:33 3.1.3 MATERIAL AND METHODS:34 3.1.4 RESULTS AND DISCUSSION:41 3.2 REFOLDING PATTERN: ONE Β-­‐HAIRPIN AFTER THE OTHER:48 3.2.1. EXPLORING REFOLDING PATHWAYS AND KINETICS OF THE MEMBRANE Β-­‐BARREL PROTEIN OMPG:48 3.2.2 EXPERIMENTAL PROCEDURES:49 3.2.3 RESULTS:50 3.2.4 DISCUSSION:52 INTERACTION STUDIES:59 4.1 PH-­‐DEPENDENT INTERACTIONS GUIDE THE FOLDING AND GATE THE TRANSMEMBRANE PORE OF THE β-­‐BARREL TRANSMEMBRANE PROTEIN OMPG:59 4.1.2 INTRODUCTION:59 4.1.2 EXPERIMENTAL PROCEDURES:61 4.1.3 RESULTS AND DISCUSSION:62 4.2 DUAL ENERGY LANDSCAPE: THE FUNCTIONAL STATE OF THE OUTER MEMBRANE β-­‐BARREL PROTEIN OMPG MOLDS ITS UNFOLDING ENERGY LANDSCAPE:67 4.2.1 INTRODUCTION:67 4.2.2 EXPERIMENTAL PROCEDURES:71 4.2.3 RESULTS AND DISCUSSION:74 4.2.3.1 FUNCTIONAL STATE OF OMPG DIRECTS ITS UNFOLDING ROUTE:74 4.2.3.2 QUANTIFYING THE UNFOLDING ENERGY BARRIERS OF OMPG IN THE CLOSED AND OPEN CONFORMATIONS:75 4.2.3.3 TRANSITION STATE DISTANCES OF UNFOLDING ENERGY BARRIERS:77 4.2.3.4 ACTIVATION FREE ENERGY OF Β-­‐STRANDS AND Β-­‐HAIRPINS:79 4.2.3.5 MECHANICAL PROPERTIES OF OMPG:83 4.2.3.6 MAPPING THE UNFOLDING ENERGY LANDSCAPES OF OMPG IN THE OPEN AND CLOSED STATES:85 4.2.4 CONCLUSION:86 OUTLOOK:89 5.1 INTRODUCTION:89 5.2 INTERACTION STUDY AND UNFOLDING ENERGY LANDSCAPE:90 5.3 MEMBRANE PROTEINF OLDING:92 REFRENCES:96 ABBREVIATIONS:110 SYMBOLS:111 PUBLICATIONS:113 ACKNOWLEDGMENT:114 DECLARATION: 115

Die Besonderheit der DNA-Nanotechnologie liegt in der Verwendung von DNA als Konstruktionsmaterial für die Herstellung von artifiziellen Strukturen im Nanometermaßstab (Seeman, 1982; Winfree et al., 1998). Diese DNA-Nanoobjekte, wie beispielsweise DNA-Nanoröhren, offerieren innovative und vielversprechende Anwendungsmöglichkeiten in verschiedenen Bereichen wie der Elektronik oder Medizin. Eine Herausforderung für die dauerhafte Verwendung von DNA-Nanoröhren stellt deren Stabilität dar. Einflussfaktoren wie die DNA-Nukleaseaktivitäten, die Ionenstärke und hohe Temperaturen können dabei eine langfristige Anwendung limitieren. Als ein Lösungsansatz für die Erhöhung der Beständigkeit wird eine gezielte Mineralisierung der DNA-Nanoröhren durch spezifische Fusionsproteine angestrebt. Ziel dieser Arbeit ist die dafür notwendige Herstellung und Charakterisierung der DNA-bindenden Fusionsproteine mit Mineralisierungsdomänen vorzustellen. Das umfasst das Auswählen geeigneter DNA-Bindungsproteine als Bestandteil der Fusionsproteine. In dieser Arbeit wurden die DNA-Bindungsproteine MutH und SBB aus Escherichia coli (E. coli) sowie Yku70p aus Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) aufgrund ihrer spezifischen Bindungseigenschaften dafür identifiziert. Damit können die Fusionsproteine sequenzspezifische oder -unspezifische Bindungen mit doppelsträngiger (engl. double stranded DNA, dsDNA) oder einzelsträngiger DNA (engl. single stranded DNA, ssDNA) eingehen. Es ist mittels Klonierung gelungen, verschiedene Fusionskonstrukte mit den genannten DNA-Bindungsproteinen zu generieren. Diese beinhalten ebenfalls das enhanced green fluorescent protein sowie den His6-Tag für den Expressionsnachweis und die Proteinreinigung. Weitere Varianten der Fusionskonstrukte bestehen zusätzlich aus der tobacco etch virus-Protease-Erkennungssequenz zur Entfernung des His6-Tags und der Domänen R5-Peptid (R5P) oder Poly-L-Arginin (PLR) für die Mineralisierung. Bestandteil dieser Arbeit sind Western-Blot-Analysen und mikroskopische Aufnahmen, welche die erfolgreiche heterologe Expression aller Fusionskonstrukte nachweisen. Aus den Ergebnissen der Expressions- und Löslichkeitsanalysen lässt sich schlussfolgern, dass insbesondere das Expressionslevel und die Synthese löslicher Proteine mit den Mineralisierungsdomänen eine Herausforderung darstellen. Ebenfalls in dieser Arbeit sind Versuche zur Optimierung mit verschiedenen Expressionsstämmen (E. coli und S. cerevisiae) und Expressionsparametern (Temperatur und Induktor-Konzentration) enthalten. Den Ergebnissen nach eignen sich besonders die Fusionsproteine MutH-EGFP-His6 und SSB-EGFP-His6 für die weiteren Experimente. Die Untersuchungen der DNA-Bindungseigenschaften erfolgten mittels Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) und Rasterkraftmikroskopie (engl. atomic force microscopy, AFM). Diese Methoden mussten für jedes Fusionsprotein zuvor etabliert und optimiert werden. Zu Beginn stand das MutH-Fusionsprotein im Focus, wobei die durchgeführten EMSA-Untersuchungen die Spezifität zur GATC-Erkennungssequenz sowie zur dsDNA betrachteten. Die Charakterisierung mittels AFM diente als weitere Möglichkeit zur Analyse der DNA-Bindungseigenschaften. Zusätzlich kam in dieser Arbeit eine Variante des CRISPR/Cas9-Systems als Fusionsprotein für eine sequenzspezifische Adressierung von dsDNA zum Einsatz. Die EMSA- und AFM-Analysen deuteten dabei auf eine Interaktion von dem dCas9-Fusionsproteins und dsDNA hin. Weiterhin war das SSB-Fusionsprotein Bestandteil der Untersuchungen. Die Bindungsanalysen mittels EMSA zeigten, dass es bevorzugt mit ssDNA interagiert und nur eine geringe Affinität zu dsDNA vorliegt. Die Bindung zu ssDNA konnte ebenfalls erfolgreich anhand von AFM-Untersuchungen gezeigt werden. Zusammenfassend bestätigen die Ergebnisse die Funktionalität des MutH- und SSB-Fusionsproteins. Es konnten zudem erste Hinweise erbracht werden, die eine spezifische Bindung der Fusionsproteine an dsDNA oder ssDNA belegen. Mit dieser Arbeit ist es gelungen, Proteinderivate zu generieren und charakterisieren, wodurch eine entscheidende Grundlage für die gezielte Mineralisierung von DNA-Konstrukten geschaffen wurde.

This thesis is focused on synthesis and polymerization of caprolactone and its derivatives by living ring opening polymerization (LROP), Self-assembly in aqueous solutions produced nanoaggregates comprised of amphiphilic block copolymers or telechelic polymers with incorporated boron compounds (phenyl boronic acids and boron clusters). Incorporation of boron compounds was facilitated either by covalent or non-covalent bonding. Obtained complex nanoparticle structures manifested stimuli-responsive behaviour and were investigated under varying conditions by combination of light scattering, fluorescence spectroscopy and electron microscopy. The obtained results on solution behaviour of polymers in combination with added value of boron compounds, yield general aspects of nano aggregate morphology, responsive character tuning and practical aspects of synthesis and self-assembly overcame in the preparation process. The publications wrote during this thesis are therefore adding valuable information to researchers engaged in biomedical utilization of such nano assemblies.

Proteine spielen auf der zellulären Ebene eines Organismus eine fundamentale Rolle. Sie sind quasi die „Maschinen“ der Zelle. Ihre Bedeutung wird nicht zuletzt in ihrem Namen deutlich, welcher 1838 erstmals von J. Berzelius verwendet wurde und „das Erste“, „das Wichtigste“ bedeutet. Proteine sind aus Aminosäuren aufgebaute Moleküle. Unter physiologischen Bedingungen besitzen sie eine definierte dreidimensionale Gestalt, welche für ihre biologische Funktion bestimmend ist. Es wird heutzutage davon ausgegangen, dass diese dreidimensionale, stabile Struktur von Proteinen eindeutig durch die Abfolge der einzelnen Aminosäuren, der Sequenz, bestimmt ist. Diese Abfolge ist für jedes Protein in der Desoxyribonukleinsäure (DNS) gespeichert. Es ist allerdings eines der größten ungelösten Probleme der letzten Jahrzehnte, wie die Beziehung zwischen Sequenz und 3D-Struktur tatsächlich aussieht. Die Beantwortung dieser Fragestellung erfordert interdisziplinäre Ansätze aus Biologie, Informatik und Physik. In dieser Arbeit werden mit Hilfe von Methoden der theoretischen (Bio-) Physik einige der damit verbundenen Aspekte untersucht. Das Hauptaugenmerk liegt dabei auf Wechselwirkungen der einzelnen Aminosäuren eines Proteins untereinander, wofür in dieser Arbeit ein entsprechendes Energiemodell entwickelt wurde. Es werden Grundzustände sowie Energielandschaften untersucht und mit experimentellen Daten verglichen. Die Stärke der Wechselwirkung einzelner Aminosäuren erlaubt zusätzlich Aussagen über die Stabilität von Proteinen bezüglich mechanischer Kräfte. Die vorliegende Arbeit unterteilt sich wie folgt: Kapitel 2 dient der Einleitung und stellt Proteine und ihre Funktionen dar. Kapitel 3 stellt die Modellierung der Proteinstrukturen in zwei verschiedenen Modellen vor, welche in dieser Arbeit entwickelt wurden, um 3D-Strukturen von Proteinen zu beschreiben. Anschließend wird in Kapitel 4 ein Algorithmus zum Auffinden des exakten Energieminimums dargestellt. Kapitel 5 beschäftigt sich mit der Frage, wie eine geeignete diskrete Energiefunktion aus experimentellen Daten gewonnen werden kann. In Kapitel 6 werden erste Ergebnisse dieses Modells dargestellt. Der Frage, ob der experimentell bestimmte Zustand dem energetischen Grundzustand eines Proteins entspricht, wird in Kapitel 7 nachgegangen. Die beiden Kapitel 8 und 9 zeigen die Anwendung des Modells an zwei Proteinen, dem Tryptophan cage protein als dem kleinsten, stabilen Protein und Kinesin, einem Motorprotein, für welches 2007 aufschlussreiche Experimente zur mechanischen Stabilität durchgeführt wurden. Kapitel 10 bis 12 widmen sich Membranproteinen. Dabei beschäftigt sich Kapitel 10 mit der Vorhersage von stabilen Bereichen (sog. Entfaltungsbarrieren) unter externer Krafteinwirkung. Zu Beginn wird eine kurze Einleitung zu Membranproteinen gegeben. Im folgenden Kapitel 11 wird die Entfaltung mit Hilfe des Modells und Monte-Carlo-Techniken simuliert. Mit dem an Membranproteine angepassten Wechselwirkungsmodell ist es möglich, den Einfluss von Mutationen auch ohne explizite strukturelle Informationen vorherzusagen. Dieses Thema wird in Kapitel 12 diskutiert. Die Beziehung zwischen Primär- und Tertiärstruktur eines Proteins wird in Kapitel 13 behandelt. Es wird ein Ansatz skizziert, welcher in der Lage ist, Strukturbeziehungen zwischen Proteinen zu detektieren, die mit herkömmlichen Methoden der Bioinformatik nicht gefunden werden können. Die letzten beiden Kapitel schließlich geben eine Zusammenfassung bzw. einen Ausblick auf künftige Entwicklungen und Anwendungen des Modells.