Processos biotecnológicos importantes dependem da eficiente fermentação de hidrolisados de amido, ricos em maltose e maltotriose, pela levedura i>Saccharomyces cerevisiae. Entretanto, algumas linhagens apresentam dificuldade para consumir a maltotriose, o que diminui a eficiência fermentativa nesses processos. Embora se acredite que o transporte desse açúcar através da membrana plasmática seja o passo limitante para sua fermentação, existem conflitos na literatura em relação às permeases capazes de transportar a maltotriose. No intuito de melhorar a compreensão do metabolismo desse açúcar em S. cerevisiae, correlacionamos o fenótipo de várias cepas em maltotriose com seus respectivos genótipos. Para isso, identificamos os genes de transportadores de <font face=\"Symbol\">&#945-glicosídeos presentes nas linhagens analisadas e avaliamos o crescimento celular, a produção de etanol e as atividades de transporte por cada cepa. Para confirmar se tais genes eram, de fato, expressos, analisamos a expressão dos mesmos em diferentes condições de cultivo. Após verificarmos que a presença de um regulador constitutivo aumenta a expressão do gene AGT1 e incrementa a fermentação de maltose e maltotriose, deletamos esse gene do genoma de três linhagens de laboratório para avaliar a contribuição da permease Agt1p para a utilização de maltotriose. Embora as linhagens selvagens tenham consumido e fermentado rapidamente esse açúcar, as agt1 <font face=\"Symbol\">&#916 foram incapazes de transportar a maltotriose e de utilizála durante 3-4 dias de incubação. Contudo, após um período de incubação maior (8 dias), apenas uma das linhagens agt1 <font face=\"Symbol\">&#916 continuou incapaz de crescer em maltotriose, enquanto as outras apresentaram crescimento tardio, após ~100 h de fase lag, porém sem produção de etanol. Essa mesma fase lag extensa foi também observada em cepas industriais incapazes de expressar o AGT1. Além disso, através de QRT-PCR vimos que os transportadores MPH2- MPH3 não estão relacionados a esse fenótipo. Ao buscarmos o que poderia promover esse novo fenótipo, análises de microarray indicaram expressão aumentada de <font face=\"Symbol\">&#945-glicosidases e transportadores de hexose durante esse crescimento tardio. Após inocularmos uma linhagem hxt-null agt1 <font face=\"Symbol\">&#916 em maltotriose, detectamos glicose no meio de cultura durante o seu crescimento tardio, indicando que cepas que não contam com o Agt1p na membrana só conseguem crescer tardiamente em maltotriose em virtude da hidrólise extracelular desse açúcar. Por fim, nós demonstramos ainda que a <font face=\"Symbol\">&#945-glicosidase codificada pela ORF YJL216C é responsável por essa hidrólise extracelular da maltotriose, uma vez que a sua deleção tornou as células incapazes de crescer em maltotriose mesmo durante longos períodos de incubação. Assim, nossos resultados indicam que o Agt1p é o único transportador de maltotriose em S. cerevisiae e que o mesmo é necessário para promover eficiente fermentação desse açúcar. Pudemos também concluir que, em sua ausência, as células podem crescer em maltotriose somente se forem capazes de hidrolisá-la extracelularmente. Neste trabalho, discutimos também o poder de indução dos genes MAL pela maltose e pela maltotriose. Analisados em conjunto, nossos resultados sugerem que, embora não haja um indutor mais forte dentre esses açúcares, a atividade de transporte é maior em células crescidas em maltotriose. / Important biotechnological processes depends on the efficient fermentation of starch hydrolysates rich in maltose and maltotriose by Saccharomyces cerevisiae. However, some strains have difficulty to consume maltotriose, which decreases their fermentation efficiency. Although it is believed that maltotriose transport across the plasma membrane is the rate-limiting step for its fermentation, there have been conflicting reports whether all the known <font face=\"Symbol\">&#945-glucoside transporters in S. cerevisiae allow efficient maltotriose utilization by yeast cells. In order to contribute for a better understanding of maltotriose metabolism in S. cerevisiae, we correlated the phenotype of several strains on maltotriose with their respective genotype. For such correlation, we identified which <font face=\"Symbol\">&#945-glucoside transporter genes were present in the strains analyzed and we determined the kinetics of cell growth and ethanol production by each strain on maltotriose, as well as their transport activities. To be sure that those genes were, indeed, expressed, we also evaluated their expression under different growth conditions. After verifying that a constitutive MAL regulator increases the expression of AGT1 gene and improves maltose and maltotriose fermentation, we decided to delete this gene from three laboratorial strains to evaluate the contribution of the Agt1p permease for maltotriose utilization. In spite that the wild-type cells rapidly consumed and efficiently fermented this sugar, the agt1 <font face=\"Symbol\">&#916 strains were unable to transport maltotriose and to utilize this sugar during 3-4 days of incubation. However, after a longer period of incubation (8 days), just one of the agt1 <font face=\"Symbol\">&#916 strains was still unable to grow on maltotriose, while the other two strains presented delayed growth, after an ~100 h lag phase, but did not ferment this sugar. The same long lag phase on maltotriose was also seen in industrial strains which were unable to express their AGT1 gene. Furthermore, QRT-PCR assays demonstrated that MPH2-MPH3 transporters are not related to this phenotype. Seeking for what could promote this novel phenotype, microarray analysis indicated upregulation of <font face=\"Symbol\">&#945-glucosidases and hexose transporters during this delayed growth on maltotriose. After inoculation of an hxt-null agt1 <font face=\"Symbol\">&#916 strain on maltotriose, we detected glucose on the medium during cellular growth, indicating that strains which do not have Agt1p in their plasma membrane are able to grow after a long lag phase on maltotriose only because of extracellular maltotriose hydrolysis. Finally, we also show that the <font face=\"Symbol\">&#945-glucosidase codified by YJL216C is responsible for this delayed extracellular hydrolysis of maltotriose, since after its deletion cells became unable to grow on maltotriose at all. Thus, our results indicate that Agt1p is the only effective maltotriose transporter in S. cerevisiae and that it is required to promote an efficient fermentation of this sugar by yeast cells. We can also conclude that in its absence cells can only grow on maltotriose if they are capable to hydrolyze this sugar outside the cells. In the present work, we also discussed which one, maltose or maltotriose, is the best inducer of MAL genes. Taking together, our results suggest that, although there is no best inducer, <font face=\"Symbol\">&#945-glucoside transport activity is higher in maltotriose grown cells.

Processos biotecnológicos importantes dependem da eficiente fermentação de hidrolisados de amido, ricos em maltose e maltotriose, pela levedura i>Saccharomyces cerevisiae. Entretanto, algumas linhagens apresentam dificuldade para consumir a maltotriose, o que diminui a eficiência fermentativa nesses processos. Embora se acredite que o transporte desse açúcar através da membrana plasmática seja o passo limitante para sua fermentação, existem conflitos na literatura em relação às permeases capazes de transportar a maltotriose. No intuito de melhorar a compreensão do metabolismo desse açúcar em S. cerevisiae, correlacionamos o fenótipo de várias cepas em maltotriose com seus respectivos genótipos. Para isso, identificamos os genes de transportadores de <font face=\"Symbol\">&#945-glicosídeos presentes nas linhagens analisadas e avaliamos o crescimento celular, a produção de etanol e as atividades de transporte por cada cepa. Para confirmar se tais genes eram, de fato, expressos, analisamos a expressão dos mesmos em diferentes condições de cultivo. Após verificarmos que a presença de um regulador constitutivo aumenta a expressão do gene AGT1 e incrementa a fermentação de maltose e maltotriose, deletamos esse gene do genoma de três linhagens de laboratório para avaliar a contribuição da permease Agt1p para a utilização de maltotriose. Embora as linhagens selvagens tenham consumido e fermentado rapidamente esse açúcar, as agt1 <font face=\"Symbol\">&#916 foram incapazes de transportar a maltotriose e de utilizála durante 3-4 dias de incubação. Contudo, após um período de incubação maior (8 dias), apenas uma das linhagens agt1 <font face=\"Symbol\">&#916 continuou incapaz de crescer em maltotriose, enquanto as outras apresentaram crescimento tardio, após ~100 h de fase lag, porém sem produção de etanol. Essa mesma fase lag extensa foi também observada em cepas industriais incapazes de expressar o AGT1. Além disso, através de QRT-PCR vimos que os transportadores MPH2- MPH3 não estão relacionados a esse fenótipo. Ao buscarmos o que poderia promover esse novo fenótipo, análises de microarray indicaram expressão aumentada de <font face=\"Symbol\">&#945-glicosidases e transportadores de hexose durante esse crescimento tardio. Após inocularmos uma linhagem hxt-null agt1 <font face=\"Symbol\">&#916 em maltotriose, detectamos glicose no meio de cultura durante o seu crescimento tardio, indicando que cepas que não contam com o Agt1p na membrana só conseguem crescer tardiamente em maltotriose em virtude da hidrólise extracelular desse açúcar. Por fim, nós demonstramos ainda que a <font face=\"Symbol\">&#945-glicosidase codificada pela ORF YJL216C é responsável por essa hidrólise extracelular da maltotriose, uma vez que a sua deleção tornou as células incapazes de crescer em maltotriose mesmo durante longos períodos de incubação. Assim, nossos resultados indicam que o Agt1p é o único transportador de maltotriose em S. cerevisiae e que o mesmo é necessário para promover eficiente fermentação desse açúcar. Pudemos também concluir que, em sua ausência, as células podem crescer em maltotriose somente se forem capazes de hidrolisá-la extracelularmente. Neste trabalho, discutimos também o poder de indução dos genes MAL pela maltose e pela maltotriose. Analisados em conjunto, nossos resultados sugerem que, embora não haja um indutor mais forte dentre esses açúcares, a atividade de transporte é maior em células crescidas em maltotriose. / Important biotechnological processes depends on the efficient fermentation of starch hydrolysates rich in maltose and maltotriose by Saccharomyces cerevisiae. However, some strains have difficulty to consume maltotriose, which decreases their fermentation efficiency. Although it is believed that maltotriose transport across the plasma membrane is the rate-limiting step for its fermentation, there have been conflicting reports whether all the known <font face=\"Symbol\">&#945-glucoside transporters in S. cerevisiae allow efficient maltotriose utilization by yeast cells. In order to contribute for a better understanding of maltotriose metabolism in S. cerevisiae, we correlated the phenotype of several strains on maltotriose with their respective genotype. For such correlation, we identified which <font face=\"Symbol\">&#945-glucoside transporter genes were present in the strains analyzed and we determined the kinetics of cell growth and ethanol production by each strain on maltotriose, as well as their transport activities. To be sure that those genes were, indeed, expressed, we also evaluated their expression under different growth conditions. After verifying that a constitutive MAL regulator increases the expression of AGT1 gene and improves maltose and maltotriose fermentation, we decided to delete this gene from three laboratorial strains to evaluate the contribution of the Agt1p permease for maltotriose utilization. In spite that the wild-type cells rapidly consumed and efficiently fermented this sugar, the agt1 <font face=\"Symbol\">&#916 strains were unable to transport maltotriose and to utilize this sugar during 3-4 days of incubation. However, after a longer period of incubation (8 days), just one of the agt1 <font face=\"Symbol\">&#916 strains was still unable to grow on maltotriose, while the other two strains presented delayed growth, after an ~100 h lag phase, but did not ferment this sugar. The same long lag phase on maltotriose was also seen in industrial strains which were unable to express their AGT1 gene. Furthermore, QRT-PCR assays demonstrated that MPH2-MPH3 transporters are not related to this phenotype. Seeking for what could promote this novel phenotype, microarray analysis indicated upregulation of <font face=\"Symbol\">&#945-glucosidases and hexose transporters during this delayed growth on maltotriose. After inoculation of an hxt-null agt1 <font face=\"Symbol\">&#916 strain on maltotriose, we detected glucose on the medium during cellular growth, indicating that strains which do not have Agt1p in their plasma membrane are able to grow after a long lag phase on maltotriose only because of extracellular maltotriose hydrolysis. Finally, we also show that the <font face=\"Symbol\">&#945-glucosidase codified by YJL216C is responsible for this delayed extracellular hydrolysis of maltotriose, since after its deletion cells became unable to grow on maltotriose at all. Thus, our results indicate that Agt1p is the only effective maltotriose transporter in S. cerevisiae and that it is required to promote an efficient fermentation of this sugar by yeast cells. We can also conclude that in its absence cells can only grow on maltotriose if they are capable to hydrolyze this sugar outside the cells. In the present work, we also discussed which one, maltose or maltotriose, is the best inducer of MAL genes. Taking together, our results suggest that, although there is no best inducer, <font face=\"Symbol\">&#945-glucoside transport activity is higher in maltotriose grown cells.

O presente trabalho teve por objetivo avaliar o perfil metabólico da utilização dos açúcares por diferentes leveduras (BG-1, CAT-1, FLEISCHMANN, PE-2, 1403-7A e LCM001) em diferentes meios de crescimento e também analisar o comportamento e a atividade de invertase destas leveduras durante um processo fermentativo com reciclos de células, semelhantemente ao processo industrial, levando em consideração os parâmetros: produção de etanol, formação de biomassa, produção de trealose, glicogênio, glicerol, rendimento e eficiência fermentativa. Os experimentos foram divididos em três partes: a 1a foi a quantificação da atividade de invertase das diferentes leveduras, em mosto de fermentação à base de mel e água (13% ART), a 2a analisouse o perfil de metabolização em diferentes meios de crescimento à base de YEP com 2% de açúcares (glicose, sacarose, ou glicose + sacarose), e a 3a foi a realização de uma fermentação alcoólica com 4 reciclos de células, com mosto de mel (13% ART), sendo os três primeiros utilizados para a avaliação do rendimento fermentativo, bem como seus indicadores (trealose, glicogênio, viabilidade, entre outros) e o último, destinado ao perfil de metabolização de açúcares em condições de fermentação. Os resultados mostram que as leveduras possuem diferentes atividades de invertase (BG-1 = 7,34; FLEISCHMANN = 5,75; CAT-1 = 3,76; PE-2 = 2,39 gART.h-1.gbiomassa; 1403-7A e LCM001, não possuem atividade), apresentam diferentes velocidades de hidrólise da sacarose, tanto em meios de crescimento como mostos (BG-1 e FLEISCHMANN = 2 h; CAT-1 = 3h; PE-2 = 4h; 1403-7A = 24 h e LCM001 = >24 h), assim como a velocidade de metabolização dos açúcares presentes nestes. Conclui-se que a atividade de invertase é dependente da linhagem de levedura, assim como a velocidade de metabolização dos açúcares em meios de crescimento e mosto. A análise do perfil de metabolização de açúcares não permite identificar a presença de transportador de sacarose. No geral, as leveduras selecionadas apresentam melhor desempenho fermentativo. Por outro lado, verificou-se que as linhagens com transportador de sacarose apesar da menor produção de álcool, apresentaram uma boa eficiência fermentativa. O maior problema por parte destas últimas, é o alto tempo de fermentação e a baixa taxa de multiplicação, com conseqüente queda na viabilidade celular. / The aim of this work was to evaluate the metabolic profile in the utilization of sugars, using different yeast strains (BG-1, CAT-1, FLEISHMANN, PE-2, 1403-7A and LCM001) with different growth medium and also to analyze behavior and the invertase activities of these yeast strains during fermentative process with recycling, similar to the industrial process. The following parameters were used: ethanol production, biomass formation, trealose production, glycogen, glycerol, ethanol yield and fermentation efficiency. The trials were divided into three parts: First was activity quantification of invertase using different yeast strains, with a mix of molasses and water (13% ART), the second was analyzed the metabolization profile with different growth medium using YEP added 2% of sugars (glucose, sucrose, or glucose + sucrose), and the third it was the alcoholic fermentation with 4 yeast cell recycles, using wort of molasses and juice ( 13 % ART), The first three were utilized to evaluate the fermentation yield and also theirs indicatives (trealose, glycogen, viability within others) and, the last one was performed to study the profile of sugars metabolization in fermentation conditions. The results showed that those yeasts produced different invertase activities (BG-1 = 7,34; FLEISCHMANN = 5,75; CAT-1 = 3,76; PE-2 = 2,39 gART.h-1.gbiomass; 1403-7A and LCM001 did not have invertase activity), different velocity of sucrose hydrolysis, as much as medium growth as worts (BG-1 and FLEISCHANN = 2 h; CAT-1 = 3h; PE-2 = 4h; 1403-7A = 24 h and LCM001 = >24 h), also as the velocity of sugars metabolization present on this medium. It can be concluded that the invertase activity is dependent of yeast strain, as the velocity of sugars metabolization in growth medium and wort. The profile analysis of metabolization of sugars did not allow to identify the presence of sucrose transporter. In general, the selected yeasts present the best fermentation performance. On the other hand, it was observed the strains with sucrose transportation did not show stress. The major problem of these yeasts were the high fermentation time and low propagation rate, and a decrease of the viability.

O presente trabalho teve por objetivo avaliar o perfil metabólico da utilização dos açúcares por diferentes leveduras (BG-1, CAT-1, FLEISCHMANN, PE-2, 1403-7A e LCM001) em diferentes meios de crescimento e também analisar o comportamento e a atividade de invertase destas leveduras durante um processo fermentativo com reciclos de células, semelhantemente ao processo industrial, levando em consideração os parâmetros: produção de etanol, formação de biomassa, produção de trealose, glicogênio, glicerol, rendimento e eficiência fermentativa. Os experimentos foram divididos em três partes: a 1a foi a quantificação da atividade de invertase das diferentes leveduras, em mosto de fermentação à base de mel e água (13% ART), a 2a analisouse o perfil de metabolização em diferentes meios de crescimento à base de YEP com 2% de açúcares (glicose, sacarose, ou glicose + sacarose), e a 3a foi a realização de uma fermentação alcoólica com 4 reciclos de células, com mosto de mel (13% ART), sendo os três primeiros utilizados para a avaliação do rendimento fermentativo, bem como seus indicadores (trealose, glicogênio, viabilidade, entre outros) e o último, destinado ao perfil de metabolização de açúcares em condições de fermentação. Os resultados mostram que as leveduras possuem diferentes atividades de invertase (BG-1 = 7,34; FLEISCHMANN = 5,75; CAT-1 = 3,76; PE-2 = 2,39 gART.h-1.gbiomassa; 1403-7A e LCM001, não possuem atividade), apresentam diferentes velocidades de hidrólise da sacarose, tanto em meios de crescimento como mostos (BG-1 e FLEISCHMANN = 2 h; CAT-1 = 3h; PE-2 = 4h; 1403-7A = 24 h e LCM001 = >24 h), assim como a velocidade de metabolização dos açúcares presentes nestes. Conclui-se que a atividade de invertase é dependente da linhagem de levedura, assim como a velocidade de metabolização dos açúcares em meios de crescimento e mosto. A análise do perfil de metabolização de açúcares não permite identificar a presença de transportador de sacarose. No geral, as leveduras selecionadas apresentam melhor desempenho fermentativo. Por outro lado, verificou-se que as linhagens com transportador de sacarose apesar da menor produção de álcool, apresentaram uma boa eficiência fermentativa. O maior problema por parte destas últimas, é o alto tempo de fermentação e a baixa taxa de multiplicação, com conseqüente queda na viabilidade celular. / The aim of this work was to evaluate the metabolic profile in the utilization of sugars, using different yeast strains (BG-1, CAT-1, FLEISHMANN, PE-2, 1403-7A and LCM001) with different growth medium and also to analyze behavior and the invertase activities of these yeast strains during fermentative process with recycling, similar to the industrial process. The following parameters were used: ethanol production, biomass formation, trealose production, glycogen, glycerol, ethanol yield and fermentation efficiency. The trials were divided into three parts: First was activity quantification of invertase using different yeast strains, with a mix of molasses and water (13% ART), the second was analyzed the metabolization profile with different growth medium using YEP added 2% of sugars (glucose, sucrose, or glucose + sucrose), and the third it was the alcoholic fermentation with 4 yeast cell recycles, using wort of molasses and juice ( 13 % ART), The first three were utilized to evaluate the fermentation yield and also theirs indicatives (trealose, glycogen, viability within others) and, the last one was performed to study the profile of sugars metabolization in fermentation conditions. The results showed that those yeasts produced different invertase activities (BG-1 = 7,34; FLEISCHMANN = 5,75; CAT-1 = 3,76; PE-2 = 2,39 gART.h-1.gbiomass; 1403-7A and LCM001 did not have invertase activity), different velocity of sucrose hydrolysis, as much as medium growth as worts (BG-1 and FLEISCHANN = 2 h; CAT-1 = 3h; PE-2 = 4h; 1403-7A = 24 h and LCM001 = >24 h), also as the velocity of sugars metabolization present on this medium. It can be concluded that the invertase activity is dependent of yeast strain, as the velocity of sugars metabolization in growth medium and wort. The profile analysis of metabolization of sugars did not allow to identify the presence of sucrose transporter. In general, the selected yeasts present the best fermentation performance. On the other hand, it was observed the strains with sucrose transportation did not show stress. The major problem of these yeasts were the high fermentation time and low propagation rate, and a decrease of the viability.