A hipertensão arterial essencial é caracterizada pela elevação crônica da pressão arterial e representa o principal fator de risco para doenças cardiovasculares e renais. O rim participa do controle da pressão arterial e alterações intrínsecas no manuseio renal de sódio desempenham papel importante na patogênese da hipertensão essencial. Os túbulos proximais renais são responsáveis pela reabsorção da maior parte do sódio filtrado nos glomérulos e a maior parte da reabsorção de sódio neste segmento faz-se através da troca de Na+ por H+ em membrana apical, mediada pela isoforma 3 do trocador Na+/H+ (NHE3). Entretanto, os dados existentes referentes à modulação renal do NHE3 em modelos de hipertensão são ainda conflitantes. Este estudo teve como objetivo avaliar as possíveis alterações funcionais do trocador Na+/H+ NHE3 em túbulo proximal renal na linhagem SHR no estágio de préhipertensão (5 semanas) e de hipertensão (14 semanas) e investigar se estas alterações são acompanhadas de alterações na atividade e na expressão da proteína cinase A (PKA) e de proteínas fosfatase-1 (PP1). Por meio de microperfusão estacionária in vivo mediu-se a atividade do NHE3 em túbulo proximal e verificou-se que a reabsorção de bicarbonato foi reduzida em 62 ± 6 % (P < 0,001) na transição do J-SHR para o A-SHR enquanto foi aumentada em 113 ± 10 % (P < 0,001) na transição entre o J-WKY e o A-WKY. A atividade estimulada do NHE3 em J-SHR é decorrente da redistribuição do NHE3 do domínio intermicrovilar (IMV) para o domínio das microvilosidades (MMV) e do baixo nível de fosforilação da serina 552, sítio consenso para a PKA. Por outro lado, durante a fase de hipertensão, a atividade diminuída do NHE3 deve-se à sua redistribuição para o IMV e ao aumento da fosforilação na serina 552. Para testar a hipótese de que os níveis de fosforilação do NHE3 estariam aumentados em túbulo proximal de SHR adulto devido ao aumento da atividade da PKA e/ou à diminuição na atividade da PP1, foram avaliados tanto os níveis de fosforilação quanto a atividade do NHE3 em SHR jovens e adultos em resposta ao 6MB-cAMP (análogo ao cAMP que ativa especificamente a PKA). O JSHR apresentou um aumento tanto nos níveis de fosforilação da serina 552 (179 ± 14 %, P < 0,001) quanto nos de inibição da atividade (65 ± 10 %, P < 0,001) do NHE3 em relação ao J-SHR em resposta ao 6MB-cAMP. Já no A-SHR, a fosforilação da serina 552 aumentou moderadamente (36 ± 4 %, P < 0,01), assim como inibiu moderadamente (23 ± 9 %, P < 0,05) a atividade do NHE3 em resposta ao 6MBcAMP. Adicionalmente, verificou-se que não houve alteração da atividade da PKA entre os animais nem ao longo da idade e nem entre as linhagens. Por sua vez, o JSHR apresentou maior atividade da PP1 que o A-SHR (1640 ± 107 vs. 940 ± 119 pM/?g, P < 0,01). Além disso, houve uma diminuição na expressão da PP1? no ASHR (32 ± 8 %, P < 0,01) quando comparado ao J-SHR. Os dados sugerem que o NHE3 é diferencialmente regulado antes e após o desenvolvimento da hipertensão em SHR por mecanismos que envolvem modificações pós-transcricionais e distribuição subcelular. Além do mais, a regulação diferencial dos níveis de fosforilação do NHE3 tubular proximal antes e após o desenvolvimento da hipertensão em SHR é devida, provavelmente, a alterações na atividade e na expressão da PP1 / Essential hypertension is characterized by chronic elevation of blood pressure and represents the major risk factor for cardiovascular and renal diseases. The kidney participates in the blood pressure control and intrinsic changes in renal sodium handling play an important role in the pathogenesis of essential hypertension. The renal proximal tubule is responsible for reabsorption of the great majority of sodium that is filtered by the glomerulus and the principal apical membrane mechanism for sodium reabsorption in this nephron is Na+/H+ exchanger isoform 3 (NHE3)- mediated Na+/H+ exchange. However, conflicting data have been reported with regard to NHE3 modulation in experimental models of hypertension. This study aimed to evaluate the possible functional changes of the Na+/H+ exchanger NHE3 in the renal proximal tubule of SHR both at the pre-hypertensive (5 weeks) and at hypertensive (14 weeks) stages and to investigate whether these changes were accompanied by changes in the activity and/or expression of protein kinase A (PKA) and protein phosphatase 1 (PP1). Proximal tubule NHE3 activity was measured by means of stationary microperfusion. Bicarbonate reabsorption was found to be decreased by 62 ± 6 % (P < 0.001) in the transition from youth to adulthood in SHR (Y-SHR to A-SHR), whereas in the transition from Y-WKY to A-WKY it increased by 113 ± 10 % (P < 0.001). Stimulated NHE3 activity in Y-SHR was due to redistribution of NHE3 from intermicrovilar domain (IMV) to microvilar domain (MMV) and to a lower level of serine 552 phosphorylation, a consensus site for PKA. Conversely, during the hypertensive stage, decreased NHE3 activity was due to increased redistribution of NHE3 to the IMV domain and increased phosphorylation at serine 552. To test the hypothesis that the increased levels of NHE3 phosphorylation in the proximal tubule of adult SHR were due to increased PKA activity and/or decreased PP1 activity, it was evaluated both phosphorylation levels and activity of NHE3 in young and adult SHR in response to 6MB-cAMP (an cAMP analog that specifically activates PKA). Y-SHR showed an increase both in the phosphorylation levels at serine 552 (179 ± 14 %, P < 0.001) and in the inhibition of NHE3 transport activity (65 ± 10 %, P < 0.001) compared to Y-SHR in response to 6MB-cAMP. With respect to A-SHR, the phosphorylation of serine 552 was slightly increased (36 ± 4 %, P < 0.01) and NHE3 activity was mildly inhibited (23 ± 9 %, P < 0.05) in response to 6MB-cAMP. Additionally, PKA activity remained unchanged with both age and strain. Nevertheless, Y-SHR exhibited higher PP1 activity than A-SHR (1640 ± 107 vs. 940 ± 119 pM/?g, P < 0.01). Furthermore, PP1? expression was decreased in the renal cortex of A-SHR (32 ± 8 %, P < 0.01) compared to Y-SHR. Taken together, these data suggest that NHE3 is differentially regulated before and after development of hypertension in SHR by mechanisms involving post-translational modifications and subcellular distribution. Moreover, the differential regulation of proximal tubule NHE3 phosphorylation levels before and after development of hypertension in SHR is most likely due to changes on the activity and expression of PP1

A acromegalia é doença insidiosa e desfigurante caracterizada por um crescimento desproporcional dos ossos das mãos, pés e do crânio devido à exposição crônica a altos níveis de hormônio de crescimento (GH) e de seu efetor insuline growth factor 1 (IGF-1). Trata-se de uma doença rara, com incidência estimada de 3-4 casos por milhão, com prevalência de aproximadamente 50 casos por milhão de pessoas. A principal causa da acromegalia é a presença de um tumor hipofisário secretor de GH (somatotropinoma). Caso o somatotropinoma ocorra durante a infância ou adolescência, antes do fechamento das epífises dos ossos longos, a criança crescerá longitudinalmente de forma descontrolada, caracterizando a forma clínica gigantismo. Na grande maioria dos casos a acromegalia se apresenta na forma esporádica, entretanto casos familiais da doença podem ocorrer associados à Neoplasia Endócrina Múltipla tipo 1 (NEM-1), ao complexo de Carney (CNC) e à acromegalia familial isolada (IFS). Os genes responsáveis pela NEM-1 (MEN1) e CNC (PRKAR1A) foram clonados há mais 10 anos, entretanto etiologia molecular da IFS permaneceu desconhecida até recentemente. Vierimaa et al. (2006) combinaram estudos de ligação por análise de polimorfismos e estudos de expressão gênica e identificaram mutações no gene AIP em famílias com acromegalia não-NEM-1 e não-CNC; além de perda de heterozigose (LOH) nos somatotropinomas dos pacientes com mutação AIP. No presente estudo, investigamos o gene AIP em três famílias brasileiras com IFS e em seus tumores (hipofisários e não-hipofisários). Descrevemos uma nova mutação AIP (Y268X) em uma família brasileira com IFS, confirmando o papel desse novo gene na predisposição a tumores hipofisários. A partir de dados gerados em uma extensa revisão da literatura, sugerimos que os tumores hipofisários familiais isolados são doenças multigênicas que possuiriam um gene principal, mas que sofreriam influência de outros genes/loci ainda pouco caracterizados. Assim, investigamos também o envolvimento de diversos genes/loci candidatos (SSTR2, SSTR5, CDKN1B, AHR, PRKAR1A, PTTG, PROP1, MEG3, RB1 e 2p16) como possíveis moduladores do fenótipo na IFS. Nossos dados sugerem que além da mutação AIP, há necessidade da co-segregação de marcadores localizados em regiões com potencial oncogênico para o desenvolvimento da doença hipofisária. Também apresentamos nesta Tese as primeiras análises de tumores nãohipofisários em pacientes com mutação AIP e encontramos evidências do possível envolvimento de AIP na tumorigênese de um carcinoma funcionante do córtex adrenal de paciente com IFS. / Acromegaly is a rare disfigurating and insidious disease characterized by enlargement of hands, feet and skull bones due to excess of growth hormone (GH) secreted by a pituitary tumor (somatotropinoma). The majority of the cases with acromegaly is sporadic, however it may occur in association with inherited disorders as Multiple Endocrine Neoplasia type 1 (MEN1), Carney complex (CNC) and Isolated Familial Somatotropinoma (IFS). The genes associated with MEN1 syndrome (MEN1) and CNC (PRKAR1A) have been described more than a decade ago, however until very recently the molecular etiology of IFS remained unknown. Using a combined strategy of single nucleotide polymorphism (SNP) analysis and gene expression analysis, Vierimaa et al. (2006) described mutations in the AIP gene occurring in families with acromegaly not associated with MEN1 and CNC. In the current study, we investigated three Brazilian families with IFS and were able to describe two germline mutations in the AIP gene, confirming the role of this new gene in the predisposition to familial somatotropinoma. We revised the literature of genetic studies of isolated pituitary adenoma syndromes, which indicated a genetic heterogeneity as well as possible multigenic inheritance for these diseases. Thus, we investigated the role of several genes/loci (SSTR2, SSTR5, CDKN1B, AHR, PRKAR1A, PTTG, PROP1, MEG3, RB1 and 2p16) selected as potentially acting as phenotypic modulators in IFS. Our data indicate that AIP-mutated patients are prone to pituitary disease, however it is necessary the co-segregation of markers located at oncogenic regions to the development of the pituitary tumors and manifestation of the disease. Herein, we also present the first somatic analysis of non-pituitary tumors of AIP-mutated patients. A potential role of AIP, which is implicated in the cAMP pathway, could not be excluded in the development of an adrenocortical carcinoma.

A hipertensão arterial essencial é caracterizada pela elevação crônica da pressão arterial e representa o principal fator de risco para doenças cardiovasculares e renais. O rim participa do controle da pressão arterial e alterações intrínsecas no manuseio renal de sódio desempenham papel importante na patogênese da hipertensão essencial. Os túbulos proximais renais são responsáveis pela reabsorção da maior parte do sódio filtrado nos glomérulos e a maior parte da reabsorção de sódio neste segmento faz-se através da troca de Na+ por H+ em membrana apical, mediada pela isoforma 3 do trocador Na+/H+ (NHE3). Entretanto, os dados existentes referentes à modulação renal do NHE3 em modelos de hipertensão são ainda conflitantes. Este estudo teve como objetivo avaliar as possíveis alterações funcionais do trocador Na+/H+ NHE3 em túbulo proximal renal na linhagem SHR no estágio de préhipertensão (5 semanas) e de hipertensão (14 semanas) e investigar se estas alterações são acompanhadas de alterações na atividade e na expressão da proteína cinase A (PKA) e de proteínas fosfatase-1 (PP1). Por meio de microperfusão estacionária in vivo mediu-se a atividade do NHE3 em túbulo proximal e verificou-se que a reabsorção de bicarbonato foi reduzida em 62 ± 6 % (P < 0,001) na transição do J-SHR para o A-SHR enquanto foi aumentada em 113 ± 10 % (P < 0,001) na transição entre o J-WKY e o A-WKY. A atividade estimulada do NHE3 em J-SHR é decorrente da redistribuição do NHE3 do domínio intermicrovilar (IMV) para o domínio das microvilosidades (MMV) e do baixo nível de fosforilação da serina 552, sítio consenso para a PKA. Por outro lado, durante a fase de hipertensão, a atividade diminuída do NHE3 deve-se à sua redistribuição para o IMV e ao aumento da fosforilação na serina 552. Para testar a hipótese de que os níveis de fosforilação do NHE3 estariam aumentados em túbulo proximal de SHR adulto devido ao aumento da atividade da PKA e/ou à diminuição na atividade da PP1, foram avaliados tanto os níveis de fosforilação quanto a atividade do NHE3 em SHR jovens e adultos em resposta ao 6MB-cAMP (análogo ao cAMP que ativa especificamente a PKA). O JSHR apresentou um aumento tanto nos níveis de fosforilação da serina 552 (179 ± 14 %, P < 0,001) quanto nos de inibição da atividade (65 ± 10 %, P < 0,001) do NHE3 em relação ao J-SHR em resposta ao 6MB-cAMP. Já no A-SHR, a fosforilação da serina 552 aumentou moderadamente (36 ± 4 %, P < 0,01), assim como inibiu moderadamente (23 ± 9 %, P < 0,05) a atividade do NHE3 em resposta ao 6MBcAMP. Adicionalmente, verificou-se que não houve alteração da atividade da PKA entre os animais nem ao longo da idade e nem entre as linhagens. Por sua vez, o JSHR apresentou maior atividade da PP1 que o A-SHR (1640 ± 107 vs. 940 ± 119 pM/?g, P < 0,01). Além disso, houve uma diminuição na expressão da PP1? no ASHR (32 ± 8 %, P < 0,01) quando comparado ao J-SHR. Os dados sugerem que o NHE3 é diferencialmente regulado antes e após o desenvolvimento da hipertensão em SHR por mecanismos que envolvem modificações pós-transcricionais e distribuição subcelular. Além do mais, a regulação diferencial dos níveis de fosforilação do NHE3 tubular proximal antes e após o desenvolvimento da hipertensão em SHR é devida, provavelmente, a alterações na atividade e na expressão da PP1 / Essential hypertension is characterized by chronic elevation of blood pressure and represents the major risk factor for cardiovascular and renal diseases. The kidney participates in the blood pressure control and intrinsic changes in renal sodium handling play an important role in the pathogenesis of essential hypertension. The renal proximal tubule is responsible for reabsorption of the great majority of sodium that is filtered by the glomerulus and the principal apical membrane mechanism for sodium reabsorption in this nephron is Na+/H+ exchanger isoform 3 (NHE3)- mediated Na+/H+ exchange. However, conflicting data have been reported with regard to NHE3 modulation in experimental models of hypertension. This study aimed to evaluate the possible functional changes of the Na+/H+ exchanger NHE3 in the renal proximal tubule of SHR both at the pre-hypertensive (5 weeks) and at hypertensive (14 weeks) stages and to investigate whether these changes were accompanied by changes in the activity and/or expression of protein kinase A (PKA) and protein phosphatase 1 (PP1). Proximal tubule NHE3 activity was measured by means of stationary microperfusion. Bicarbonate reabsorption was found to be decreased by 62 ± 6 % (P < 0.001) in the transition from youth to adulthood in SHR (Y-SHR to A-SHR), whereas in the transition from Y-WKY to A-WKY it increased by 113 ± 10 % (P < 0.001). Stimulated NHE3 activity in Y-SHR was due to redistribution of NHE3 from intermicrovilar domain (IMV) to microvilar domain (MMV) and to a lower level of serine 552 phosphorylation, a consensus site for PKA. Conversely, during the hypertensive stage, decreased NHE3 activity was due to increased redistribution of NHE3 to the IMV domain and increased phosphorylation at serine 552. To test the hypothesis that the increased levels of NHE3 phosphorylation in the proximal tubule of adult SHR were due to increased PKA activity and/or decreased PP1 activity, it was evaluated both phosphorylation levels and activity of NHE3 in young and adult SHR in response to 6MB-cAMP (an cAMP analog that specifically activates PKA). Y-SHR showed an increase both in the phosphorylation levels at serine 552 (179 ± 14 %, P < 0.001) and in the inhibition of NHE3 transport activity (65 ± 10 %, P < 0.001) compared to Y-SHR in response to 6MB-cAMP. With respect to A-SHR, the phosphorylation of serine 552 was slightly increased (36 ± 4 %, P < 0.01) and NHE3 activity was mildly inhibited (23 ± 9 %, P < 0.05) in response to 6MB-cAMP. Additionally, PKA activity remained unchanged with both age and strain. Nevertheless, Y-SHR exhibited higher PP1 activity than A-SHR (1640 ± 107 vs. 940 ± 119 pM/?g, P < 0.01). Furthermore, PP1? expression was decreased in the renal cortex of A-SHR (32 ± 8 %, P < 0.01) compared to Y-SHR. Taken together, these data suggest that NHE3 is differentially regulated before and after development of hypertension in SHR by mechanisms involving post-translational modifications and subcellular distribution. Moreover, the differential regulation of proximal tubule NHE3 phosphorylation levels before and after development of hypertension in SHR is most likely due to changes on the activity and expression of PP1

O objetivo deste estudo foi caracterizar a influência da melatonina sobre a atividade de colinoceptores nicotínicos em miotubos de rato em cultura e determinar seu mecanismo de ação. Neste modelo verificamos que a melatonina reduz a densidade de sítios de ligação para ?-bungarotoxina e também a produção de AMP cíclico induzida por forscolina, adenosina e CGRP, mas não por isoprenalina. Estes efeitos foram mimetizados por N-acetilserotonina e 4-P-PDOT, mas não por 2-Iodo-melatonina e 5-MCA-NAT, e foram bloqueados por luzindol. A redução da produção de AMP cíclico não foi inibida por toxina pertussis. O calmidazolium bloqueia tanto a redução da densidade dos colinoceptores nicotínicos quanto a inibição da produção de AMP cíclico. Avaliando a via da guanilil ciclase determinamos que melatonina e calmidazolium inibem a produção de GMP cíclico induzida por KCl. Podemos concluir que a melatonina não está atuando via receptores de membrana, mas provavelmente, está atuando internamente bloqueando a enzima calmodulina. / The objective of this study was characterize the influence of melatonin on the nicotinic-colinoceptors activity in myotube culture from rats and seeks its action mechanism. In this model we demonstrated that melatonin decreases the binding-sites density to ?-bungarotoxin and cyclic AMP synthesis induced by forskolin, adenosine and CGRP, but not by isoprenaline. These effects were mimetized by N-acetylserotonin and 4-P-PDOT, but not by 2-iodomelatonin and 5-MCA-NAT and were blocked by luzindol. Reduction of the cyclic AMP synthesis was not inhibited by pertussis toxin. Calmidazolium blocked both the reduction of nicotinic colinoceptors density and the inhibition of AMP cyclic synthesis. After evaluate the guanylyl cyclase via, we determined that melatonin and calmidazolium inhibit the cyclic GMP synthesis induced by KCl. Then we concluded that melatonin does not act via membrane receptors, but probably, acts blocking the calmodulin enzyme.

A acromegalia é doença insidiosa e desfigurante caracterizada por um crescimento desproporcional dos ossos das mãos, pés e do crânio devido à exposição crônica a altos níveis de hormônio de crescimento (GH) e de seu efetor insuline growth factor 1 (IGF-1). Trata-se de uma doença rara, com incidência estimada de 3-4 casos por milhão, com prevalência de aproximadamente 50 casos por milhão de pessoas. A principal causa da acromegalia é a presença de um tumor hipofisário secretor de GH (somatotropinoma). Caso o somatotropinoma ocorra durante a infância ou adolescência, antes do fechamento das epífises dos ossos longos, a criança crescerá longitudinalmente de forma descontrolada, caracterizando a forma clínica gigantismo. Na grande maioria dos casos a acromegalia se apresenta na forma esporádica, entretanto casos familiais da doença podem ocorrer associados à Neoplasia Endócrina Múltipla tipo 1 (NEM-1), ao complexo de Carney (CNC) e à acromegalia familial isolada (IFS). Os genes responsáveis pela NEM-1 (MEN1) e CNC (PRKAR1A) foram clonados há mais 10 anos, entretanto etiologia molecular da IFS permaneceu desconhecida até recentemente. Vierimaa et al. (2006) combinaram estudos de ligação por análise de polimorfismos e estudos de expressão gênica e identificaram mutações no gene AIP em famílias com acromegalia não-NEM-1 e não-CNC; além de perda de heterozigose (LOH) nos somatotropinomas dos pacientes com mutação AIP. No presente estudo, investigamos o gene AIP em três famílias brasileiras com IFS e em seus tumores (hipofisários e não-hipofisários). Descrevemos uma nova mutação AIP (Y268X) em uma família brasileira com IFS, confirmando o papel desse novo gene na predisposição a tumores hipofisários. A partir de dados gerados em uma extensa revisão da literatura, sugerimos que os tumores hipofisários familiais isolados são doenças multigênicas que possuiriam um gene principal, mas que sofreriam influência de outros genes/loci ainda pouco caracterizados. Assim, investigamos também o envolvimento de diversos genes/loci candidatos (SSTR2, SSTR5, CDKN1B, AHR, PRKAR1A, PTTG, PROP1, MEG3, RB1 e 2p16) como possíveis moduladores do fenótipo na IFS. Nossos dados sugerem que além da mutação AIP, há necessidade da co-segregação de marcadores localizados em regiões com potencial oncogênico para o desenvolvimento da doença hipofisária. Também apresentamos nesta Tese as primeiras análises de tumores nãohipofisários em pacientes com mutação AIP e encontramos evidências do possível envolvimento de AIP na tumorigênese de um carcinoma funcionante do córtex adrenal de paciente com IFS. / Acromegaly is a rare disfigurating and insidious disease characterized by enlargement of hands, feet and skull bones due to excess of growth hormone (GH) secreted by a pituitary tumor (somatotropinoma). The majority of the cases with acromegaly is sporadic, however it may occur in association with inherited disorders as Multiple Endocrine Neoplasia type 1 (MEN1), Carney complex (CNC) and Isolated Familial Somatotropinoma (IFS). The genes associated with MEN1 syndrome (MEN1) and CNC (PRKAR1A) have been described more than a decade ago, however until very recently the molecular etiology of IFS remained unknown. Using a combined strategy of single nucleotide polymorphism (SNP) analysis and gene expression analysis, Vierimaa et al. (2006) described mutations in the AIP gene occurring in families with acromegaly not associated with MEN1 and CNC. In the current study, we investigated three Brazilian families with IFS and were able to describe two germline mutations in the AIP gene, confirming the role of this new gene in the predisposition to familial somatotropinoma. We revised the literature of genetic studies of isolated pituitary adenoma syndromes, which indicated a genetic heterogeneity as well as possible multigenic inheritance for these diseases. Thus, we investigated the role of several genes/loci (SSTR2, SSTR5, CDKN1B, AHR, PRKAR1A, PTTG, PROP1, MEG3, RB1 and 2p16) selected as potentially acting as phenotypic modulators in IFS. Our data indicate that AIP-mutated patients are prone to pituitary disease, however it is necessary the co-segregation of markers located at oncogenic regions to the development of the pituitary tumors and manifestation of the disease. Herein, we also present the first somatic analysis of non-pituitary tumors of AIP-mutated patients. A potential role of AIP, which is implicated in the cAMP pathway, could not be excluded in the development of an adrenocortical carcinoma.

Os pacientes que usam lítio (Li) para tratamento do transtorno bipolar frequentemente apresentam poliúria e deficiência de concentração urinária, sintomas do Diabetes Insipidus Nefrogênico (DIN). Animais tratados com Li apresentam baixos níveis de produção de adenosina monofosfato cíclico (AMPc) em resposta ao hormônio antidiurético (HAD). O Sildenafil (Sil), um inibidor da fosfodiesterase 5 (PDE5), eleva os níveis intracelulares de guanosina monofosfato cíclico (GMPc), levando a inserção de aquaporina 2 (AQP2) na membrana plasmática das células do ducto coletor. Portanto, inibidores de PDE podem promover a inserção de AQP2 na membrana plasmática mesmo sem a ativação do receptor de HAD, indicando a participação de uma via alternativa mediada pelo GMPc. Nós investigamos as vias de ação do Sil no tratamento da DIN induzida pelo Li. Ratos Wistar foram divididos nos seguintes grupos: grupo controle, recebendo dieta alimentar normal durante quatro semanas; grupo Li, recebendo dieta alimentar normal com 40 mmol Li por quilo de dieta durante quatro semanas; grupo Li + Sil, recebendo dieta alimentar normal com 40 mmol Li por quilo de dieta durante quatro semanas e 200 mg por quilo de dieta de Sil a partir da segunda semana; grupo Sil, recebendo dieta alimentar normal durante a primeira semana e a partir da segunda semana recebendo dieta normal com 200 mg de Sil por quilo de dieta. Os animais do grupo Li desenvolveram poliúria, diminuição da osmolalidade urinária e diminuição da expressão da AQP2 tanto na fração citoplasmática como de membrana celular e o Sil reverteu essas alterações. Demonstramos ainda que a concentração de GMPc intracelular estava aumentada nos túbulos papilares tratados com Sil. Observamos que a provável via de fosforilação da AQP2 induzida pelo GMPc é pela PKA. Além disso, o tratamento com Sil aumenta a expressão de pCreb, fator de transcrição para ativação do gene da AQP2. Observamos ainda que o Li diminui a expressão de eNOS e o tratamento com Sil normaliza essa diminuição. Assim, concluímos que o tratamento com Sil em ratos com DIN melhora a poliúria aumentando a produção e a inserção de AQP2. O tratamento com Sil pode ser benéfico para pacientes que sofrem com DIN induzido pelo Li / Patients taking lithium to treat bipolar disorder often present polyuria and urinary concentrating defect. In addition, lithium-treated animals present lower cyclic adenosine monophosphate production in response to vasopressin. Sildenafil (Sil), a phosphodiesterase 5 (PDE5) inhibitor, elevates intracellular cyclic guanosine monophosphate (cGMP) levels, leading to plasma membrane accumulation of aquaporin 2 (AQP2). Therefore, PDE inhibitors might induce AQP2 membrane insertion even without vasopressin receptor activation by activating a parallel cGMP-mediated signal transduction pathway. We investigated Sil pathways of action in rats with lithium-induced nephrogenic Diabetes Insipidus (NDI). Wistar rats received lithium (40 mmol/kg food) or not for 4 weeks (Li or control), some rats also receiving sildenafil (200 mg/kg food) in weeks 2-4, with or without lithium (Li+Sil orSil). Animals in Li group developed polyuria, decreased urinary osmolality and decreased expression of AQP2 in both the cytoplasmic fraction and the cell membrane and Sil reversed these changes. We also demonstrated that intracellular cGMP concentration was increased in papillary tubules treated with Sil. We found that PKA may be involved in the pathway of cGMP induced AQP2 phosphorylation. In addition, Sil treatment increases Creb phosphorylation. Creb phosphorylation, acts as AQP2 gene transcription factor. We also observed that Li decreases eNOS expression and treatment with Sil normalizes this alteration. We conclude that Sil treatment improves polyuria by increasing production and insertion of AQP2. Sil treatment may be beneficial to patients suffering from induced DIN Li

A isoforma 3 do trocador Na+ /H+ (NHE3), presente em membrana apical, é a proteína de transporte que medeia a maior parte da reabsorção de NaCl e NaHCO3- em túbulo proximal renal. A fosforilação direta do NHE3 por PKA na serina 552 é um dos mecanismos pelos quais a sua atividade pode ser inibida. A ligação da angiotensina II (Ang II) ao receptor AT1 (AT1R) em túbulo proximal estimula a atividade do NHE3 por diferentes vias de sinalização. Entretanto, não foram ainda bem estabelecidos os efeitos da ativação da via AT1R/Gi, com consequente diminuição nos níveis de cAMP, na regulação do NHE3. A Ang II pode ainda estimular a atividade do NHE3 por promover a sua translocação da base para o corpo das microvilosidades, entretanto, o papel da proteína motora miosina IIA nesta translocação em resposta à Ang II ainda não foi estabelecido. Sendo assim esta tese teve como objetivos: (1) testar a hipótese de que a Ang II diminui os níveis de fosforilação do NHE3 mediados pelo cAMP/PKA na serina 552 aumentando a sua atividade por reduzir os níveis de cAMP e (2) testar a hipótese de que a miosina IIA participa da redistribuição do NHE3 da base para o corpo das microvilosidades em túbulo proximal renal em condições de estímulo da reabsorção de sódio, como ocorre em resposta à Ang II. Visando avaliar os efeitos da ativação da via AT1R/Gi na regulação do NHE3, verificamos, por meio da técnica de recuperação do pH dependente de Na+, que, em condições basais, a Ang II estimulou a atividade do NHE3, mas não alterou a atividade da PKA e nem afetou os níveis de fosforilação do NHE3 na serina 552 em uma linhagem de células de túbulo proximal (OKP). Entretanto, na presença da forskolin (FSK), agente que eleva os níveis intracelulares de cAMP, a Ang II foi capaz de contrapor-se ao efeito inibitório da FSK sobre o NHE3 por promover redução na concentração de cAMP, diminuição da atividade da PKA e, consequentemente, diminuição nos níveis de fosforilação da serina 552. Todos os efeitos da Ang II foram bloqueados quando um pré-tratamento com Losartan, antagonista do receptor AT1, foi feito nas células OKP, destacando a contribuição da via AT1R/proteína Gi no aumento da atividade do NHE3 pela Ang II. Observamos que a inibição da proteína Gi com PTX (toxina pertussis) diminuiu a atividade do NHE3 em células OKP e que a PTX diminuiu a atividade do NHE3 assim como preveniu o efeito estimulatório da Ang II sobre a atividade do NHE3 em túbulo proximal de ratos Wistar. Adicionalmente, com a intenção de avaliar os efeitos da miosina IIA na redistribuição do NHE3, constatamos que a blebistatina, inibidor da miosina IIA, preveniu completamente o aumento de atividade do NHE3 mediado pela Ang II em ratos Wistar e que o uso da blebistatina foi capaz de prevenir o aumento do NHE3 na superfície de células OKP tratadas com Ang II. Em conjunto, nossos resultados sugerem que a Ang II contrapõe-se aos efeitos do cAMP/PKA sobre a fosforilação e a atividade do NHE3 pela ativação da via AT1R/Gi e que a miosina IIA desempenha um papel na mediação da regulação da atividade do NHE3 em túbulo proximal renal de ratos em resposta à Ang II. Sugerem ainda que a desfosforilação do NHE3 na serina 552 pode representar um evento chave na regulação do manuseio de sal tubular proximal pela Ang II na presença de hormônios natriuréticos que promovem o aumento dos níveis de cAMP e da fosforilação do transportador e que a miosina IIA está envolvida na regulação do tráfego do NHE3 em túbulo proximal renal / The Na+/H+ exchanger isoform 3 (NHE3), expressed on the apical membrane, is responsible for most NaCl and NaHCO3 - reabsorption in the renal proximal tubule. Direct phosphorylation of NHE3 by PKA at serine 552 is one of the mechanisms by which its activity is inhibited. Binding of angiotensin II (Ang II) to the AT1 receptor (AT1R) in the proximal tubule stimulates NHE3 activity through multiple signaling pathways. However, the effects of AT1R/Gi activation and subsequent decrease in cAMP accumulation on NHE3 regulation are not well established. Ang II can also stimulate NHE3 activity by promoting its translocations from the base to the body of the microvilli, however, the role of the myosin IIA motor protein in this translocation in response to Ang II is not yet established. Therefore, the aims of this thesis are: (1) to test the hypothesis that Ang II decreases the cAMP/PKA-mediated NHE3 phosphorylation levels at serine 552 increasing its activity by reducing cAMP levels and (2) to test the hypothesis that myosin IIA participates in the NHE3 redistribution from the base to the body of the microvilli in the renal proximal tubule under conditions in which sodium reabsorption is stimulated, such as in response to Ang II. In order to evaluate the effects of AT1R/Gi pathway activation on NHE3 regulation, by means the intracellular pH recovery technique, we verified that under basal conditions, Ang II stimulated NHE3 activity but did not affect PKA-mediated NHE3 phosphorylation at serine 552 in opossum kidney (OKP) cells. However, in the presence of the cAMP-elevating agent forskolin (FSK), Ang II counteracted FSK-induced NHE3 inhibition, reduced intracellular cAMP concentrations, lowered PKA activity, and prevented the FSK-mediated increase in NHE3 serine 552 phosphorylation. All effects of Ang II were blocked by pretreating OKP cells with the AT1R antagonist Losartan, highlighting the contribution of the AT1R/Gi pathway in Ang II-mediated NHE3 upregulation under cAMP-elevating conditions. We also verified that Gi protein inhibition by pertussis toxin treatment decreased NHE3 activity both in vitro and in vivo and, more importantly, prevented the stimulatory effect of Ang II on NHE3 activity in Wistar rat proximal tubules. Additionally, we assessed the effects of myosin IIA on NHE3 redistribution, and found that blebbistatin, a myosin IIA inhibitor, completely prevented the increase of Ang II-mediated NHE3 activity in Wistar rats and that blebbistatin was able to prevent the increase of NHE3 on the Ang II-treated OKP cells surface. Collectively, our results suggest that Ang II counteracts the effects of cAMP/PKA on NHE3 phosphorylation and inhibition by activating the AT1R/Gi pathway and that myosin IIA plays a role in mediating the NHE3 activity regulation in the rat renal proximal tubule in response to Ang II. Furthermore, these findings support the notion that NHE3 dephosphorylation at serine 552 may represent a key event in the regulation of renal proximal tubule sodium handling by Ang II in the presence of natriuretic hormones that promote cAMP accumulation and transporter phosphorylation, and that myosin IIA is involved in NHE3 trafficking regulation in the renal proximal tubule

Foram estudadas as enzimas implicadas no metabolismo de cAMP, bem como as variações na concentração deste nucleotídeo cíclico e na atividade de adenilato ciclase durante o ciclo biológico de B. emersonii. Demonstrou-se que os zoósporos contêm enzimas específicas e distintas para a hidrólise de cAMP e cGMP. Existe apenas uma espécie molecular da cAMP fosfodiesterase, que hidrolisa cAMP a 5\'-AMP com um Km aparente de 2-4 &#181;M; a presença de cGMP nas misturas de reação, não altera as propriedades cinéticas da enzima. A adenilato ciclase de B. emersonii é uma enzima particulada, provavelmente ligada à membrana plasmática do zoósporo, que exige especificamente Mn2+ para sua atividade. A enzima não é ativada por NaF, catecolaminas ou outros compostos de estrutura semelhante. O estudo das propriedades cinéticas da adenilato ciclase sugere um modelo simples no qual o verdadeiro substrato da enzima é o complexo MnATP2- e tanto ATP corno Mn2+ , nas suas formas livres, competem com o complexo pelo sítio catalítico da enzima, que apresenta uma afinidade maior pelas formas livres do que pelo complexo MnATP2-. A atividade especifica da adenilato ciclase, determinada durante o ciclo biológico do fungo, mostra-se elevada nos zoósporos, cai lentamente durante a germinação e permanece baixa em todo o período de crescimento, só voltando a apresentar um aumento na atividade após a indução da esporulação. Quando este processo e induzido na presença de cicloheximida, a atividade permanece baixa, sugerindo que a enzima é sintetizada \"de novo\" nesta fase do ciclo evolutivo. A concentração intracelular de cAMP foi também determinada nas várias fases do ciclo biológico de B. emersonii. No zoósporo encontrou-se um valor médio de 33 pmoles cAMP/mg proteína. Durante a germinação, os níveis de cAMP aumentam, atingindo um máximo (~ 100 pmoles/mg proteína)quando a quase totalidade dos zoósporos se transformou em esferócitos. A partir daí observou-se um declínio gradual nos níveis de cAMP, que permanecem baixos durante toda a fase de crescimento, voltando a elevar-se na fase final da esporulação até alcançar o nível de zoósporo. O grande aumento na concentração intracelular de cAMP na fase de esferócitos é parcialmente explicado pela predominância da atividade de adenilato ciclase sobre a atividade de cAMP fosfodiesterase neste período; a possibilidade de uma ativação \"in vivo\" da adenilato ciclase, neste estágio do ciclo, não pode ser excluída. A queda nos níveis de cAMP que ocorre na passagem de esferócito a gérmen, numa fase onde a atividade de cAMP fosfodiesterase já e muito baixa, é devido principalmente a excreção deste nucleotídio cíclico para o meio extracelular. O grande aumento nos níveis de cAMP durante a transição de zoósporo a esferócito pode estar relacionado com a ativação metabólica ocorrendo nesta fase e pode também refletir uma característica de sistemas em diferenciação, isto é, a necessidade de altos níveis de cAMP para a transição entre dois estados celulares diferenciados. / The enzymes involved in the metabolism of cAMP have been studied, as well as the fluctuations in the concentration of this cyclic nucleotide and in the adenylate cyclase activity during the life cycle of B. emersonii. Zoospores were shown to contain independent specific enzymes involved in the hydrolysis of cAMP and cGMP. A single molecular species was found for the cAMP phosphodiesterase activity, which catalyses the hydrolysis of cAMP to 5\'-AMP. This enzyme displays normal Michaelis kinetics with an apparent Km of 2-4 &#181;M; the addition of cGMP to the reaction mixtures does not modify the kinetic properties of the enzyme. Adenylate cyclase activity in B. emersonii is associated with particulate subcellular fractions, most probably bound to the zoospore plasma membrane. The activity requires Mn2+ and it is not activated by NaF, cathecolamines or other related compounds. The enzyme substrate is the MnATP2- complex and the kinetic data obtained studying the adenylate cyclase activity can be explained by a simple model where free ATP and Mn2+ compete with MnATP2- for the catalytic site of the enzyme, the affinity for MnATP2- being lower than for free Mn2+ and ATP. The specific activity of adenylate cyclase has been determined throughout the fungus life cycle. The enzyme activity is high in zoospores, falls slowly during germination remaining low at the growth phase and rising again during the later stage of sporulation. When this process is induced in the presence of cycloheximide, there is no increase in adenylate cyclase activity, suggesting that \"de novo\" synthesis of the enzyme occurs at this stage. Fluctuations in the intracellular levels of cAMP during the cell cycle of B. emersonii have also been shown. Zoospores contain an average concentration of 33 pmoles cAMP/mg protein. During germination, a significant increase in the cAMP levels is observed, reaching a maximum (ca. 100 pmoles/mg protein) when the majority of the zoospores have changed into round cells. From then on a gradual decline in the cAMP levels is observed. During the growth phase the cAMP contents of the cells remain low, increasing again late in the sporulation stage. The large increase in the intracellular concentration of cAMP in the round cell phase is partially explained by the predominance of adenylate cyclase activity over cAMP phosphodiesterase activity (during this stage); the possibility of an \"in vivo\" activation of the adenylate cyclase during this period, however, cannot be excluded. The decrease in the cAMP levels occurring during the passage of round cells to germlings, in a stage where cAMP phosphodiesterase activity is negligible, is mainly due to the excretion of this cyclic nucleotide to the extracellular medium. The rise in cAMP contents during encystment might be related to the activation of metabolism occurring in this phase and may also reflect a characteristic of differentiating systems, that is, high cAMP levels being necessary for a differentiative transition.