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Daniel R Frederick

The top quark plays an important role in current particle physics, from a theoretical point of view because of its uniquely large mass, but also experimentally because of the large number of top events recorded by the LHC experiments ATLAS and CMS, which makes it possible to directly measure the properties of this particle, for example its couplings to the other particles of the standard model (SM), with previously unknown precision. In this thesis, an effective field theory approach is employed to introduce a minimal and consistent parametrization of all anomalous top couplings to the SM gauge bosons and fermions which are compatible with the SM symmetries. In addition, several aspects and consequences of the underlying effective operator relations for these couplings are discussed. The resulting set of couplings has been implemented in the parton level Monte Carlo event generator WHIZARD in order to provide a tool for the quantitative assessment of the phenomenological implications at present and future colliders such as the LHC or a planned international linear collider. The phenomenological part of this thesis is focused on the charged current couplings of the top quark, namely anomalous contributions to the trilinear tbW coupling as well as quartic four-fermion contact interactions of the form tbff, both affecting single top production as well as top decays at the LHC. The study includes various aspects of inclusive cross section measurements as well as differential distributions of single tops produced in the t channel, bq → tq', and in the s channel, ud → tb. We discuss the parton level modelling of these processes as well as detector effects, and finally present the prospected LHC reach for setting limits on these couplings with 10 resp. 100 fb−1 of data recorded at √s = 14 TeV. / Das Top-Quark spielt eine wichtige Rolle in der aktuellen Teilchenphysik, sowohl aus theoretischer Sicht aufgrund seiner einzigartig großen Masse, aber auch aus experimenteller Sicht wegen der großen Anzahl an Top-Ereignissen, die von den LHC-Experimenten ATLAS und CMS bereits aufgezeichnet wurden. Diese ermöglichen direkte Messungen der Eigenschaften dieses Teilchens, zum Beispiel seine Kopplungen an die anderen Teilchen des Standardmodells (SM), mit einer bis dato unerreichten Genauigkeit. In der vorliegenden Arbeit wird ein Zugang mittels effektiver Feldtheorie verwendet, um eine minimale und konsistente Parametrisierung aller anomalen Top-Kopplungen an die Eichbosonen und Fermionen des SM zu finden, die mit allen SM-Symmetrien kompatibel ist. Zudem werden verschiedene Aspekte und Konsequenzen der zugrundeliegenden Operatorrelationen für diese Kopplungen diskutiert. Der resultierende Satz von Kopplungen wurde in den Monte Carlo-Ereignisgenerator WHIZARD implementiert, um einen quantitativen Zugang zu den phänomenologischen Implikationen an aktuellen und zukünftigen Teilchenbeschleunigern wie dem LHC oder einem geplanten internationalen Linearbeschleuniger zu ermöglichen. Der phänomenologische Teil dieser Arbeit konzentriert sich auf die geladenen Stromkopplungen des Top-Quarks, beziehungsweise anomale Beiträge zur trilinearen tbW-Kopplung wie zur quartischen Kontaktwechselwirkung der Form tbff, die Einfluss auf die Produktion einzelner Top-Quarks sowie auf deren Zerfall am LHC haben. Die Studie umfasst verschiedene Aspekte der Messung inklusiver Wirkungsquerschnitte, aber auch differentieller Verteilungen einzelner Top-Quarks, die entweder im t-Kanal, bq → tq', oder im s-Kanal, ud → tb, produziert wurden. Diskutiert werden sowohl die Modellierung dieser Prozesse auf Parton-Ebene als auch Detektoreffekte, um schließlich zu einer Abschätzung der voraussichtlichen Ausschlussgrenzen des LHC an solche Kopplungen mit 10 bzw. 100 fb−1 an aufgezeichneten Daten bei √s = 14 TeV zu kommen.

Dieses Projekt soll zur Entwicklung eines Bluttests beitragen, um bei allogen stammzelltransplantierten (allo-SZT) Patienten eine drohende akute Graft-versus-Host Disease (aGVHD) vorhersagen und von einer Infektionskomplikation unterscheiden zu können. Die aGVHD und opportunistische Infektionen, wie etwa eine Zytomegalievirus- Infektion, stellen die Hauptrisiken der allo-SZT dar. Eine durch einen prädiktiven Test verbesserte Vorhersage bzw. Differenzierung dieser beiden schweren omplikationen könnte zu einem breiteren Einsatz der allo-SZT führen. Eine Reihe von Erkenntnissen lassen die Vermutung zu, dass bestimmte Homing- Rezeptoren auf T-Zellen im peripheren Blut als Marker zur Vorhersage und Differenzierung zwischen einer aGVHD und Infektionskomplikationen dienen könnten. So wurde in Mausmodellen gezeigt, dass die Pathogenese der aGVHD ein streng zeitlich regulierter und organspezifischer Immunprozess ist. Alloreaktive T-Zellen müssen bestimmte Homing-Rezeptoren exprimieren, um in die Zielorgane der aGVHD (Gastrointestinaltrakt, Leber und Haut) einwandern zu können. Die Immunreaktion auf eine Infektion setzt ebenfalls voraus, dass in der adaptiven Immunantwort T-Zellen organ- und entzündungsspezifische Homing-Rezeptoren exprimieren. Eine zentrale Voraussetzung für einen prospektiven klinischen Test mit allo-SZT Patienten ist die Kenntnis der physiologischen Bandbreite der Oberflächenmarker auf T-Lymphozyten in Gesunden, um diese von pathophysiologischen Veränderungen unterscheiden zu können. Ziel dieser Arbeit war es daher, eine effiziente und zuverlässige Methode zu entwickeln, um das Homing-Rezeptor-Profil von humanen T-Zellen im peripheren Blut analysieren zu können. Dazu wurde ein urchflusszytometrie-Test mit 25 Oberflächenmarkern etabliert, die eine Rolle in der Pathogenese der aGVHD und bei Infektionen spielen könnten. Mit diesem Test wurde die Expression der Oberflächenmarker von 21 gesunden Probanden an 8 Zeitpunkten über einen Zeitraum von 3 Wochen analysiert. Die untersuchten Oberflächenmarker lassen sich dabei entsprechend ihrer Expressionsmuster in drei Kategorien einteilen, nämlich (I) zeitlich stabile niedrige, (II) zeitlich stabile hohe und (III) dynamisch schwankende Expression. Aufbauend auf diesen Ergebnissen für gesunde Probanden wurde am Universitätsklinikum Würzburg eine prospektive klinische Studie an aGVHD-Patienten begonnen. / This project contributes to the development of a blood test to predict acute graft-versus- host disease (aGvHD) and to differentiate it from infectious complications in allogeneic hematopoietic cell transplantation (allo-HCT). aGvHD and opportunistic infections like Cytomegalovirus infections are major risks of allo-HCT. Such a predictive test could bring a major improvement in the prevention and treatment of aGvHD. The basic idea of this test is that certain homing receptors on peripheral blood T cells could serve as markers to predict and to differentiate between aGvHD and opportunistic infections. This is supported by several empirical findings. It has been recently demonstrated in murine in vivo imaging models that aGvHD pathogenesis is an organ specific process that is tightly regulated in time. Alloreactive T cells express certain homing receptors in order to reach the aGvHD target organs (intestinal tract, liver and skin). Also the immune response to an infection requires the expression of specific homing receptors on T cells. For a prospective clinical test with allo-HCT patients it is important to establish the physiological ranges of T cell surface markers of healthy individuals, to distinguish them from pathological changes. This project intends to establish an efficient and reliable method to analyze the homing receptor profile of human peripheral blood T cells. A multiplex flow cytometry test for cytotoxic and T helper cell subsets was developed to analyze the expression of 25 activation markers, organ specific homing receptors and inflammatory response receptors on human peripheral blood T cells that are likely to play a role in the pathogenesis of aGvHD and infections. With this test the surface marker profile of 21 healthy individuals was analyzed. The peripheral blood mononuclear cells were examined by flow cytometry at 8 points in time within 3 weeks. Preliminary mouse experiments in our group suggested these points in time as critical for subsequent prospective clinical studies. We found that the surface marker expression on peripheral blood cytotoxic and T helper cells in healthy probands can be subdivided into 3 categories: (I) constant low expression, (II) constant high expression and (III) T cell subsets that dynamically change the expression. These findings for healthy probands form the basis for a recently initiated clinical prospective study with allo-HCT patients at the University Hospital Würzburg.

Der Myokardinfarkt (MI) gehört nach wie vor zu den führenden Todesursachen weltweit. Eine Minimierung der Infarktgröße, die durch die Dauer der Ischämie bestimmt wird, ist wesentlich für das Überleben und die Lebensqualität des Myokardinfarkt-Patienten. Die Reperfusion stellt aktuell eine zentrale klinische Intervention dar, um den myokardialen Schaden einzugrenzen. Dennoch führt die Reperfusion per se zu zusätzlichem Schaden am Herzen. Somit ist die Erforschung neuer Strategien zur Minimierung des myokardialen Reperfusionsschadens international von Interesse. Die Pathophysiologie des myokardialen Reperfusionsschadens ist vielschichtig und einige Komponenten sind auch heute in ihrer Wirkweise noch nicht vollständig mechanistisch verstanden. Die vorliegende Arbeit untersucht die Rolle von CD4+ T-Zellen und insbesondere deren Subpopulation der regulatorischen T-Zellen im myokardialen Reperfusionsschaden und stellt neue, auf T-Zellen abzielende, Therapien in Ergänzung zur myokardialen Reperfusion vor. Zunächst wurde eine Infiltration von T-Zellen in das Myokard nach Ischämie-Reperfusion (I/ R) untersucht. Nach der Ischämie-Reperfusion wurden infiltrierende CD4+ T-Zellen als quantitativ führend und aktiviert identifiziert und erwiesen sich in der Infarktgrößenbestimmung als relevante Mediatoren des Reperfusionsschadens. CD25+Foxp3+ regulatorische T-Zellen (Treg) stellen eine Subpopulation von CD4+ T-Zellen mit immunsuppressiven Eigenschaften dar, die schnell und niederschwellig aktiviert werden können und kommen somit als zum Reperfusionsschaden beitragend in Frage. Mit Hilfe des DEREG (DEpletion of REGulatory T cells) -Mausmodells wurde gezeigt, dass regulatorische T-Zellen zum myokardialen Reperfusionsschaden beitragen; Treg-depletierte DEREG-Mäuse waren vor dem Reperfusionsschaden geschützt und zeigten kleinere Infarktgrößen als die Kontrolltiere. Zudem wurde mittels Transferexperimenten gezeigt, dass für den Treg-vermittelten Reperfusionsschaden die Anwesenheit von CD25- konventionellen T-Zellen (Tconv) erforderlich ist. Regulatorische T-Zellen stellen also einen in der vorliegenden Arbeit identifizierten potentiellen Angriffspunkt zur Reduktion des myokardialen Reperfusionsschadens dar. Anhand von T-Zell-Rezeptor transgenen OT-II Mäusen und MHC (Major Histocompatibility Complex) Klasse II Knockout (KO) Tieren wurde gezeigt, dass Autoantigenerkennung im myokardialen Reperfusionsschaden eine Rolle spielt. Zur vollen T-Zell-Aktivierung notwendig ist neben dem MHC Klasse II-Signalweg und Kostimulatoren auch das Moleküle CD154 (CD40L). Die Gabe eines inhibitorischen anti-CD154-Antikörpers reduzierte die Infarktgröße in Wildtyp-Tieren sigifikant. Der myokardiale Reperfusionsschaden kann neben Zellen der adaptiven Immunität auch durch Neutrophile Granulozyten, Plättchen oder Inflammation des Endothels verstärkt werden. Knockout Mäuse mit einer Defizienz an CD4+ T-Zellen verfügten über eine verbesserte Mikroperfusion. Mechanistisch war nach 24h Reperfusion die absolute Zellzahl an Neutrophilen Granulozyten im CD4 KO im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen unverändert; in Endothelzellen war die Regulation bestimmter Gene (VEGFα, TIMP-1 und Eng) nach I/ R im CD4 KO jedoch verändert. Zusammengefasst zeigt die vorliegende Arbeit eine zentrale Rolle der Antigen-Erkennung durch den T-Zell-Rezeptor zur Aktivierung von CD4+ T-Zellen im myokardialen Reperfusionsschaden. In Anwesenheit von CD4+Foxp3+ T-Zellen ist der Reperfusionsschaden erhöht. Somit können CD4+Foxp3+ T-Zellen potentiell als Ziel für neuartige Therapien des Myokardinfarkts genutzt werden. / Myocardial infarction (MI) is still one of the leading causes of mortality worldwide. Minimizing infarct size, which is determined by duration of ischemia, is of paramount importance for the rescue of myocardial tissue determining myocardial infarct size and prognosis. Currently, reperfusion is a central clinical intervention to curtail myocardial ischemia. However, reperfusion itself is leading to additional damage to the heart. Therefore, investigating new strategies to minimize myocardial reperfusion injury is of international interest. The pathophysiology of myocardial reperfusion injury is complex and some of its components are still mechanistically not completely understood. The present work determines the role of CD4+ T-cells and in particular their subset of regulatory T-cells in myocardial reperfusion injury, providing approaches for new T-cell directed therapies in addition to myocardial reperfusion. Initially, an infiltration of T-cells into the myocardium was investigated after ischemia-reperfusion (I/ R). After ischemia-reperfusion, infiltrating CD4+ T-cells were identified as leading in quantity and activated and turned out to be relevant mediators of reperfusion injury influencing infarct size. CD25+Foxp3+ regulatory T (reg)-cells are a subpopulation of CD4+ T-cells with immunosuppressive features, being activated quickly and at a low threshold, thereby possibly mediating reperfusion injury. With the help of the DEREG (DEpletion of REGulatory T-cells) mouse model, regulatory T-cells were identified as involved in myocardial reperfusion injury; Treg-depleted DEREG mice were protected from reperfusion injury showing smaller infarct sizes than control mice. Additionally, transfer experiments revealed that Treg-mediated reperfusion injury needs the presence of CD25- conventional T-cells (Tconv). That means that Tregs are a potential target identified in the present work to reduce myocardial reperfusion injury. With the help of T-cell receptor transgenic OT-II mice and MHC (major histocompatibility complex) class II knockout (KO) mice, it was shown that recognition of autoantigen plays a role in myocardial reperfusion injury. Next to MHC class II-signaling and costimulators also the molecule CD154 (CD40L) is required for full T-cell activation. An inhibitory anti-CD154 antibody significantly reduced infarct size in wildtype mice. Besides by cells of the adaptive immunity, myocardial reperfusion injury can also be intensified by neutrophils, platelets or inflammation of the endothelium. Knockout mice deficient in CD4+ T-cells revealed a better microperfusion. Mechanistically, after 24h of reperfusion, the absolute cell number of neutrophils was not altered in CD4 KO versus wildtype mice; however, in endothelial cells, the regulation of specific genes (VEGFα, TIMP-1 and Eng) was altered after I/ R. In summary, the present work shows a central role of recognition of antigen by the T-cell receptor for activation of CD4+ T cells in myocardial reperfusion injury. In the presence of CD4+Foxp3+ regulatory T-cells, myocardial reperfusion injury is enhanced. Hence, CD4+Foxp3+ regulatory T-cells might constitute a new potential target for the therapy of myocardial infarction.

Les leucémies aiguës lymphoblastiques et les lymphomes de type T sont des cancers très agressifs, génétiquement hétérogènes. Les pronostics sont globalement défavorables et la survie après rechute n’est que de 10%. Les plus fréquentes mutations ont pour conséquence l’activation constitutive de l’axe PI3K/AKT/mTOR favorisant la progression tumorale. La compréhension des mécanismes de la transformation cancéreuse, à l’aide d’un modèle murin (invalidation spécifique de PTEN dans les lymphocytes T), va permettre de proposer de nouvelles cibles potentielles et de futurs traitements ciblés qui peuvent agir seuls ou en combinaison avec les médicaments chimiothérapeutiques et améliorer le pronostic et la survie des patients. Dans un premier temps, je me suis intéressée au fait de cibler à la fois le métabolisme leucémique élevé et l’activation oncogénique de la voie mTOR en utilisant des activateurs du senseur de stress AMPK : metformin, phenformin et AICAR. Puis, comme il est connu que la concentration en acides aminés intracellulaire influe sur la voie mTOR je me suis intéressée à interférer avec l’action du transporteur d’acides aminés LAT-1, dont le gène slc7a5 est fortement surexprimé dans un grand nombre de cancers dont notre modèle de lymphome T tPTEN-/-. Enfin, je me suis intéressée aussi au rôle de la surrexpression du récepteur de la transferrine (CD71) par les cellules tPTEN-/-, qui suggère que ces cellules cancéreuses pourraient avoir développé une addiction au fer, co-facteur essentiel de nombreux processus métaboliques. Globalement, les résultats présentés dans ce mémoire de thèse démontrent l’intérêt de cibler le métabolisme reprogrammé des cellules cancéreuses. / Lymphoids proliferative malignancies of T-cell origin, lymphomas (T-NHL) and acute lymphoblastic leukemias (T-ALL), are genetically heterogeneous and very aggressive diseases. Their prognosis is still unfavourable and relapse-free survival is only 10%. A common feature of T-LL/T-ALL is the frequent (85% of cases) and abnormal activation of the PI3K/AKT/mTOR pathway that promotes tumor progression. A better molecular understanding of tumoral transformation, using a murine model (T-cell-specific depletion of PTEN), will help identify new potential therapeutic targets for future innovative treatments, that could be efficient alone or in combination with current chemotherapeutic drugs to improve prognosis and patients survival. First of all, I was interested in studying the effects of interfering with the high metabolism and the oncogenic activation of the mTOR pathway, by using metformin, phenformin and AICAR that activates the stress and energy sensor AMPK. Next, as it was well known that intracellular amino acids concentration influences the mTOR pathway, I explored the possibility to target the amino acids transporter LAT-1 that is encoded by the slc7a5 gene, upregulated in a large numbers of cancers including our T-lymphoma murine model. Lastly, I also observed an upregulation of the transferrin receptor (CD71) in tPTEN-/- cells, suggesting that cancer cells require high levels of iron uptake, an essential element for numerous metabolic processes, to sustain high proliferation and survival. More generally, the results presented in this manuscript thesis show an interest to target the reprogrammed metabolism of tumor cells.

Die Expression der Hämatopoetischen Progenitor Kinase 1 (HPK1), einem Mitglied der Familie der „Germinal Centre“ Kinasen, ist im adulten Organismus auf die Zellen des hämatopoetischen Systems beschränkt. Die HPK1 wurde ursprünglich als ein Aktivator des JNK-Signalübertragungsweges beschrieben [Hu et al., 1996; Kiefer et al., 1996], und kürzlich wurde eine transiente Aktivierung der HPK1 nach TZR-Stimulation nachgewiesen. Auch wurde eine Assoziation der HPK1 mit dem Linker aktivierter T-Zellen (LAT) und den Adaptorproteinen Nck, Crk, Gads, Grb2, Grap, CrkL sowie SLP-76 gezeigt. Für die Aktivierung der nach TZR-Stimulation in den Lipid-Rafts lokalisierten HPK1 sind sowohl Lck als auch ZAP-70 notwendig [Liou et al., 2000; Liu et al., 2000a; Ling et al., 2001]. Diese Daten legen eine mögliche Funktion von HPK1 bei der TZR-vermittelten Signalübertragung nahe. Trotzdem konnte bisher eine physiologische Rolle der HPK1 im Rahmen der Immunrezeptor-Signalübertragung nicht nachgewiesen werden. In der vorliegenden Arbeit wird dargestellt, dass eine wichtige Funktion der HPK1 in T-Zellen nach TZR-Stimulation, die durch die Förderung des Aktivierungs-induzierten Zelltodes (AICD) vermittelt wird, in der Kontrolle der Termination der Immunantwort und damit Homöostase des Immunsystems besteht. Dies wurde durch retrovirale Überexpression der wildtypischen (wt) HPK1 in murinen CD4+ T-Zellen nachgewiesen, in denen die HPK1 zu einem Anstieg der spontanen und antiCD3-vermittelten Apoptose sowie zu einer gesteigerten Expression des Fas-Liganden (FasL oder auch CD95L) führte. Die Expression einer HPK1-„antisense“ (AS)-RNA in CD4+ T-Zellen bewirkte dagegen eine schwache, jedoch signifikant nachweisbare Hemmung der Apoptose und FasL-Expression. Die Apoptose-Hemmung durch die HPK1-AS-RNA war besonders stark in H2O2-stimulierten EL-4 T-Zellen ausgeprägt, in denen die Überexpression der wt HPK1 den durch reaktive Sauerstoffmetabolite (ROS) induzierten Zelltod verstärkte. Aus diesen Daten folgt, dass die HPK1 die T-Zell-Apoptose reguliert. In H2O2-stimulierten EL-4 T-Zellen führt die HPK1-Expression zu einer verstärkten und anhaltenden Aktivierung der c-Jun N-terminalen Kinase (JNK), die wahrscheinlich an der HPK1-vermittelten Apoptoseinduktion beteiligt ist. Unter den gleichen Bedingungen konnte eine schnelle Spaltung der HPK1 beobachtet werden. Die Überexpression der N- oder C-terminalen Spaltprodukte in CD4+ T-Zellen führte - wie die der Gesamt-HPK1 - zu einem Anstieg des AICD. In Übereinstimmung mit publizierten Daten konnten wir eine Hemmung der NFkB-Aktivität durch das C-terminale HPK1-Peptid nachweisen, das die IkBalpha-Degradation inhibiert. Die erzielten Ergebnisse führten uns in ihrer Gesamtheit zu folgendem Modell: während der Initiationsphase der T-Zell-Stimulierung werden nach schneller, transienter HPK1-Aktivierung pro- und anti-apoptotische Signale durch den JNK- und NFkB-Signalübertragungsweg vermittelt. Durch die Akkumulation der C-terminalen HPK1-Spaltprodukte kommt es später zur Inhibierung der NFkB-Aktivität und damit zu einer Verschiebung des Gleichgewichts zwischen den Überlebens- und Apoptose-stimulierenden Signalen zugunsten des AICD. Allerdings gibt es sicherlich weitere Faktoren und Signalwege, die an der HPK1-vermittelten Kontrolle der T-Zell-Apoptose beteiligt sind und von deren Untersuchung ein detaillierteres Verständnis der HPK1-Physiologie erwartet wird. Die Nukleären Faktoren aktivierter T-Zellen (NFAT´s) gehören zu einer Familie von Transkriptionsfaktoren, denen eine konservierte, ca. 300 Aminosäuren (aa) große DNA-Bindedomäne und eine Calcineurin-Bindedomäne gemeinsam ist. NFATc (auch NFATc1 oder NFAT2 genannt) und NFATp (NFATc2 oder NFAT1) werden in peripheren T-Zellen stark exprimiert und kontrollieren deren Effektorfunktionen u.a. über die Expression von IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IFNgamma und weiterer Lymphokine. Weitere von den NFAT´s kontrollierte Gene sind p21WAF1, der CD40L und der CD95L. Somit scheinen die NFAT´s bei der Zellzyklus-Kontrolle und beim AICD von T-Lymphozyten eine wichtige Rolle zu spielen. Daten unseres Labors zeigten, dass die T-Zell-Aktivierung zu einer massiven Induktion der kurzen Isoform A von NFATc innerhalb von 3-4 h führt [Chuvpilo et al., 1999b], noch vor dem Start des AICD. Dies ließ vermuten, dass sich die biologische Funktion von NFATc/A durch das Fehlen des C-terminalen Peptids von ca. 245 aa, das in allen anderen NFAT-Proteinen einschließlich der längeren Isoform NFATc/C vorhanden ist, unterscheidet. Deshalb sollte in der vorliegenden Arbeit die Induktion und Funktion von NFATc/A in murinen T-Lymphozyten untersucht werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Infektion primärer CD4+ T-Lymphozyten mit NFATc/A-exprimierenden rekombinanten Retroviren, im Gegensatz zu der mit NFATc/C- oder NFATp-exprimierenden Retroviren, den AICD unbeeinflusst lässt. Dies deutet darauf hin, dass es durch die massive NFATc/A-Synthese nach Effektor-T-Zell-Aktivierung zur Induktion von Effektor-Funktionen kommt, ohne dass dabei die T-Zell-Apoptose beschleunigt wird. Im Gegensatz dazu üben die langen NFAT-Faktoren wie NFATc/C und NFATp eine pro-apoptotische Wirkung aus. / Hematopoietic progenitor kinase 1 (HPK1) is a member of germinal center kinases that is predominantly expressed in hematopoietic cells. The HPK1 has originally been described as an upstream Ser/Thr protein kinase of the JNK signaling cascade [Hu et al., 1996; Kiefer et al., 1996]. Recently, it was shown that T cell receptor (TCR) stimulation leads to a rapid but transient activation of HPK1 and its binding to the linker of activated T cells (LAT) and the adaptor proteins Nck, Crk and Gads. HPK1 which also binds to the signaling molecules SLP-76, Grb2, Grap and CrkL is localized in lipid rafts and needs lck and ZAP70 for its activation [Liou et al., 2000; Liu et al., 2000a; Ling et al., 2001]. These data suggested an involvement of HPK1 in the signaling transfer from the TCR to downstream signaling cascades. However, a role for HPK1 in T cell physiology remained to be shown. We show here that one of the functions of HPK1 activation upon T cell stimulation is to control the termination of immune response and, therefore, homeostasis of the immune system by supporting the ´Activation Induced Cell Death´ (AICD) of T cells. This is demonstrated by overexpressing wild type (wt) HPK1 which led to a substantial increase in spontaneous and antiCD3-mediated apoptosis as well as in Fas ligand (FasL or also CD95L) expression on murine CD4+ T cells. In contrast, expression of HPK1 antisense (AS)-RNA exerted a slight, albeit measurable suppressive effect on both apoptosis and FasL expression. Apoptosis suppression by overexpressing HPK1 AS-RNA was much more pronounced in H2O2-treated EL-4 T cells in which HPK1 overexpression stimulated cell death induced by reactive oxygen species (ROS) indicating that HPK1 indeed controls apoptosis in T cells. HPK1 expression also led to a sustained increase in c-Jun N-terminal kinase (JNK) activity suggesting that JNK activation contributes to the HPK1-mediated apoptosis in H202-treated EL-4 cells. Under the same conditions a rapid cleavage of HPK1 was observed, and overexpression of N- and C-terminal cleavage products in CD4+ T cells resulted, similar to full-length HPK1, in an increase in AICD. In agreement with published data we show that the C-terminal portion of HPK1 suppresses IkBalpha degradation thereby inhibiting NFkB activation. Taken together, these results led to a model in which, during the initial phase of T cell activation, the rapid and transient HPK1 induction provides both pro- and anti-apoptotic signals by activating JNK and NFkB signaling pathways, respectively. At a later stage, due to the accumulation of the C-terminal HPK1 cleavage product, NFkB activation is suppressed and the balance between survival and apototic signals is shifted favoring apoptosis. However, signalling events in addition to the stimulation of JNK and inhibition of NFkB signalling cascades might also be involved in the HPK1-mediated control of T cell apoptosis. The nature of these events remains to be elucidated. Nuclear Factor of activated T cells (NFAT) proteins belong to a family of transcription factors which share a common DNA binding domain of approximately 300 amino acids (aa) and a calcineurin binding domain. NFATc (also designated as NFATc1 or NFAT2) and NFATp (also designated as NFATc2 or NFAT1) are highly expressed in peripheral T cells and control their effector function, in particular the expression of lymphokines, such as IL-2, IL-3, IL-4, IL-5 and IFNgamma. Further target promoters for NFATs are the p21Waf1, the CD40 ligand and CD95 ligand promoters indicating that in addition to effector function NFATs are also involved in the control of the cell cycle and, in particular, AICD of T lymphocytes. We have shown previously that T cell activation leads to the massive induction of the short isoform A of NFATc within 3-4 h [Chuvpilo et al., 1999b], i.e. before the onset of AICD. This observation suggested that due to the lack of the C-terminal extension of approximately 245 aa which is present in all other NFAT proteins, NFATc/A might differ in biological function from other NFAT proteins, including its longer isoform NFATc/C. This view prompted us to investigate the induction and function of NFATc/A in murine T lymphocytes. Here we show that infection of primary CD4+ T lymphocytes with recombinant retroviruses expressing NFATc/A, in contrast to retroviruses expressing NFATc/C or NFATp, does not enhance AICD. These data suggest that the massive synthesis of NFATc/A upon activation of effector T cells ensures these cells to exert effector functions without inducing rapid apoptosis.

T cells are at the heart of the adaptive immune response. They mediate many important immunological processes that provide protection against viruses, bacteria and other pathogens. The aim of the work described in this thesis was to use gene expression profiling to gain insights into different aspects of T cell biology. In particular we wanted to examine the mechanisms and identify the genes that underlie T cell effector function. IFN-g-producing Th1 cells are a major effector subset that protects against intracellular pathogens, while Th2 cells produce IL-4, IL-5 and IL-13 and mediate protection against large extracellular pathogens. Microarray profiling of gene expression in mouse and human Th1 and Th2 cells, as well as mouse Tc1 and Tc2 cells, identified a number of novel markers of these T cells which may have important roles in T cell differentiation/function. We found that T cell type, host species and differentiation conditions significantly influenced gene expression profiles generated during T cell polarization. Providing help to B cells for antibody production is the major function of the third effector subset of CD4+ T cells termed T follicular homing or TFH cells. Relatively little is known about the generation of these cells, and the mechanisms of their effector function. Using oligonucleotide microarrays we identified a TFH-specific gene expression signature, which included many novel genes which will undoubtedly enable better identification and characterization of this novel subset. A comprehensive study profiling all the major leukocyte subsets revealed their distinct gene expression signatures and numerous leukocyte subset specific genes. A detailed examination of most major T cell subsets identified distinguishing features of each subset together with gene expression changes associated with T cell activation and exposure to cell culture conditions. In addition, we described a distinctive transcriptional profile for gd T cells and examined the differences between central and effector memory T cells. We also showed that specific gene expression signatures provide a powerful tool for subset classification. Taken together this work provides important insights into T cell differentiation and effector function, and presents a basis for future work examining numerous novel genes relevant to T cell biology.

The activation and effector function of CD4+ T cells are critical points of regulation during an antigen specific T cell response. Dysregulation of these processes can lead to the development of human diseases, encompassing both immunodeficiency and autoimmunity. Members of the TNF superfamily have recently emerged as important regulators of T cell responses, with their overexpression causing autoimmune inflammation in animal models. As overproduction of the novel TNF superfamily ligand BAFF is associated with several autoimmune conditions, we sought to examine the potential role of BAFF as a regulator of T cell activation and effector function. We initially demonstrated BAFF costimulation of T cell activation in vitro. Generation of specific monoclonal antibodies identified BAFF-R as the only BAFF receptor present on T cells, and showed that it was expressed in an activation-dependent and subset-specific manner. Impaired BAFF costimulation in BAFF-R deficient mice indicated that BAFF-R was crucial for mediating BAFF effects in T cells. Analysis of T cell responses in vivo revealed that BAFF transgenic mice have increased T cell priming and recall responses to protein antigens, and showed a corresponding increase in the DTH model of Th1 cell-dependent inflammation. In addition, Th2-dependent allergic airway responses are suppressed in BAFF transgenic mice. Crossing to a B cell deficient background revealed that the proinflammatory effects of BAFF on T cell priming and DTH rely on the presence of B cells, while the suppressive effects during allergic airway inflammation are B cell independent. These data demonstrated that BAFF regulated the outcome of T cell responses in vivo and identified BAFF dependent crosstalk between T and B cells. Stimulation of B cells with BAFF induced the upregulation of MHC class II and ICOS-L both in vitro and in vivo. Induction of these cell surface molecules was associated with an increased capacity to induce T cell proliferation, however this effect was independent of ICOS-L expression. Thus it was demonstrated that BAFF regulated T cell activation and effector function both directly, via stimulation of BAFF-R, and indirectly, by altering the function of B cells. These data suggest that BAFF dependent alterations in T cell function may be an additional causative factor in the association between elevated BAFF levels and the generation of autoimmunity.

Cytotoxic T lymphocytes (CTL) are differentiated CD8+ T cells that eliminate virally infected cells and tumor cells. CTL lyse target cells by at least two distinct mechanisms: degranulation of cytolytic molecules and cell surface expression of Fas ligand (FasL), which induces apoptosis of Fas-expressing target cells. In addition to their defense function, these two cytolytic mechanisms also play crucial roles in homeostatic regulation and contribute to pathogenesis in many different model systems. To fully exploit killer cells in tumor and virus elimination, or dampen the immune response in, for example, autoimmune diseases, it is essential to understand the mechanisms that CTL employ to destroy target cells. In contrast to the well-characterized degranulation mechanism, the regulation of FasL expression on the CTL cell surface remains elusive and even controversial. The prevailing model at the time I initiated my studies was that FasL is stored in cytolytic granules and that FasL cell surface expression would be subject to the same controls as degranulation. In this thesis, I revealed for the first time that there are two waves of FasL cell surface expression upon target cell engagement, which are differentially regulated by TCR signaling and perform distinct roles in CTL mediated responses. I demonstrated that CTL degranulation and FasL lytic mechanisms are fully independent with respect to stored component localization and regulation. Finally, based on cell fractionation and imaging studies, I suggested that FasL is stored in a recycling endosome associated compartment, which is located in a special niche between the ER and mitochondria and uses a novel microtubule-independent secretory mechanism to translocate to the cell surface. Together, these findings provide important insight into the regulation and role of FasL in CTL mediated responses. / Immunology