Thèse de doctorat : Immunologie : Paris 12 : 2005. / Version électronique uniquement consultable au sein de l'Université Paris 12 (Intranet). Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. : 150 réf.

L'anticorps recombinant anti-CD4 13B8.2 a démontré des capacités de lyse dépendante du complément (CDC) et d'inhibition de la prolifération cellulaire dans le cadre du traitement des tumeurs hématopoïétiques CD4+. Bien qu'il ait été démontré que son action antiproliférative passe par une modulation du facteur de transcription NF-(kappa)B, les mécanismes précis y conduisant restent encore inexpliqués. Au sein du laboratoire, de précédentes études ont démontré que l'anticorps anti-CD4 13B8.2 induit une réorganisation et une modulation des protéines dans les rafts, en y concentrant le CD4 et en y excluant les protéines ZAP70, SLP76, PLC(nu)1 et Vav1. Nous avons tenté d'expliquer les mécanismes qui participent à la modulation des protéines au sein des microdomaines membranaires lipidiques, et nous proposons que la voie de signalisation Carma1 soit impliquée dans les effets observés sur le facteur de transcription NF-(kappa)B. Cette étude démontre que les effets biologiques de l'anticorps recombinant 13B8.2 passent par une modulation de la voie Carma1, Bcl10, MALT1. L'anticorps 13B8.2 induit une réorganisation de ces protéines en dehors des microdomaines membranaires lipidiques avec une dissociation du complexe qui ne peut plus transmettre la signalisation conduisant à l'activation de NF-(kappa)B. Nous avons également mis en évidence que les réorganisations protéiques au niveau de la membrane, induites par l'anticorps anti-CD4 13B8.2 s'accompagnent d'une modulation des espèces lipidiques des microdomaines. Ainsi, nous observons une augmentation du niveau des acides gras de type C18 :0, et une augmentation de l'activité d'une sphingomyelinase acide qui conduit à une augmentation du taux de céramide. Parallèlement l'augmentation de céramide, induite par une sphingomyelinase bactérienne induit la réorganisation de ZAP70 hors des microdomaines, de façon comparable à l'anticorps 13B8.2. Cette meilleure connaissance des mécanismes de signalisation de l'anticorps anti-CD4 13B8.2, permettra de dégager de nouvelles approches thérapeutiques en vue de la modulation de la prolifération des cellules T et de leur sensibilisation à la chimiothérapie. Ce travail ouvre la voie à des possibilités de thérapies ciblant les microdomaines lipidiques. / The recombinant anti-CD4 antibody 13B8.2 demonstrated capabilities complement dependent lysis (CDC) and inhibition of cell proliferation in the treatment of hematopoietic tumors CD4 +. Although it has been demonstrated that its antiproliferative activity through modulation of transcription factor NF-kB, the precise mechanisms leading to them remain unexplained. Within the laboratory, previous studies have shown that anti-CD4 13B8.2 induced a reorganization and modulation of proteins in rafts by concentrating CD4 and by excluding proteins ZAP70, SLP76, Vav1 and PLC(nu)1 . We tried to explain the mechanisms involved in the modulation of proteins within lipid microdomains, and we propose that the signaling pathway is involved in Carma1 observed effects on the transcription factor NF-kB. This study demonstrates that the biological effects of recombinant antibody 13B8.2 pass through a modulation of the channel Carma1, Bcl10, MALT1. 13B8.2 antibody induces a reorganization of these proteins outside the lipid membrane microdomains with a dissociation of the complex that can no longer transmit signals leading to activation of NF-kB. We also demonstrated that the protein reorganization at the membrane induced by anti-CD4 13B8.2 accompanied by modulation of lipid microdomains species. Thus, we see an increased level of fatty acids like C18: 0, and increased activity of acid sphingomyelinase leads to an increased rate of ceramide. Parallel increase of ceramide, induced by bacterial sphingomyelinase induced reorganization of ZAP70 outside microdomains similarly to the antibody 13B8.2. A better understanding of signaling mechanisms of the anti-CD4 13B8.2, will identify new therapeutic approaches for modulating the proliferation of T cells and their sensitization to chemotherapy. This work paves the way for potential therapies targeted to lipid microdomains.

Reproduction de : Thèse d'exercice : Médecine. Biologie médicale : Paris 12 : 2008. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. f. 44-48.

Le syndrome hyperéosinophilique dit "lymphoïde" avec cellules T circulantes CD3-CD4+ (SHE-L CD3-CD4+) se caractérise par une hyperéosinophilie secondaire à la présence d'un clone lymphocytaire T producteur de cytokines comme l'IL-5. Trente patients seulement ont été rapportés dans la littérature, neuf d'entre eux ont présenté un lymphome T périphérique au cours du suivi. Il n'existe aucune grande série de la littérature décrivant les données cliniques, les caractéristiques immunophénotypiques, histopathologiques et moléculaires de la maladie. Le travail de Thèse a permis de confirmer la prédominance des manifestations cutanées et ganglionnaires dans le SHE-L CD3-CD4+, mais également d'autres atteintes d'organes dont l'infiltrat à éosinophiles a été démontré (poumon, tube digestif, glande lacrymale, parotide, synoviale). Les cellules CD3-CD4+ circulantes peuvent être détectées à des taux extrêmement variables, des plus faibles (<1% des lymphocytes circulants) ne devant pas être négligés, aux plus élevés (>90% des lymphocytes circulants) ne devant pas faire évoquer systématiquement une hémopathie maligne. Nous décrivons également les 2 premiers cas de lymphomes angio-immunoblastiques (LAI) survenant au cours du SHE-L CD3-CD4+. Nous avons ensuite pu décrire pour la première fois les caractéristiques histopathologiques ganglionnaires et extra-ganglionnaires (peau, tube digestif,...) du SHE-L CD3-CD4+. Nous décrivons des caractéristiques ganglionnaires et cutanées très similaires au LAI qui soulignent les difficultés du diagnostic différentiel. Nous démontrons également la persistance du même clone lymphocytaire T dans le sang et les tissus lésés sur des prélévements espacés de plusieurs années pour un patient donné (maximum: 23 ans). Enfin, les caractéristiques immunophénotypiques des cellules T circulantes (expression du CD2, CD5, CD7, TCRalphabeta) sont très proches de celles observées dans le LAI. L'ensemble de ces données définissent le SHE-L CD3-CD4+ comme un syndrome lymphoprolifératif clonal T indolent périphérique, à ne pas confondre avec le LAI. Nous proposons des éléments de diagnostic différentiel comme l'expression du CD10 et des marqueurs CXCL13 et PD1 (marqueurs dits "T helper folliculaire"), absents dans le SHE-L mais spécifiques du LAI. La dernière partie du travail de Thèse a porté sur la caractérisation moléculaire du SHE-L CD3-CD4+ par une approche type single nucleotid polymorphism array (SNPa, n=4 patients) en complément d'une étude antérieure par une approche type comparative genomic hybridization array (CGHa, n=1 patient). La comparaison du génome complet des cellules CD3-CD4+ et CD3+CD4+ par SNPa pour un patient donné, a permis d'identifier une zone commune de perte d'hétérozygotie sur le bras long du chromosome 7. L'identification par CGHa d'un gain sur le même segment chromosomique chez un autre patient permet de restreindre la zone d'intérêt à un segment chromosomique porteur de 77 gènes. Des compléments d'investigation (SNPa) sont en cours afin de restreindre le segment chromosomique d'intérêt et d'identifier le gène muté en cause par des méthodes de séquençage. Cette approche devrait permettre d'identifier pour la première fois les mécanismes moléculaires à l'origine de l'émergence du clone lymphocytaire T dans le SHE-L CD3-CD4+. En conclusion, le travail de Thèse a permis d'apporter des éléments nouveaux dans le diagnostic du SHE-L CD3-CD4+, d'en décrire les caractéristiques histopathologiques et immunophénotypiques en faveur d'un syndrome lymphoprolifératif T clonal indolent périphérique, sans équivalent dans la classification OMS actuelle des hémopathies. Enfin, nous espérons pouvoir identifier un ou des gènes d'intérêt, et proposer des mécanismes moléculaires en cause dans ce syndrome lymphoprolifératif clonal T. / The CD3-CD4+ lymphoid variant of hypereosinophilic syndrome (CD3-CD4+ L-HES) is defined by a hypereosinophilia secondary to a clonal T-cell subset producing cytokines like interleukine-5. Only thirty patients have already been described, nine of them have developed a T-cell lymphoma during follow-up. No large series has described clinical features and immunophenotypic, histopathological and molecular characteristics of the disease. This work confirmed the predominance of skin and lymph nodes involvement in CD3-CD4+ L-HES, but also of other organs in which eosinophils infiltrates were demonstrated (lung, digestive tract, lachrymal gland, parotid, synovium). CD3-CD4+ circulating T-cells can be detected at very low level (<1% of total lymphocytes) which should not be neglected, or at very high level (>90% of total lymphocytes) which should not considered as a malignant disorder. We also describe the two first cases of angioimmunoblastic T-cell lymphoma (AITL) occurred in CD3-CD4+ L-HES. We have also described for the first time the nodal and extra nodal histopathological characteristics of CD3-CD4+ L-HES, which are similar to AITL and which highlight the difficulty of differential diagnosis. We also demonstrate the same T-cell clone in blood and damaged tissues in samples spaced up for several years (maximum 23 years). Secondly, immunophenotypic characteristics of circulating T-cells (CD2, CD5, CD7, TCRalphabeta) are really closed to those of circulating T-cells in AITL. Overall, our data define CD3-CD4+ L-HES as a peripheral indolent clonal T-cell lymphoproliferative disorder, which should not be confused with AITL. We suggest some differential diagnosis tools like CD10 and Tfh markers (CXCL13, PD1) which are absent in CD3-CD4+ L-HES but specific of AITLThe last part of the work focused on the molecular characterization of the CD3-CD4 + L-HES by a single nucleotid polymorphism array approach (SNPa, n = 4 patients) in complement of an earlier study using comparative genomic hybridization array approach (CGHa, n = 1 patient). The comparison of the full genome of CD3-CD4 + and CD3+CD4+ T-cells in a given patient identified a common segment of loss of heterozygosity on the long arm of chromosome 7. Identification by CGHa of a gain on the same chromosomal segment in another patient allows restricting the area of interest to a chromosomal segment which represents 77 genes. Complementary investigations (SNPa) are underway to restrict the chromosomal segment of interest and identify the potential mutated genes by sequencing methods. This approach should identify for the first time the molecular mechanisms underlying the emergence of clonal T-cells in the CD3-CD4 + L-HES.In conclusion, the work brings some new usefull features for the diagnosis of CD3-CD4+ L-HES, describes some histopathological and immunophenotypic features in favor of a peripheral indolent clonal T-cell lymphoproliferative disorder, without any equivalent in the 2008 WHO classification of lymphoid neoplasms. Finally, we hope to identify one or more genes of interest, and to propose some molecular mechanisms involved in this clonal lymphoproliferative T-cell disease.

Les macrophages associés aux tumeurs (TAMs) proviennent des monocytes circulants attirés par l'inflammation chronique due à la tumeur. Ces monocytes vont se différencier en une variété de macrophages en fonction des médiateurs présents dans le microenvironnement tumoral. Ainsi, il est admis que les macrophages peuvent stimuler la croissance tumorale (macrophages classiquement appelés M2), mais peuvent aussi reconnaitre et éliminer spécifiquement les cellules transformées (macrophages M1). Cette dichotomie fonctionnelle est dépendante du stade de développement cancéreux et plus spécifiquement de l'évolution du microenvironnement tumoral. De manière générale, l'infiltration et la densité élevée des TAMs au niveau de la tumeur sont corrélées à un mauvais pronostic et de ce fait les TAMs sont considérés comme une cible thérapeutique importante. Dans ce travail de thèse, nous nous sommes attachés dans un premier temps à caractériser le phénotype et les fonctions des macrophages au cours de l'évolution de la tumeur. La mise en place d'un modèle murin préclinique de lymphome T (cellules EL4) nous a permis de montrer que les macrophages présents à un stade tardif du développement tumoral, sont capables de stimuler la prolifération des cellules tumorales. Ces macrophages produisent des facteurs pro-angiogéniques, comme le TGF-ß, et immunosuppresseurs, comme l'IL-6, l'IL-10 et l'Indoléamine dioxygénase (IDO). De manière intéressante, nous avons démontré la capacité de l'IL-6, sécrétée en grande quantité dans l'ascite tumorale, à induire la différenciation des macrophages résidents en macrophages M2 pro-tumoraux. Inversement, nous avons montré que des macrophages murins résidents activés par l'IFN-? ou l'IL-13, cytokines non présentes dans l'ascite tumorale, acquièrent un phénotype anti-tumoral. Alors que l'IFN-? est connu pour induire un macrophage M1 présentant un puissant potentiel tumoricide, nous montrons que l'IL-13, qui polarise les macrophages vers un phénotype alternatif (M2), peut aussi différencier les macrophages vers un phénotype anti-tumoral. Dans ce contexte, nous avons étudié les mécanismes anti-tumoraux des macrophages polarisés par l'IL-13 vis-à-vis des cellules lymphoblastoïdes T. De façon originale, nous avons montré que les macrophages activés par l'IL-13 induisent la nécrose des cellules EL4, en produisant des radicaux libres oxygénés (RLO) et en déplétant l'arginine par l'augmentation de l'activité arginase. Nous avons également montré que les récepteurs Mannose et Dectine-1(Récepteurs Lectine de type-C), fortement exprimés par les macrophages activés par l'IL-13, reconnaissent les cellules tumorales et déclenchent la production des RLO en activant la voie Syk-P47phox. Ils induisent aussi la surexpression de l'arginase en activant la libération d'acide arachidonique et la production des HETEs (acide hydroxy-eicosatétraénoïque), agonistes naturels du récepteur nucléaire PPAR?. De plus, nous avons pu valider, in vivo, la capacité de l'IL-13 à reprogrammer les macrophages pro-tumoraux associés au lymphome T vers un phénotype anti-tumoral et à induire une régression de la tumeur. Ces résultats ont été confirmés par la diminution de la charge tumorale des souris porteuses de lymphome T, après un transfert adoptif des macrophages activés par l'IL-13. Enfin, nous avons établi que l'IL-13 active aussi les fonctions anti-tumorales des macrophages dérivés de monocytes humains contre diverses cellules tumorales humaines. Ce travail illustre la complexité du paradigme M1/M2 dans la description des fonctions pro- et anti-tumorales des macrophages. Ainsi, nos travaux démontrent la capacité de l'IL-13 à stimuler les défenses anti-tumorales des macrophages dans le cadre d'un lymphome T. Ce travail montre également que la modulation efficace des récepteurs Mannose et Dectine-1 par l'IL-13 pourrait permettre d'orienter l'interaction " cellules tumorales-macrophages " pour le bénéfice de l'hôte. / Tumor-associated macrophages (TAMs) are derived from circulating monocytes attracted by the chronic inflammation in the tumor. These monocytes differentiate into a variety of macrophages according to the mediators present in tumor microenvironment. Thus, it is known that macrophages can stimulate tumor growth (usually called M2 macrophages) but may also, in other circumstances, specifically recognize and eliminate transformed cells (M1 macrophages). This functional dichotomy is dependent on the stage of cancer development and specifically on tumor microenvironment. In general, the infiltration and the high density of TAMs in the tumor are associated with poor prognosis and consequently, TAMs might be an important therapeutic target. In this work, we first focused on the phenotype and the functions of the macrophages associated to tumor progression. The use of a preclinical mouse model of T-cell lymphoma (EL4 cells) has shown that macrophages associated to the late stage of tumor development stimulate EL4 tumor cell proliferation. These macrophages produce pro-angiogenic factors like TGF-ß and immunosuppressive mediators, such as IL-6, IL-10 and Indoleamine dioxygenase (IDO). Interestingly, we have shown that IL-6, highly secreted in tumor ascites, can improve protumoral functions of resident macrophages. Conversely, murine resident macrophages activated by IFN-? or IL-13, cytokines not detected in the tumor ascites, acquire an antitumor phenotype. While IFN-? is known to induce M1 macrophages with a powerful tumoricidal potential, we report that IL-13, which stimulate alternative phenotype (M2) of macrophages, can induce antitumor functions of macrophages. In this context, we studied the antitumor mechanisms of IL-13-activated macrophages against T-lymphoma cells. We report that IL-13-activated macrophages exert antitumor activity by promoting T-lymphoma cell necrosis through ROS release and arginase induced-L-arginine depletion. In fact, L-arginine degrading enzymes have been suggested as antitumor agents against multiple tumor lineages auxotrophic for L-arginine. We have also shown that the activation of IL-13-activated macrophages antitumor functions is dependent on the tumor cell recognition by mannose and dectin-1 receptors (C-type Lectin Receptors). Indeed, after recognition, these receptors that are overexpressed by IL-13-activated macrophages, activate Syk-P47phox pathway for ROS production and arachidonic acid-HETEs (hydroxy-eicosatetraenoic acid)-PPAR? axis for arginase activity. Moreover, IL-13 improves T-cell lymphoma regression in tumor-bearing mice through its ability to reprogram TAMs toward cytotoxic effectors. This was supported by a decrease of tumor burden in tumor-bearing mice after adoptive transfer of IL-13-activated macrophages. Finally, we established that IL-13 activates human monocyte-derived macrophages to become tumoricidal against various human tumor cells. This work shows the complexity of the M1/M2 paradigm in the description of pro- and antitumor functions of macrophages. Thus, our findings demonstrate the ability of IL-13 to stimulate macrophage antitumor activities, in the context of T-cell lymphoma. This work also suggests that effective modulation of mannose and dectin-1 receptors by IL-13 might shift the "tumor cells-macrophages" interaction for the host benefit.

Les leucémies aiguës lymphoblastiques et les lymphomes de type T sont des cancers très agressifs, génétiquement hétérogènes. Les pronostics sont globalement défavorables et la survie après rechute n’est que de 10%. Les plus fréquentes mutations ont pour conséquence l’activation constitutive de l’axe PI3K/AKT/mTOR favorisant la progression tumorale. La compréhension des mécanismes de la transformation cancéreuse, à l’aide d’un modèle murin (invalidation spécifique de PTEN dans les lymphocytes T), va permettre de proposer de nouvelles cibles potentielles et de futurs traitements ciblés qui peuvent agir seuls ou en combinaison avec les médicaments chimiothérapeutiques et améliorer le pronostic et la survie des patients. Dans un premier temps, je me suis intéressée au fait de cibler à la fois le métabolisme leucémique élevé et l’activation oncogénique de la voie mTOR en utilisant des activateurs du senseur de stress AMPK : metformin, phenformin et AICAR. Puis, comme il est connu que la concentration en acides aminés intracellulaire influe sur la voie mTOR je me suis intéressée à interférer avec l’action du transporteur d’acides aminés LAT-1, dont le gène slc7a5 est fortement surexprimé dans un grand nombre de cancers dont notre modèle de lymphome T tPTEN-/-. Enfin, je me suis intéressée aussi au rôle de la surrexpression du récepteur de la transferrine (CD71) par les cellules tPTEN-/-, qui suggère que ces cellules cancéreuses pourraient avoir développé une addiction au fer, co-facteur essentiel de nombreux processus métaboliques. Globalement, les résultats présentés dans ce mémoire de thèse démontrent l’intérêt de cibler le métabolisme reprogrammé des cellules cancéreuses. / Lymphoids proliferative malignancies of T-cell origin, lymphomas (T-NHL) and acute lymphoblastic leukemias (T-ALL), are genetically heterogeneous and very aggressive diseases. Their prognosis is still unfavourable and relapse-free survival is only 10%. A common feature of T-LL/T-ALL is the frequent (85% of cases) and abnormal activation of the PI3K/AKT/mTOR pathway that promotes tumor progression. A better molecular understanding of tumoral transformation, using a murine model (T-cell-specific depletion of PTEN), will help identify new potential therapeutic targets for future innovative treatments, that could be efficient alone or in combination with current chemotherapeutic drugs to improve prognosis and patients survival. First of all, I was interested in studying the effects of interfering with the high metabolism and the oncogenic activation of the mTOR pathway, by using metformin, phenformin and AICAR that activates the stress and energy sensor AMPK. Next, as it was well known that intracellular amino acids concentration influences the mTOR pathway, I explored the possibility to target the amino acids transporter LAT-1 that is encoded by the slc7a5 gene, upregulated in a large numbers of cancers including our T-lymphoma murine model. Lastly, I also observed an upregulation of the transferrin receptor (CD71) in tPTEN-/- cells, suggesting that cancer cells require high levels of iron uptake, an essential element for numerous metabolic processes, to sustain high proliferation and survival. More generally, the results presented in this manuscript thesis show an interest to target the reprogrammed metabolism of tumor cells.

La variante lymphocytaire du syndrome hyperéosinophilique (L-SHE) est une pathologie extrêmement rare caractérisée par une prolifération monoclonale de lymphocytes T surproduisant l’interleukine IL-5, responsable d’une hyperéosinophilie persistante. En outre, un immunophénotype aberrant CD3−CD4+ est fréquemment observé à la surface des cellules T clonales. Cette pathologie se distingue par une lymphoprolifération chronique indolente habituellement révélée par une hyperéosinophilie sanguine et une infiltration éosinophilique des tissus cutanés. Toutefois, l’évolution vers un lymphome T observée chez certains patients suggère la présence d’un potentiel malin des cellules T. Ce modèle représente donc une rare opportunité d’identifier les changements moléculaires liés aux différentes étapes du processus transformant lymphoïde T. Dans le cadre de ce travail, nous avons cherché à établir les caractéristiques cytogénétiques et moléculaires des cellules T CD3−CD4+ d’une cohorte de patients L-SHE. L’analyse cytogénétique de cellules T CD3−CD4+ isolées au moment du diagnostic chez deux patientes (P1 et P2) a révélé la présence d’une délétion similaire 6q13-q22.1. En étudiant les stades cliniques successifs de P1 et P2, nous avons montré la persistance des cellules porteuses de la délétion 6q au cours de la progression chronique et leur prédominance lors du développement d’un lymphome T chez P1. Ces résultats suggèrent l’implication précoce et potentiellement critique de la délétion 6q dans cette pathologie lymphoproliférative T. L’analyse des dérégulations transcriptionnelles résultant de ce remaniement a montré une réduction de l’expression des gènes pro-apototiques BACH2 et PA26 dans les cellules T CD3−CD4+ de P1 et P2. En particulier, BACH2, dont l’expression diminue continuellement au cours de l’évolution de P1, jouerait un rôle oncosuppresseur dans la lymphogenèse T. Afin d’identifier les modifications moléculaires des cellules T clonales, nous avons analysé l’expression de 95% des gènes humains dans les cellules T CD3−CD4+ de trois patients en phase chronique (P1, P2 et P3). La grande homologie des changements transcriptionnels chez les trois patients indique une altération des mêmes mécanismes moléculaires. Ainsi, un profil immunophénotypique exhaustif, validé chez trois patients supplémentaires, a pu être établi. En outre, les dérégulations des voies apoptotiques, TGFβ ou 9 encore de signalisation intracellulaire altèrent l’homéostasie des cellules T CD3−CD4+ pouvant favoriser la perte de la capacité apoptotique et/ou la croissance cellulaire. Cette signature moléculaire a été étendue par l’identification de 20 microARNs dont l’expression est dérégulée dans les cellules T CD3−CD4+ d’une cohorte de 6 patients. Par ailleurs, la modification de l’expression des récepteurs impliqués dans la migration leucocytaire au cours de l’évolution de P1 pourrait expliquer l’infiltration ganglionnaire des cellules T clonales et la progression du lymphome. La caractérisation des désordres cytogénétiques et moléculaires des cellules T CD3−CD4+ chez les patients L-SHE permettrait à terme d’identifier de nouveaux marqueurs diagnostiques et contribuer ainsi au développement de nouvelles cibles thérapeutiques dans une grande diversité de pathologies lymphoprolifératives de type Th2.

Le virus humain T lymphotrope de type 1 (HTLV-1) est l'agent étiologique de la leucémie/lymphome T de l'adulte (ATLL) qui se développe après plusieurs décennies et pour laquelle il n'existe à ce jour pas de traitement efficace. Parmi les protéines virales de HTLV-1, Tax et HBZ jouent un rôle déterminant dans le développement de l'ATLL. Si Tax participe au processus leucémogène dès les étapes précoces, HBZ jouerait plutôt un rôle dans le maintien du phénotype tumoral dans les étapes tardives. Dans ce contexte, là nous nous sommes intéressés à la régulation de l'expression des protéines anti-apoptotiques Bfl-1 et Bcl-xL, par les protéines virales Tax et HBZ. Nous avons montré que Tax induit l'expression des protéines anti-apoptotiques Bfl-1 et Bcl-xL de la famille Bcl-2 via la voie NF-B, alors que HBZ n'a aucun effet sur leur expression. De plus, Tax coopère avec les facteurs de transcription c-Jun et JunD de la voie AP-1 pour augmenter l'expression de ces gènes anti-apoptotiques. En revanche, HBZ module uniquement la trans-activation de bfl-1 induite par Tax. L'ensemble de nos résultats indique donc que Tax joue un rôle prépondérant dans l'activation de l'expression de Bfl-1 et de Bcl-xL et suggère que Bfl-1 et Bcl-xL sont exprimées au cours des étapes précoces et tardives du développement de l'ATLL. Par une stratégie d'ARN interférence, nous avons ensuite montré que Bfl-1 et/ou Bcl-xL sont impliquées dans la survie de lignées cellulaires T infectées par HTLV-1, suggérant que Bfl-1 et Bcl-xL représentent des cibles thérapeutiques potentielles pour traiter l'ATLL. Actuellement, il existe des petites molécules ciblant les membres anti-apoptotiques de la famille Bcl-2, mais aucune ne cible spécifiquement Bfl-1. En collaboration avec la société IMAXIO, nous avons identifié par deux cribles à haut débit 83 molécules capables d'inhiber l'activité anti-apoptotique de Bfl-1. L'une de ces molécules induit spécifiquement la mort de lignées cellulaires T infectées par HTLV-1 pour lesquelles Bfl-1 représente un gène de survie. Ainsi, ce travail doit permettre à terme de développer de futurs médicaments dirigés contre Bfl-1 et de proposer une nouvelle stratégie thérapeutique ciblée contre l'ATLL

La variante lymphocytaire du syndrome hyperéosinophilique (L-SHE) est une pathologie extrêmement rare caractérisée par une prolifération monoclonale de lymphocytes T surproduisant l’interleukine IL-5, responsable d’une hyperéosinophilie persistante. En outre, un immunophénotype aberrant CD3−CD4+ est fréquemment observé à la surface des cellules T clonales. Cette pathologie se distingue par une lymphoprolifération chronique indolente habituellement révélée par une hyperéosinophilie sanguine et une infiltration éosinophilique des tissus cutanés. Toutefois, l’évolution vers un lymphome T observée chez certains patients suggère la présence d’un potentiel malin des cellules T. Ce modèle représente donc une rare opportunité d’identifier les changements moléculaires liés aux différentes étapes du processus transformant lymphoïde T.<p>Dans le cadre de ce travail, nous avons cherché à établir les caractéristiques cytogénétiques et moléculaires des cellules T CD3−CD4+ d’une cohorte de patients L-SHE. L’analyse cytogénétique de cellules T CD3−CD4+ isolées au moment du diagnostic chez deux patientes (P1 et P2) a révélé la présence d’une délétion similaire 6q13-q22.1. En étudiant les stades cliniques successifs de P1 et P2, nous avons montré la persistance des cellules porteuses de la délétion 6q au cours de la progression chronique et leur prédominance lors du développement d’un lymphome T chez P1. Ces résultats suggèrent l’implication précoce et potentiellement critique de la délétion 6q dans cette pathologie lymphoproliférative T. L’analyse des dérégulations transcriptionnelles résultant de ce remaniement a montré une réduction de l’expression des gènes pro-apototiques BACH2 et PA26 dans les cellules T CD3−CD4+ de P1 et P2. En particulier, BACH2, dont l’expression diminue continuellement au cours de l’évolution de P1, jouerait un rôle oncosuppresseur dans la lymphogenèse T.<p>Afin d’identifier les modifications moléculaires des cellules T clonales, nous avons analysé l’expression de 95% des gènes humains dans les cellules T CD3−CD4+ de trois patients en phase chronique (P1, P2 et P3). La grande homologie des changements transcriptionnels chez les trois patients indique une altération des mêmes mécanismes moléculaires. Ainsi, un profil immunophénotypique exhaustif, validé chez trois patients supplémentaires, a pu être établi. En outre, les dérégulations des voies apoptotiques, TGFβ ou<p>9<p>encore de signalisation intracellulaire altèrent l’homéostasie des cellules T CD3−CD4+ pouvant favoriser la perte de la capacité apoptotique et/ou la croissance cellulaire. Cette signature moléculaire a été étendue par l’identification de 20 microARNs dont l’expression est dérégulée dans les cellules T CD3−CD4+ d’une cohorte de 6 patients. Par ailleurs, la modification de l’expression des récepteurs impliqués dans la migration leucocytaire au cours de l’évolution de P1 pourrait expliquer l’infiltration ganglionnaire des cellules T clonales et la progression du lymphome.<p>La caractérisation des désordres cytogénétiques et moléculaires des cellules T CD3−CD4+ chez les patients L-SHE permettrait à terme d’identifier de nouveaux marqueurs diagnostiques et contribuer ainsi au développement de nouvelles cibles thérapeutiques dans une grande diversité de pathologies lymphoprolifératives de type Th2. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le virus humain T lymphotrope de type 1 (HTLV-1) est l’agent étiologique de la leucémie/lymphome T de l’adulte (ATLL) qui se développe après plusieurs décennies et pour laquelle il n’existe à ce jour pas de traitement efficace. Parmi les protéines virales de HTLV-1, Tax et HBZ jouent un rôle déterminant dans le développement de l’ATLL. Si Tax participe au processus leucémogène dès les étapes précoces, HBZ jouerait plutôt un rôle dans le maintien du phénotype tumoral dans les étapes tardives. Dans ce contexte, là nous nous sommes intéressés à la régulation de l’expression des protéines anti-apoptotiques Bfl-1 et Bcl-xL, par les protéines virales Tax et HBZ. Nous avons montré que Tax induit l’expression des protéines anti-apoptotiques Bfl-1 et Bcl-xL de la famille Bcl-2 via la voie NF-κB, alors que HBZ n’a aucun effet sur leur expression. De plus, Tax coopère avec les facteurs de transcription c-Jun et JunD de la voie AP-1 pour augmenter l’expression de ces gènes anti-apoptotiques. En revanche, HBZ module uniquement la trans-activation de bfl-1 induite par Tax. L’ensemble de nos résultats indique donc que Tax joue un rôle prépondérant dans l’activation de l’expression de Bfl-1 et de Bcl-xL et suggère que Bfl-1 et Bcl-xL sont exprimées au cours des étapes précoces et tardives du développement de l’ATLL. Par une stratégie d’ARN interférence, nous avons ensuite montré que Bfl-1 et/ou Bcl-xL sont impliquées dans la survie de lignées cellulaires T infectées par HTLV-1, suggérant que Bfl-1 et Bcl-xL représentent des cibles thérapeutiques potentielles pour traiter l’ATLL. Actuellement, il existe des petites molécules ciblant les membres anti-apoptotiques de la famille Bcl-2, mais aucune ne cible spécifiquement Bfl-1. En collaboration avec la société IMAXIO, nous avons identifié par deux cribles à haut débit 83 molécules capables d’inhiber l’activité anti-apoptotique de Bfl-1. L’une de ces molécules induit spécifiquement la mort de lignées cellulaires T infectées par HTLV-1 pour lesquelles Bfl-1 représente un gène de survie. Ainsi, ce travail doit permettre à terme de développer de futurs médicaments dirigés contre Bfl-1 et de proposer une nouvelle stratégie thérapeutique ciblée contre l’ATLL / Human T lymphotropic virus type 1 (HTLV-1) is the etiological agent of adult T-cell leukemia/lymphoma (ATLL) that develops after several decades and for which there is no effective treatment. Among the viral proteins of HTLV-1, Tax and HBZ play a major role in the development of ATLL. If Tax participates in the initiation of leukemogenesis from the early stages, HBZ rather plays a role in maintaining the tumor phenotype in the late stages. The aims of our study were to better understand the regulation of Bfl-1 and Bcl-xL anti-apoptotic protein expression by Tax and HBZ viral proteins, as well as their role in the survival of HTLV-1-infected T-cells to propose new therapeutic strategies. We showed that Tax induces Bfl-1 and Bcl-xL expression via the NF-κB pathway, whereas HBZ has no effect on their expression. Tax also cooperates with c-Jun and JunD transcription factors of AP-1 family to increase the expression of these anti-apoptotic genes. By contrast, HBZ modulates the Tax-induced bfl-1 trans-activation. Altogether, our data indicate that Tax plays a key role in activating Bfl-1 and Bcl-xL expression and suggests that Bfl-1 and Bcl-xL are potentially expressed during the early and the late stages of ATLL development. Using short hairpin RNA strategy, we then showed that Bfl-1 and/or Bcl-xL are involved in HTLV-1-infected T-cell line survival, indicating that Bfl-1 and Bcl-xL represent potential therapeutic targets in the case of ATLL. One approach currently being developed in anti-cancer drug discovery is to search for small inhibitory compounds targeting anti-apoptotic proteins of the Bcl-2 family. But so far, no drug specifically targeting Bfl-1 is available. In collaboration with the IMAXIO Company, we have identified 83 molecules able to inhibit Bfl-1 anti-apoptotic activity using two high-throughput screening. One of these molecules specifically induced the death of HTLV-1-infected T-cell for which Bfl-1 represents a survival gene. This work provides new insight for long-term development of future drugs directed against Bfl-1 and should allow us to propose new therapeutic strategy for ATLL treatment