Adaptive immune response plays a key role in maintaining homeostasis of the organism. T cells use an immense repertoire of T-cell receptors (TCRs) to discriminate between self and foreign antigens with very high sensitivity. Although we have many clues outlining how an ideal TCR repertoire is selected, and a good understanding of the TCR signaling machinery, there are still some key aspects of these processes that remain controversial. The objective of this thesis is to extend our knowledge of the very proximal events of TCR signaling, with special focus on interaction of TCR coreceptors with lymphocyte-specific kinase LCK. Coreceptor-LCK interaction has been described to regulate several aspects of T- cell development and response. We observed dynamic change of this interaction in course of T-cell development. Interestingly, CD4 and CD8 coreceptors displayed differential dynamics of interaction with LCK. Our data suggest that such disparity in coreceptor- LCK interaction leads to selection of more self-reactive TCR repertoire in CD8+ T cells. Moreover, when the highly self-reactive CD8+ T cells get to the periphery, the homeostatic signals drive their differentiation towards a more tolerogenic memory-like phenotype. To finally resolve the role of coreceptor-LCK interaction in the T-cell...

T lymphocytes (T cells) represent one of the major cell populations of the immune system. Named by the place of their development, the thymus, several types can be distinguished as the αβ T cells, the γδ T cells, the mucosa-associated invariant T cells (MAIT), and the natural killer T (NKT) cells. The αβ lineages of CD4+ THelper and the CD8+ T cytotoxic cells with the T cell receptor (TCR) composed of α- and β-chain are major players of the adaptive immune system. In the thymus, CD4+ and CD8+ single positive (SP) αβ cells represent the ultimate result of positive and negative selection of CD4+CD8+ double positive (DP) thymocytes. The DP population derives from the double negative (DN) thymocytes that develop from bone marrow-derived progenitors through different stages (DN1-DN4) that are characterized by CD25 and CD44 surface expression. NFATc1, a member of the Nuclear Factor of Activated T cells (NFAT) transcription factors family, is critically involved in the differentiation and function of T cells. During thymocyte development, the nuclear expression of NFATc1 reaches the highest level at the DN3 (CD44-CD25+) stage. The hematopoietic cell-specific ablation of NFATc1 activity results in an arrest of thymocyte differentiation at the DN1 (CD44+CD25-) stage. On the other hand, over-expression of a constitutively active version of NFATc1 results in an impaired transition of DN3 cells to the DN4 (CD44-CD25-) stage, suggesting that a certain threshold level of NFATc1 activity is critical at this point. ChIP-seq and RNA-seq analysis allowed us the identification of NFATc1/A target genes involved in lineage development as the Tcra and Tcrb gene loci. Furthermore, we identified multiple NFATc1-regulated genes that are involved in γδ T cell development. In the mouse models, Rag1Cre-Nfatc1fl/fl and Rag1Cre-E2fl/fl, in which the activity of NFATc1 or inducible NFATc1 in the latter is impaired during the early stages of thymocyte development, we observed increased numbers of γδ T cells. These γδ T cells showed an unusual overexpression of CD4, a lack of CD24 expression, and overexpression of the anti-apoptotic gene Bcl2a1a. We hypothesize that during the DN stages NFATc1 plays an important role in regulating crucial steps of αβ thymocyte development and when NFATc1 activity is missing this may disturb αβ development resulting in alternative cell fates like γδ T cells. / T-Lymphozyten (T-Zellen) sind eine wichtige Säule des Immunsystems. Benannt nach dem Ort ihrer Entstehung, dem Thymus, werden sie verschiedenen Linien zugeordnet, den αβ-T-Zellen, den γδ-T-Zellen, den Mukosa assoziierten invarianten T-Zellen (MAIT) und den natürlichen Killer T-Zellen (NKT). Bei den αβ-T-Zellen mit einem T-Zell-Rezeptor (TZR) aus α- und β-Kette unterscheidet man die CD4+ Helfer T- von den CD8+ zytotoxischen T-Zellen. Beide sind zentrale Bestandteile des adaptiven Immunsystems. Einfach positive (SP) CD4+ und CD8+ αβ-T-Zellen gehen aus der positiven und negativen Selektion doppelt-positiver (DP) CD4+CD8+ Zellen hervor. Zuvor durchlaufen sie als doppelt-negative (DN) Thymozyten, die von Vorläufern aus dem Knochenmark abstammen, verschiedene Stadien (DN1-DN4), die durch unterschiedliche Expression der Adhäsionsmoleküle CD25 und CD44 gekennzeichnet sind. Der Transkriptionsfaktor NFATc1, ein Mitglied der Familie Nukleärer Faktoren Aktivierter T-Zellen (NFAT), ist maßgeblich an der Differenzierung und der Funktion von T-Zellen beteiligt. Während der Thymozytenenreifung kann eine zunehmende nukleäre Expression von NFATc1 beobachtet werden, die im DN3-Stadium (CD44-CD25+) den höchsten Wert erreicht. Eine Deletion der NFATc1-Aktivität in frühen Vorläuferzellen führte zu einem Arrest der Thymozytendifferenzierung im DN1-Stadium (CD44+CD25-). Andererseits hemmte die Überexpression einer konstitutiv aktiven Form von NFATc1 den Übergang von DN3-Zellen in das DN4-Stadium (CD44-CD25-), was vermuten lässt, dass ein bestimmter Schwellenwert der NFATc1-Aktivität zu diesem Zeitpunkt von entscheidender Bedeutung ist. Mittels ChIP- und RNA-Sequenzierung gelang es, NFATc1-Zielgene im Thymus zu identifizieren. Hierzu zählten unter anderen die Tcra und Tcrb Gene. Transkriptions-analysen an isolierten DN-Thymozyten offenbarten daneben mehrere NFATc1-regulierte Gene, die an der Entwicklung von γδ-T-Zellen beteiligt sind. In den Mausmodellen, Rag1Cre-Nfatc1fl/fl und Rag1Cre-E2fl/fl, bei denen die Aktivität von NFATc1 bzw. der induzierbaren NFATc1-Aktivität zu frühen Stadien der Thymozytenentwicklung beeinträchtigt ist, stieg die Zahl von γδ-T-Zellen an. Diese γδ-T-Zellen zeigen eine unübliche Überexpression des CD4 Markers, eine fehlende Expression des Oberflächenmarkers CD24 und eine Überexpression des antiapoptotischen Gens Bcl2a1a. Wir vermuten daher, dass NFATc1 an der erfolgreichen Reifung von αβ-T-Zellen direkt beteiligt ist und fehlende NFATc1-Aktivität die Entwicklung alternativer Linien wie von γδ-T-Zellen befördert.

The defense against invading pathogens is, amongst other things, mediated via the action of antibodies. Class-switched antibodies and antibodies of high affinity are produced by plasma cells descending from germinal center B (GCB) cells. GCB cells develop in the germinal center (GC), a specialized microstructure found in the B-cell follicle of secondary lymphoid organs. GCB-cell maturation and proliferation are supported by follicular T- helper (Tfh) cells. On the other hand, follicular regulatory T (Tfr) cells control this process in quantity and quality preventing, for instance, the formation of autoantibodies directed against endogenous structures. The development of GCB, Tfh and Tfr cells essentially depends on the migration into the GC, which is mediated via the expression of the chemokine receptor CXCR5. One transcription factor highly expressed in follicular T cells, comprising Tfh and Tfr cells, is NFATc1. Tfr cells additionally express the transcriptional repressor Blimp-1, which is not expressed in Tfh cells. We found that NFATc1 is transactivating Cxcr5 via response elements in the promoter and enhancer in vitro. Blimp-1 binds to the same elements, transactivating Cxcr5 expression in cooperation with NFATc1, whilst mediating Cxcr5- repression on its own. In Tfr cells Blimp-1 suppresses CXCR5 expression in the absence of NFATc1. Blimp-1 itself is necessary to restrict Tfr-cell frequencies and to mediate Tfr- cell function as in mice with Blimp-1-ablated Tregs high frequencies of Tfr cells do not reduce GCB- or Tfh cell frequencies. NFATc1 and Blimp-1 double deficient Tfr cells show additional loss of function, which becomes visible in clearly expanded antibody titers. To evaluate the function of NFATc1 in Tfr cells, we not only deleted it, but also overexpressed a constitutive active form of NFATc1/aA (caNFATc1/aA) in regulatory T cells (Tregs). The latter is leading to an upregulation of CXCR5 per cell, without changing Tfh or Tfr-cell frequencies. However, the high density of surface CXCR5 enhances the migration of Tfr cells deep into the GC, which results in a tighter control of the antigen- specific humoral immune response. Additionally, caNFATc1/aA increases the expression of genes coding for Tfr effector molecules like Il1rn, Il10, Tigit and Ctla4. Interestingly, this part of the transcriptional change is dependent on the presence of Blimp-1. Furthermore, Blimp-1 regulates the expression of multiple chemokine receptor genes on the background of caNFATc1/aA. In contrast, when caNFATc1/aA is overexpressed in all T cells, the frequencies of Tfh- and GCB cells are dominantly reduced. This effect seems to stem from the conventional T- cell (Tcon) side, most probably originating from increased secretion of interleukin-2 (IL- 2) via the caNFATc1/aA overexpressing Tcons. IL-2 is known to hinder the germinal center reaction (GCR) and it might in its abundance not be neutralizable by Tfr cells. Taken together, NFATc1 and Blimp-1 cooperate to control the migration of Tfr cells into the GC. Tfr cells in the GC depend on NFATc1 and Blimp-1 to perform their proper function. Overexpression of caNFATc1 in Tregs strengthens Tfr function in a Blimp-1-dependent manner, whilst overexpression of caNFATc1 in all T cells dominantly diminishes the GCR. / Die Abwehr von Krankheitserregern durch das Immunsystem wird unter anderem (u.a.) durch die Wirkung von Antikörpern vermittelt. Antikörper, welche einen Klassenwechsel und eine hohe Affinität aufweisen, werden von Plasmazellen gebildet, welche sich von Keimzentrums-B (GCB) -Zellen ableiten. GCB-Zellen evolvieren innerhalb des Keimzentrums (GC), einer Mikrostruktur, welche sich innerhalb des B-Zellfollikels sekundärer lymphoider Organe bildet. Die GCB-Zell-Reifung und -Proliferation wird durch follikuläre T-Helfer (Tfh) -Zellen unterstützt und durch follikuläre regulatorische T (Tfr) -Zellen kontrolliert, wodurch u.a. die Bildung von Autoantikörpern, welche körpereigene Strukturen angreifen, unterbunden wird. Die Entwicklung von GCB-, Tfh- und Tfr-Zellen ist in entscheidender Weise abhängig von der Expression des Chemokinrezeptors CXCR5 und der damit verbundenen Migration in das GC. NFATc1 ist ein Transkriptionsfaktor, welcher in follikulären T-Zellen, bestehend aus Tfh- und Tfr-Zellen, stark exprimiert wird. Im Gegensatz zu Tfh-Zellen exprimieren Tfr-Zellen zusätzlich den Transkriptionsrepressor Blimp-1. Wir haben herausgefunden, dass NFATc1 die Expression von Cxcr5 über die Bindung an Elemente innerhalb des Cxcr5-Promotors und -Enhancers in vitro transakiviert. Blimp-1 bindet an selbige Elemente und transaktiviert in Kooperation mit NFATc1 die Cxcr5-Expression, während es die Cxcr5- Expression alleine hemmt. In Tfr-Zellen supprimiert Blimp-1 die CXCR5-Expression in Abwesenheit von NFATc1. Blimp-1 beschränkt darüber hinaus das Vorkommen von Tfr-Zellen und spielt eine Rolle in der Effektorfunktion von Tfr-Zellen. Dies wird deutlich da das verstärkte Tfr-Zell-Vorkommen in Mäusen mit Blimp-1 defizienten Tregs nicht zu einer Reduktion der GCB-oder Tfh-Zellen führt. Der Verlust der Effektorfunktion akkumuliert in NFATc1 und Blimp-1 doppel-defizienten Tfr-Zellen, was sich in einem deutlichen Anstieg der Antikörpertiter im Serum immunisierter Tiere zeigt. Zur Überprüfung der Funktion von NFATc1 in Tfr-Zellen untersuchten wir sowohl dessen Deletion, als auch die Überexpression einer konstitutiv aktiven Form von NFATc1/aA (caNFATc1/aA) in regulatorischen T-Zellen (Tregs). Letztere steigert die CXCR5- Expression pro Zelle ohne das Vorkommen von Tfh- oder Tfr-Zellen zu verändern. Jedoch führte die erhöhte Oberflächenexpression von CXCR5 zu einer verstärkten Migration der Tfr-Zellen in das GC, was in einer verstärkten Kontrolle der antigenspezifischen Antikörpertiter resultierte. Darüber hinaus erhöht caNFATc1/aA in Abhängigkeit von Blimp-1, die Expression der Gene Il1rn, Il10, Tigit und Ctla4, welche mit der Effektorfunktion von Tfr-Zellen assoziiert werden. Blimp-1 wirkt auf dem Hintergrund der Überexpression von NFATc1 vor allem regulierend auf die Expression von Chemokinrezeptorgenen. Im Gegensatz zur Überexpression von caNFATc1/aA in Tregs allein, führt selbige Veränderung in allen T-Zellen zu einer deutlichen Reduktion des Vorkommens von Tfh- und GCB-Zellen nach Immunisierung. Dieser Effekt scheint durch konventionelle T-Zellen (Tcons) vermittelt zu sein und entsteht vermutlich durch eine erhöhte Sekretion von Interleukin-2 (IL-2) durch die caNFATc1/aA überexprimierenden Tcons. Dieses IL-2 scheint in seiner Menge nicht durch die vorliegenden Tfr-Zellen neutralisierbar zu sein und die Keimzentrumsreaktion (GCR) zu hemmen. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass NFATc1 und Blimp-1 kooperieren, um die Migration von Tfr-Zellen in das GC zu kontrollieren. Tfr-Zellen im GC sind in der Erfüllung ihrer ordnungsgemäßen Funktion abhängig von NFATc1 und Blimp-1. Die Überexpression von caNFATc1 in Tregs stärkt die Funktion von Tfr-Zellen in einer Blimp-1-abhängigen Weise, während die Überexpression von caNFATc1 in allen T-Zellen die GCR extrem minimiert.

Introduction: Manipulation of the immune system to eliminate cancer, known as cancer immunotherapy, is an emerging field that has shown impressive clinical success and promise. Adoptive transfer of T cells engineered for tumor reactivity is an avenue of therapy for patients with previously untreatable disease. Our lab has developed a novel chimeric receptor, called a T cell antigen coupler (TAC), which redirects T cell cytotoxicity towards a tumor target. Although considerably effective, this receptor does not provide T cell costimulation necessary for optimal anti-tumor effectiveness. Methods: We explored two methods to deliver costimulation to TAC-engineered T cells. First, we designed a receptor to be utilized in conjunction with the TAC in a dual receptor system. This chimeric costimulatory receptor (CCR) was generated by fusion of the T cell TIGIT and CD28 receptors. In our second approach, we investigated direct incorporation of costimulatory domains into the TAC design. To do so, we substituted in regions from the CD28 or 4-1BB costimulatory receptors. Results: Three TIGIT/CD28 chimeras were successfully generated. Of these, two were well surface-expressed on primary human T cells. Despite testing of these receptors in several biological assays, we were unable to confirm functionality of these receptors in transmitting CD28 signals. We next generated the 4-1BB and CD28TAC variants. The 4-1BBTAC was poorly surface-expressed M.Sc Thesis – Arya Afsahi McMaster University – Medical Sciences iv and was difficult to introduce into T cells at high efficiency. The CD28TAC-variant was virtually absent from the T cell surface membrane. Further analysis indicated that the CD28TAC was retained in the endoplasmic reticulum (ER) and the 4-1BBTAC was produced at an extremely low amount. Conclusions: Our investigation into delivery of costimulation through a novel CCR or TAC receptor was inconclusive. We recommend several optimizations to both receptor design and experimental analysis to further elucidate the potential of these receptors. / Thesis / Master of Science (MSc)

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Protocole d'entente entre l'Université Laval et l'Université du Québec à Chicoutimi / L’asthme est une maladie respiratoire chronique impliquant de l’inflammation, de l’hyperréactivité bronchique et un remodelage des voies respiratoires. Il s’agit d’un trait complexe résultant d’interactions entre des facteurs génétiques et environnementaux. La portion génétique de l’asthme a été bien décrite, avec une héritabilité estimée jusqu’à 60% selon les études. Une portion de l’héritabilité manquante dans l’asthme pourrait être expliquée par des facteurs épigénétiques, comme la méthylation de l’ADN. Comme la méthylation est spécifique à chaque tissu, il est logique d’étudier des cellules ayant un rôle important dans l’asthme. C’est le cas des lymphocytes T CD4+ qui contribuent activement à la pathophysiologie de l’asthme. L’objectif du présent projet était donc d’étudier les lymphocytes T CD4+ dans un contexte d’asthme, plus particulièrement leur patron de méthylation ainsi que leur patron d’expression. Ces lymphocytes ont été isolés du sang de plus de 200 individus faisant partie de la Cohorte familiale d’asthme du Saguenay–Lac-Saint-Jean. La méthylation et l’expression a ensuite été mesurée par séquençage. Après des contrôles de qualité, des données étaient disponibles pour 173 individus (107 asthmatiques, 66 témoins). Il a ainsi été possible d’identifier 2 146 sites CpG différemment méthylés chez les asthmatiques et 3 756 chez les asthmatiques allergiques (FDR≤0,05, -meth ≥ 5%). Pour l’expression, 57 et 33 gènes sont différemment exprimés chez les asthmatiques et les asthmatiques allergiques, respectivement (FDR≤0,05). L’intégration des données génétique et d’expression ont permis d’identifier 2 253 eQTL significatifs (FDR≤0,049). Ces résultats ont permis d’identifier l’implication de la voie de NF-B ainsi que celle de l’IL-17 et -25 dans ces cellules, mais aussi l’implication de la famille de chemokine CXC et de EGF. En somme, cette étude a permis de caractériser plus précisément un type cellulaire dans l’asthme, toujours dans le but de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents impliqués dans cette condition.

Les préparations thérapeutiques d'immunoglobulines humaines (IglV) sont utilisées depuis plusieurs années dans le traitement des maladies auto-immunes. Selon certaines études, l'effet immuno-régulateur des IglV pourrait être attribuable à leur capacité d'induire la modulation de cytokines impliquées dans la régulation des leucocytes et la réponse immunitaire. Or, les mécanismes attribuables à ces modulations demeurent mal compris et controversés. Afin de faire la lumière sur ce sujet, nous avons d'abord analysé l'effet des IglV sur l'expression de plusieurs cytokines cibles dans un modèle murin de thrombocytopenic immune (PTI), une maladie auto-immune caractérisée par le développement d'auto-anticorps et la destruction des plaquettes opsonisées par phagocytose. Selon nos résultats, l'injection d'IglV permet, tel qu'il est observé chez l'humain, de réduire la destruction des plaquettes induite dans le modèle de PTI murin. Cependant, aucune modulation significative des cytokines mesurées n'a été observée dans ce modèle. D'autre part, en bloquant la phagocytose des plaquettes dans la PTI, les IglV pourraient avoir une incidence sur la présentation antigénique CMH-II dépendante et affecter à long terme la réponse auto-immune et celle de cytokines associées à l'activation des lymphocytes T CD4+. Nous avons donc évalué l'effet des IglV sur la réponse immune adaptative humorale à l'aide de souris immunisées à l'ovalbumine (OVA) et caractérisé leur effet sur l'activation des lymphocytes T à partir d'un modèle de présentation antigénique. Selon nos résultats chez la souris, l'injection d'IglV réduit la production d'anticorps spécifiques de 50% et la sécrétion de cytokines reliées à l'activation des lymphocytes T CD4+ OVA spécifiques dont 1TL-2, 1TL-4, l'IFN-y et 1TL-10. De plus, nous avons démontré que les IglV bloquaient la présentation antigénique chez les cellules présentatrice d'antigènes (CPAs) : d'une part, les IglV, par le blocage des récepteurs Fc, empêchent l'internalisation d'antigènes sous forme de complexes immuns chez la CPA et d'autre part, les IglV réduisent la présentation d'antigènes natifs par un mécanisme de compétition intracellulaire. Donc, en réduisant la présentation antigénique chez les CPAs, les IglV pourraient alors inhiber l'activation de lymphocytes T CD4 + auto-réactifs et la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires impliquées dans le développement de maladies auto-immunes comme la PTI.

Le rôle primordial des cellules de la peau dans la réponse immunitaire est désormais bien établi. Cependant, pourraient-elles également être responsables de l'activation du système immunitaire observée dans le psoriasis, une maladie inflammatoire chronique de la peau? Cette étude vise à comprendre la capacité des kératinocytes psoriasiques à activer in vitro les leucocytes. Le profil de sécrétion de lymphocytes sains co-cultivés avec des kératinocytes (sains ou psoriasiques) a été évalué pour 22 analytes. Les taux élevés de diverses cytokines dans les cultures avec kératinocytes psoriasiques démontrent leur capacité à induire une sécrétion de médiateurs pro-inflammatoires. Les cytokines surexprimées suggèrent également un potentiel d'activation des neutrophiles. L'altération in vitro de plusieurs fonctions des neutrophiles (survie, adhérence cellulaire et production d'anion superoxyde) par les kératinocytes a permis de confirmer ce potentiel. En conclusion, cette étude présente le kératinocyte psoriasique comme étant un instigateur probable de l'inflammation dans la pathogenèse de cette maladie.

Glycoscience is important in many areas such as human health, energy and material science. Glycans have been shown to be involved in the pathophysiology of almost every major disease. Additional glycan structure knowledge is required to help advance personal medicine, and pharmaceutical developments, among others. For glycoscience to advance there is a need for large quantities of well-defined glycans and have quick access to glycosyltransferases for manipulating glycan synthesis. Herein, we will cover our efforts on studying the substrate specificities of human glycosyltransferases such as FUT8 and Gn-T V, and their application on N-glycan synthesis. Complex asymmetric N-glycan isomer structures have been related to many diseases such as breast cancer, among others. Synthesis of complex asymmetric N-glycan isomer structures including: alpha-1,6 core-fucosylated, and tri-antennary structures can be achieved by taking advantage of the high specificity of glycosyltransferases that can work as unique catalyst to generate well-defined glycan structures.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.