Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2014-02-27T18:21:59Z No. of bitstreams: 1 Claire SS CD8+ granzyme b...pdf: 4914876 bytes, checksum: e54c8737a502be3105cd578fa7d10ef4 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-02-27T18:21:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Claire SS CD8+ granzyme b...pdf: 4914876 bytes, checksum: e54c8737a502be3105cd578fa7d10ef4 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / Universidade Federal da Bahia. Faculdade de Medicina. Salvador, BA, Brasil / Células T CD8+ são essenCIaIS na defesa contra vírus, mas pouco se sabe sobre a sua participação na defesa do hospedeiro contra parasitas, como a Leishmania. Nesse trabalho, investigou-se a participação das células T CD8+ no processo inflamatório e na indução da morte do parasita, bem como os perfis proteômicos das lesões dos pacientes com leishmaniose cutânea localizada (LCL) infectados por L. braziliensis. Observa-se uma alta porcentagem de células T CD8+ nas lesões dos pacientes com LCL, como sugerido pela maior frequência de células T CD8+CD45RO+ e células T CD8+CLA + em comparação com CMSP do próprio indivíduo. Após re-estimulação com L. braziliensis, a maioria das células T CD8+ presentes na lesão expressam marcadores citolíticos, CD 107a e Granzima B. Além disso, a co-cultura de macrófagos infectados com linfócitos T CD8+ resultou na libertação de granzima B. A utilização do inibidor da granzima B, assim como Z-V AO, Fas:Fc ou anti­ IFN-y não teve nenhum efeito sobre a morte do parasita. Por outro lado, a co-cultura de macrófagos infectados com células T CD4+ diminuiu a taxa de infecção, efeito que foi completamente revertido ao se utilizar o anti-IFN-y, enfatizando o papel determinante de células T CD4+IFN-/ na morte da Leishmania. Além disso, observou-se um total de 150 proteínas diferencialmente expressas entre as lesões de pacientes com LCL e as amostras de pele normal. Destas, cinquenta e nove proteínas foram identificadas. Entre elas, 13 apresentaram uma maior ou menor expressão nas amostras dos pacientes em relação a pele normal. Vinte e sete proteínas foram encontradas somente nas lesões dos pacientes e 18 somente nas amostras de pele normal. Essas proteínas foram associadas com processos de regulação biológica; incluindo apoptose, ciclo celular e resposta imune. Para explorar as interações entre as proteínas identificadas e as proteínas e os genes que poderiam ser afetados por elas, redes e sub-redes de interações foram geradas. Após análises de imuno-histoquímica, a presença de caspas e 9, caspase-3 e granzima B foi validada no sítio da lesão. A expressão da granzima B nas lesões dos pacientes correlacionou-se positivamente com a expressão da caspase 9 e a porcentagem de células positivas para TUNEL. Observou-se também uma maior porcentagem de células postivas para TUNEL expressando granzima B nas biópsias dos pacientes que apresentam um processo mais intenso de necrose. Além disso, a presença de granzime B, caspase 9 e caspase-3 foram correlacionados positivamente com o tamanho da, lesão. Neste estudo, podemos concluir que as células T CD8+Granzima B+ estão envolvidas na patogênese da L. braziliensis, através da ativação da apoptose no sítio inflamatório, favorecendo a progressão do dano tecidual observado nos pacientes com LCL. / CD8+ T cells are essential in the defense against virus, but little is known of their participation in the host defense against parasites, such as Leishmania. In the present study, we investigated the participation of CD8+ T cells in the inflammatory process and parasite killing, as well as proteome profiles in the biopsies from localized cutaneous leishmaniasis patients (LCL) infected by L. brazliensis. We found a higher percentage of CD8+ T cells in lesions of LCL patients, as suggested by the higher frequency of CD8+CD45RO+T cells and CD8+CLA +T cells compared to PBMC. Upon L. braziliensis-restimulation, most of CD8+T cells from the lesion expressed cytolytic markers, CDI07a and Granzyme B. Furthermore, co-culture of infected macrophages and CD8+T lymphocytes resuIted in release of granzyme B and the use of granzyme B inhibitor, as well as z-V AD, Fas:Fc or anti-IFN-y had no effect upon parasite killing. On the other hand, co-culture of infected macrophages with CD4+T cells strongly increased parasite killing, which was completely reversed by anti-IFN-y, pointing out the decisive role of CD4+IFN-y +T cells in parasite killing. Besides that, a total of 150 differentially expressed proteins were observed in the lesions of LCL patients and normal skin. Fifty-nine proteins were identified. Among them, 13 were up or down regulated in LCL lesions compared to normal skin, 27 proteins were unique in the lesions of LCL patients and 18 were unique in the normal skin samples. These proteins were associated with biological regulation, including apoptosis, cell cycle and immune response. To explore interactions between the identified proteins and proteins and genes that may be affected by them, networks and subnetworks were generated. After immunohistochemistry analyses, the presence of casp~~e 9, caspase 3 and granzyme B were validated in the lesions site. Granzyme B expression in the lesions of LCL patients positively correlated with caspase 9 expression and the percentage of TUNEL-positive cells. We also observed a significant higher percentage of TUNEL-positive cells and granzyme B expression in the biopsies of patients showing a more intense necrotic processo Besides that, the presence of granzime B, caspase 9 and caspas e 3 were positively correlated with the lesion size. In this study we can conclude that CD8+ Granzyme B+T cells are involved in the pathogenesis of L. braziliensis due to their cytotoxic potential to induce apoptotic mechanism in the inflammatory site that favors the progression oftissue damage observed in LCL patients.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Embora esteja bem estabelecido, há mais de quinze anos, que linfócitos T CD8+ restritos por moléculas de MHC-Ia são importantes no controle da parasitemia e sobrevivência de camundongos infectados com Trypanosoma cruzi, pouco se sabia da especificidade desses linfócitos. A ausência de epítopos bem definidos impedia o estudo detalhado da cinética da resposta imune e dos mecanismos de controle da imunodominância. Assim, o objetivo inicial desta tese foi a identificação de epítopos reconhecidos pelos linfócitos T CD8+ ativados durante a infecção pelo T. cruzi. Uma vez definidos esses epítopos, estudamos a cinética de ativação dessas células e alguns dos parâmetros que a controlavam. Por fim, estudamos os possíveis mecanismos de imunodominância durante a resposta imune. Durante a infecção experimental com a cepa Y de T. cruzi, nós observamos que os epítopos VNHRFTLV, IYNVGQVSI ou TEWETGQI foram reconhecidos por camundongos infectados C57BL/6, BALB/c ou B10.A, respectivamente. Esses epítopos, expressos por membros da família das trans-sialidases, geraram forte resposta imune medida pela citotoxicidade in vivo ou pela produção de IFN-γ ex vivo (Elispot). A cinética da ativação desses linfócitos T CD8+ se iniciou no pico da parasitemia e dependeu da carga parasitária. Ou seja, quanto mais tempo a parasitemia demorou para atingir o pico, mais lenta foi a aparição das células específicas. Uma vez que a resposta chegou ao máximo, essa se manteve alta por meses e só então começou a declinar lentamente. O fenótipo dos linfócitos T CD8+ específicos de memória é CD62Llow, característico de células de memória efetoras. Tanto a cinética, quanto o fenótipo dessas células diferiram dos achados observados para vírus, bactérias e outros protozoários intracelulares. Em animais previamente vacinados com DNA plasmidial ou proteínas recombinantes, uma significativa aceleração da resposta imune específica foi observada, a qual correlacionou com a imunidade protetora. A fim de estudarmos os fatores que contribuíram para ativação dessas células, nós utilizamos camundongos geneticamente deficientes. Observamos que a deficiência para a produção de IL-12 e Interferon tipo I não causou nenhuma redução na geração das células citotóxicas específicas. O mesmo foi observado em animais deficientes para os receptores do tipo Toll 2, 4 ou 9. Por outro lado, animais geneticamente deficientes que não expressavam as moléculas de MHC-II ou CD4 apresentaram significativa redução na resposta específica de linfócitos T citotóxicos. O estudo dos mecanismos que controlam a imundominância da resposta imune mediada por linfócitos T CD8+ específicos foi feito, inicialmente, pela comparação da resposta imune em camundongos C57BL/6. Observamos que a resposta imune para o epítopo VNHRFTLV foi imunodominante sobre os demais epítopos restritos pelo MHC-Ia H-2Kb . A fim de determinar se essa imunodominância poderia ser exercida sobre epítopos restritos por MHC-Ia H-2Kk (TEWETGQI) ou H- 2Kd (IYNVGQVSI), comparamos as respostas imunes em camundongos infectados homozigotos e heterozigotos. No caso do epítopo VNHRFTLV, nós observamos que a resposta imune se manteve alta em ambas as linhagens de camundongo. Já no caso dos dois outros epítopos restritos por MHC-Ia, H-2Kk ou H-2Kd , observamos uma significativa redução na resposta imune dos animais heterozigotos em relação aos homozigotos. Essa competição não foi dependente do tempo ou da dose de parasitas inoculados. Também não foi observada quando os animais foram imunizados com adenovírus recombinantes contendo esses mesmos epítopos. O mais importante foi observar que a imunodominância pode ser evitada quando duas cepas de parasitas, contendo epítopos imundominantes distintos, foram utilizadas simultaneamente para infecção, sugerindo que há uma competição pelas células apresentadoras de antígenos durante o “priming”. Esse mecanismo de imundominância reduz a magnitude e o repertório da resposta imune e pode ser um mecanismo sofisticado de escape do parasita para evitar a eliminação completa pelos mecanismos efetores do hospedeiro. / Although it is well established for more than 15 years that CD8+ lymphocytes restricted by MHC-Ia molecules are important for the control of the parasitemia and survival during rodent infection with Trypanosoma cruzi, little was known about the specificity of these lymphocytes. The lack of well defined epitopes hindered the detailed study of the kinetic of the immune response and the mechanisms of control of the immunodominance. Therefore, the initial objective of this thesis, was to identify epitopes recognized by CD8+ T lymphocytes activated during the T. cruzi infection. Once we defined these epitopes, we studied the kinetics of activation of these cells and some of the parameters that controlled it. Finally, it was possible to study the mechanisms of immunodominance during the immune response. During the experimental infection with Y strain of T. cruzi, we observed that the epitopes VNHRFTLV, IYNVGQVSI or TEWETGQI were recognized by C57BL/6, BALB/c or B10.A infected mice, respectively. These epitopes, expressed by members of the trans-sialidase family of surface proteins, generated strong immune response as measured by the in vivo cytotoxicity or by the production of interferon-γ (Elispot). The kinetics of the activation of these CD8+ T cells initiated on the peak of parasitemia and depended on the parasite load. The longer delayed the parasitemia to reach its peak, slower was the appearance of these specific T cells. When the immune response reached the maximum, it was kept high for months and then, it declined slowly. The phenotype of memory CD8+ T lymphocytes was CD62LLow characteristic of effector memory cells. The kinetic one and phenotype of these cells had differed from the findings observed for other intracellular viruses, bacteria and protozoan parasites. In animals previously vaccinated with plasmidial DNA or recombinant proteins, a significant acceleration of the specific immune response was observed that correlated with the protective immunity. To study the factors that contributed for the activation of these cells, we used genetically deficient mice. We observed that deficiency for production of IL-12 and Interferon type I did not cause any reduction in the specific cytotoxic response. The same was observed in animals deficient for the Toll-like receptors 2, 4 or 9. On the other hand, genetically deficient animals that did not express MHC-II or CD4 molecules had significant reduction in the cytotoxic response mediated by CD8+ T cells. Finally, we described that following infection of mice with T. cruzi, an immunodominant CD8+ T cell immune response was developed directed to the epitope VNHRFTLV. To determine whether this immunodominance was exerted over other non H-2Kb -restricted epitopes, we measured during infection of heterozygote mice, immune responses to three distinct epitopes, all expressed by members of the trans-sialidase family, recognized by H-2Kb , H-2Kk (TEWETGQI), or H-2Kd (IYNVGQVSI)- restricted CD8+ T cells. Infected heterozygote or homozygote mice displayed comparably strong immune responses to the H-2Kb -restricted immunodominant epitope. In contrast, H-2Kk or H-2Kd -restricted immune responses were significantly impaired in heterozygote infected mice when compared to homozygote ones. This interference was not dependent on the dose of parasite or the timing of infection. Also, it was not seen in heterozygote mice immunized with recombinant adenoviruses expressing T. cruzi antigens. Finally, we observed that the immunodominance was circumvented by concomitant infection with two T. cruzi strains containing distinct immunodominant epitopes, suggesting that the operating mechanism most likely involves competition of T cells for limiting APCs. This type of interference never described during infection with a human parasite may represent a sophisticated strategy to restrict priming of CD8+ T cells of distinct specificities, avoiding complete pathogen elimination by host effector cells, and thus favoring host parasitism. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Seminario de Título entregado a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al Grado de Magister en Ciencias Biológicas. / El sistema nervioso y el sistema inmune se encuentran íntimamente relacionados comunicándose bidireccionalmente mediante citoquinas, neuropéptidos y neurotransmisores, como la dopamina. Este neurotransmisor ejerce su efecto a través de cinco receptores dopaminérgicos que poseen diferentes grados de afinidad, contando con la mayor afinidad el receptor 3 (D3R). Su presencia se ha reportado en diferentes células del sistema inmune. La estimulación del D3R promueve la producción de IFN-γ en linfocitos T CD4+, favoreciendo su diferenciación a un perfil Th1. Sin embargo, el rol de este receptor en los linfocitos T CD8+ aún no se ha estudiado a cabalidad. En esta tesis se estudió la incidencia del D3R en la formación del perfil citotóxico en linfocitos T CD8+, que poseen un TCR transgénico específico para el péptido OVA(257-264) alojado sobre el MHC de clase I H2-Kb (linfocitos OT-I). La diferenciación in vitro muestra que la carencia del D3R en linfocitos OT-I (OT-I D3RKO) resulta en una reducción significativa en la producción de IFN-γ, TNF-α, IL-2 y en la expresión de CD25 (cadena α del receptor de IL-2) en respuesta a la estimulación con péptido OVA(257-264). Estas deficiencias se revierten al añadir IL-2 exógena a los cultivos, sugiriendo que el mecanismo de acción por el cual el D3R favorece la diferenciación hacia un fenotipo efector productor de IFN-γ y TNF- α ocurre a través de la producción de IL-2. Concordante con lo anterior, se observó que la expresión del D3R en linfocitos OT-I promueve la expansión clonal y la protección antitumoral frente a melanoma. En conjunto los resultados obtenidos en linfocitos T CD8+ sugieren que el D3R promueve la formación de un perfil citotóxico, induciendo la producción de IFN-γ y favoreciendo una alta tasa de expansión clonal, lo que conlleva a una mayor sobrevida frente a un desafío tumoral. / The nervous system and the immune system are intimately related, communicating bi-directionally through cytokines, neuropeptides and neurotransmitters. Dopamine is a neurotransmitter that exerts its effect through five dopaminergic receptors which display different degrees of affinity. The D3R, which display the highest affinity for dopamine, has been found expressed in CD4+ T cells, where its stimulation promotes high production of IFN-γ, favoring the acquisition of the Th1 profile. However, the role of this receptor in CD8+ T lymphocytes has not yet been fully studied. In this thesis the role of D3R in the acquisition of the cytotoxic profile by CD8+ T lymphocytes was studied. For this purpose, in this thesis CD8+ T-cells bearing a transgenic TCR specific for the recognition of the OVA peptide(257-264) over the class I MHC H2-Kb (OT-I lymphocytes) were used. In vitro differentiation experiments show that lack of D3R in OT-I lymphocytes (OT-I D3RKO) results in a significant reduction in the production of IFN-γ, TNF-α and on the expression of CD25 (α chain of the IL-2 receptor) in response to the stimulation with OVA peptide(257-264). These effects were reversed by adding exogenous IL-2 into the cultures, suggesting a mechanism by which D3R favors the differentiation towards an effector phenotype through the production of IL-2. In vivo experiments show that D3R expressed on OT-I lymphocytes favors a higher clonal expansion and thereby an stronger protection against melanoma tumors. The results obtained suggest that D3R promotes the formation of a more efficient cytotoxic profile capable of producing higher percentages of IFN-γ and higher rates of clonal expansion, which leads to greater survival in the face of a tumor challenge. / Junio 2020

Os receptores do tipo Toll compreendem a família de receptores de reconhecimento de padrões melhor caracterizados, que podem ativar diferentes respostas imunes, dependendo de quais receptores e conjuntos de adaptadores são utilizados. Os TLRs, como TLR2, TLR4 e TLR9, e sua sinalização foram implicados no reconhecimento de P. brasiliensis e na regulação da resposta imune, no entanto, o papel do TLR3 ainda não está claro. Assim, a compreensão da função endossomal do TLR3 na PCM experimental é crucial. Utilizamos modelos in vitro e in vivo de infecção por P. brasiliensis, camundongos C57Bl/6 e TLR3-/-, para avaliar a contribuição da TLR3 no desenvolvimento da infecção. Mostramos que ausência de TLR3 leva o aumento de óxido nítrico e a capacidade fagocítica por macrófagos nas primeiras 4 horas de interação com leveduras P. brasiliensis. Mostramos ainda que os camundongos TLR3-/- desempenham papel protetor após 30 dias de infecção intratraqueal com P. brasiliensis, mostrando diminuição do aumento de CFU, perfil de resposta Th1 e Th17, bem como aumento de células citotóxicas T CD8+ produtoras de IFN-γ e IL-17. As células citotóxicas T CD8+ mostraram ser essenciais para o controle da infecção nos camundongos TLR3-/-, uma vez que a depleção dessas células levou a progressão da doença. Em estágios iniciais, 3 e 5 dias de infecção, observamos aumento do recrutamento de neutrófilos para o pulmão. Estudos recentes indicam que o TLR3 é um receptor importante para a resposta imune na micose e sua ausência favorece a infecção por fungos. Em contraste, nossos resultados mostram que, no caso do PCM, o TLR3 é prejudicial ao hospedeiro, sugerindo que a ativação do TLR3 pode ser um possível mecanismo de escape de P. brasiliensis. / Toll-like receptors comprise the best-characterized pattern-recognition receptor family that can activate different immune responses, depending on which receptor and adaptor set are utilized. TLRs, such as TLR2, TLR4 and TLR9, and their signaling have been implicated in the recognition of P. brasiliensis and regulation of the immune response, however, the role of TLR3 remains unclear. Thus, understanding the endosomal function of TLR3 in experimental PCM is crucial. We used in vitro and in vivo models of infection by P. brasiliensis, C57Bl/6 and TLR3-/- mice, to assess the contribution of TLR3 on development of infection. We show that absence of TLR3 leads to increased nitric oxide and phagocytic capacity by macrophages in the first 4 hours of interaction with yeasts P. brasiliensis. We also showed that TLR3-/- mice play a protective role after 30 days of intratracheal infection with P. brasiliensis, showing a decrease in the CFU increase, Th1 and Th17 response profile, as well as an increase in cytotoxic CD8+ cells producing IFN-γ and IL-17. The cytotoxic T CD8+ cells were shown to be essential for the control of infection in TLR3-/- mice, since the depletion of these cells led to the progression of the disease. In the initial stages, 3 and 5 days of infection, we observed increased recruitment of neutrophils to the lung. Recent studies indicate that TLR3 is an important receptor for the immune response in mycosis and its absence favors fungal infection. In contrast, our results show that in the case of PCM, TLR3 is detrimental to the host, suggesting that TLR3 activation may be a possible escape mechanism of P. brasiliensis.

Os receptores do tipo Toll compreendem a família de receptores de reconhecimento de padrões melhor caracterizados, que podem ativar diferentes respostas imunes, dependendo de quais receptores e conjuntos de adaptadores são utilizados. Os TLRs, como TLR2, TLR4 e TLR9, e sua sinalização foram implicados no reconhecimento de P. brasiliensis e na regulação da resposta imune, no entanto, o papel do TLR3 ainda não está claro. Assim, a compreensão da função endossomal do TLR3 na PCM experimental é crucial. Utilizamos modelos in vitro e in vivo de infecção por P. brasiliensis, camundongos C57Bl/6 e TLR3-/-, para avaliar a contribuição da TLR3 no desenvolvimento da infecção. Mostramos que ausência de TLR3 leva o aumento de óxido nítrico e a capacidade fagocítica por macrófagos nas primeiras 4 horas de interação com leveduras P. brasiliensis. Mostramos ainda que os camundongos TLR3-/- desempenham papel protetor após 30 dias de infecção intratraqueal com P. brasiliensis, mostrando diminuição do aumento de CFU, perfil de resposta Th1 e Th17, bem como aumento de células citotóxicas T CD8+ produtoras de IFN-γ e IL-17. As células citotóxicas T CD8+ mostraram ser essenciais para o controle da infecção nos camundongos TLR3-/-, uma vez que a depleção dessas células levou a progressão da doença. Em estágios iniciais, 3 e 5 dias de infecção, observamos aumento do recrutamento de neutrófilos para o pulmão. Estudos recentes indicam que o TLR3 é um receptor importante para a resposta imune na micose e sua ausência favorece a infecção por fungos. Em contraste, nossos resultados mostram que, no caso do PCM, o TLR3 é prejudicial ao hospedeiro, sugerindo que a ativação do TLR3 pode ser um possível mecanismo de escape de P. brasiliensis. / Toll-like receptors comprise the best-characterized pattern-recognition receptor family that can activate different immune responses, depending on which receptor and adaptor set are utilized. TLRs, such as TLR2, TLR4 and TLR9, and their signaling have been implicated in the recognition of P. brasiliensis and regulation of the immune response, however, the role of TLR3 remains unclear. Thus, understanding the endosomal function of TLR3 in experimental PCM is crucial. We used in vitro and in vivo models of infection by P. brasiliensis, C57Bl/6 and TLR3-/- mice, to assess the contribution of TLR3 on development of infection. We show that absence of TLR3 leads to increased nitric oxide and phagocytic capacity by macrophages in the first 4 hours of interaction with yeasts P. brasiliensis. We also showed that TLR3-/- mice play a protective role after 30 days of intratracheal infection with P. brasiliensis, showing a decrease in the CFU increase, Th1 and Th17 response profile, as well as an increase in cytotoxic CD8+ cells producing IFN-γ and IL-17. The cytotoxic T CD8+ cells were shown to be essential for the control of infection in TLR3-/- mice, since the depletion of these cells led to the progression of the disease. In the initial stages, 3 and 5 days of infection, we observed increased recruitment of neutrophils to the lung. Recent studies indicate that TLR3 is an important receptor for the immune response in mycosis and its absence favors fungal infection. In contrast, our results show that in the case of PCM, TLR3 is detrimental to the host, suggesting that TLR3 activation may be a possible escape mechanism of P. brasiliensis.

Le virus Influenza pandémique de 2009 (p2009/H1N1) a été remarquable de par l’inflammation incontrôlée qu’il produisait et la production de cytokines dérégulée qui a été observée chez certains individus jeunes et en santé. Nous avons évalué l’impact de ce virus pandémique sur la réponse immunitaire en la comparant à celle obtenue avec un virus conventionnel (PR8/H1N1) pour tester l’hypothèse selon laquelle l’effet de l’inflammation exagérée sur la réponse cellulaire cause la morbidité et la mortalité observées chez les individus infectés avec le virus Influenza pandémique de 2009. Le virus p2009 a d’abord été adapté par 8 passages successifs dans la souris. La réponse antivirale, la libération de cytokines inflammatoires ainsi que les réponses immunitaires cellulaires innée, adaptative et mémoire ont été comparés entre ce virus adapté (MAp2009) et PR8. À charge virale initiale égale, il a été déterminé qu’avec MAp2009, la morbidité et la mortalité sont accrues et que certaines cytokines (IFN-β, TNF-α, IL-6) sont exprimées plus fortement à jour 2 post-infection (p.i.) Les titres viraux pulmonaires étaient aussi 100 fois plus élevés et persistaient 2 jours de plus. Une infiltration cellulaire précoce, dès le 2e jour p.i. et soutenue, jusqu’à 10 jours p.i. ainsi que des dommages pulmonaires exacerbés ont été observés avec ce même virus. Environ 20 fois plus de cellules NK ont été observées au site de l’infection chez les souris infectées avec le virus pandémique à jour 7 p.i., ces mêmes cellules qui sont connues pour contribuer grandement à l’immunopathologie dans les poumons. Trois fois moins de lymphocytes T CD8[indice supérieur +] activés et spécifiques au virus ont été retrouvés dans les poumons des souris infectées avec MAp2009 comparativement au virus conventionnel à jour 8 p.i. De plus, les cellules dendritiques inflammatoires (iDCs) étaient triplées dans les poumons lors de l’infection pandémique à jour 3 p.i. Aussi, il semblait y avoir un débalancement dans le recrutement des DCs tissulaires au ganglion du médiastin (MLN) ce qui peut contribuer à une activation moins efficace des lymphocytes T. Ainsi, la trop forte réponse innée et l’inflammation exagérée compromettent la survie en induisant de graves dommages pulmonaires. De plus, les DCs peuvent suractiver les lymphocytes T CD8[indice supérieur +] qui déjà, sont produits en moins grand nombre et deviennent anergiques avant d’avoir détruit les cellules infectées par le virus.

Le but du travail de recherche présenté dans cette thèse était de déterminer les mécanismes impliqués dans le développement de symptômes neurologiques observés dans une lignée de souris transgénique pour l’expression de la molécule B7.2/CD86. La molécule B7.2 est un des ligands du récepteur CD28 qui transmet des signaux intracellulaires nécessaires à la prolifération des lymphocytes T et au développement de leurs fonctions effectrices. Nos travaux démontrent que ces souris développent spontanément une pathologie démyélinisante auto-immune conséquemment à l’expression transgénique de la molécule B7.2 sur les cellules de la microglie du système nerveux central. Les souris affectées présentent une infiltration de lymphocytes T au niveau du système nerveux central et périphérique proximal et cet infiltrat est prédominé par une population de lymphocytes T CD8[indice supérieur +] mémoires/effectrices. Nos études indiquent que la population de lymphocytes T CD8[indice supérieur +] joue un rôle effecteur dans le développement de la pathologie tandis que la population des lymphocytes T CD4[indice supérieur +] la régulent de façon négative. Nos résultats démontrent également que l’activation des cellules de la microglie survient très tôt lors de la pathogenèse et que cette activation des cellules de la microglie ainsi que le processus de démyélinisation sont entièrement dépendants de la signalisation par le récepteur de l’IFNy. Ce modèle de démyélinisation reflète l’émergence de cellules T autoréactives spécifiques au système nerveux à partir d’un répertoire périphérique polyclonal, un processus immunopathogénique qui se produit possiblement durant la pathogenèse de la sclérose en plaques. De plus, il présente certaines caractéristiques pathologiques similaires à celles de la sclérose en plaques tels que le développement spontané du processus de démyélinisation et de dommages aux axones ainsi qu’une connexité avec l’activité de l’IFNy. Plusieurs données de la littérature suggèrent que les lymphocytes T CD8[indice supérieur +] pourraient jouer un rôle dans les maladies auto-immunes affectant le système nerveux, mais la contribution exacte et les mécanismes pathogéniques spécifiques des lymphocytes T CD8[indice supérieur +] ne sont pas encore clairement établis. Le travail de recherche présenté dans cette thèse a donc permis d’établir que la lignée de souris transgénique qui exprime de façon constitutive le ligand de costimulation B7.2/CD86 sur les cellules de la microglie représente un nouveau modèle animal qui permettra d’étudier et de comprendre ces mécanismes pathogéniques spécifiques aux lymphocytes T CD8[indice supérieur +] ainsi que les processus qui régulent la participation des lymphocytes T CD8[indice supérieur +] dans la destruction de la gaine de myéline.

Bien que la plupart des études se focalisent sur les lymphocytes T CD4+ régulateurs, il a été observé que les lymphocytes T CD8+ régulateurs peuvent jouer un rôle important dans l’induction et le maintien de la tolérance immunitaire. Le transfert adoptif chez la souris et l’induction chez l’homme de lymphocytes T CD8+ régulateurs peuvent inhiber le rejet d’allogreffes et le développement de pathologies autoimmunes. Ces observations suggèrent que l’induction de ces populations peut avoir un potentiel thérapeutique. Des études supplémentaires sont encore nécessaires pour définir les conditions optimales de leur induction. Tant les nouveaux nés humains que murins ont une plus forte capacité que l’adulte à développer des lymphocytes T CD4+ régulateurs induits par une reconnaissance antigénique. La période néonatale serait donc particulièrement appropriée à l’induction de circuits régulateurs. Dans le cadre de ce travail, nous avons étudié le rôle des lymphocytes T CD8+, induits à la naissance, dans le contrôle de la réponse des lymphocytes T CD4+ de type Th2. Des souris BALB/c sont immunisées à la naissance à l’aide de cellules spléniques semi-allogéniques hybrides F1 (AJAX x BALB/c). Ces cellules persistent dans l’animal, au sein des organes lymphoïdes et stimulent ainsi de manière chronique les lymphocytes T CD4+ et T CD8+ du receveur et induisent une réponse de type Th2. Suite à l’injection des cellules spléniques semi-allogéniques au nouveau né de souris, nous avons observé l’expansion d’une population de lymphocytes T CD8+CD25+, dont le phénotype se caractérise par l’expression de Foxp3 et la production conjointe d’IFN- et l’IL-10. Nous avons pu observer que ces cellules sont capables d’inhiber la production de cytokines Th2 produites par les lymphocytes T CD4+ allospécifiques activés. Par contre, ces cellules régulatrices aggravent des réponses Th2 non apparentées. En effet, suite à une sensibilisation à l’ovalbumine, à l’âge adulte, ces souris développent de plus fortes réponses asthmatiques. D’autre part, les nouveaux nés de souris BALB/c ont été immunisés à la naissance à l’aide de cellules dendritiques semi-allogéniques hybrides F1 (AJAX x BALB/c) qui activent de manière aigüe leurs lymphocytes T. Ces souris présentent une forte réponse Th1 et Tc1/Tc2 spécifique de l’alloantigène et sont protégées contre le développement d’un asthme induit. Il a aussi été montré dans ce travail que suite à l’immunisation néonatale à l’aide de cellules dendritiques semi-allogéniques, le nombre de lymphocytes T CD8+CD44high, CD8+CD62Lhigh et CD8+CD25+ producteurs d’IFN- augmente significativement. L’IFN- produit par ces cellules contrôle l’hyperproduction des IgE spécifiques de l’allergène et la synthèse d’ARNm de l’IL-4 et de l’IL-13 induite dans les poumons des souris allergiques. Des études supplémentaires sont nécessaires pour mieux comprendre comment des lymphocytes T CD8+ régulateurs induits lors de stimulations antigéniques aigües ou chroniques en début de vie peuvent être capables de contrôler l’apparition de pathologies allergiques. De plus, le développement de vaccins capables de cibler les lymphocytes T CD8+ chez le jeune enfant pourrait contribuer à la recherche de nouveaux traitements des allergies et de l’asthme.

Les lymphocytes T (LT) CD8+ sont les médiateurs clés de la réponse immunitaire adaptative dirigée contre les pathogènes intracellulaires et les cellules tumorales. Lors d’une infection ou d’une immunisation, ils sont activés en réponse à leur antigène spécifique, prolifèrent et se différencient en cellules effectrices. Les LT CD8+ effecteurs participent à l’élimination du pathogène grâce à leurs fonctions cytotoxiques et à la production de cytokines. Les cellules activées subissent ensuite une phase de contraction à l’issue de laquelle ne subsistera qu’une petite population hétérogène de cellules mémoires qui contribuera à la protection à long terme de l’organisme lors d’infections ultérieures par le même pathogène. Les LT CD8+ peuvent également acquérir un phénotype de cellule mémoire dans des conditions physiologiques en l’absence de reconnaissance antigénique. Ces LT CD8+ mémoires non conventionnels peuvent apparaître dans le thymus (“LT CD8+ mémoires innés thymiques” (TIM) ou en périphérie (“LT CD8+ mémoires virtuels” (VM)). Ces sous-populations de LT CD8+ mémoires conventionnels et non conventionnels peuvent être activés sans reconnaissance antigénique par des cytokines inflammatoires, acquérir des fonctions cytotoxiques et produire des quantités importantes d’IFNγ. Elles contribuent ainsi à la première ligne de défense de l’organisme au même titre que d’autres cellules de l’immunité innée comme les cellules NK, NKT et γδ. Le programme transcriptionnel impliqué dans ces processus de différenciation alternative est mal connu. Eomesodermin (Eomes), un facteur de transcription apparenté à T-bet, joue un rôle central dans l’acquisition du phénotype mémoire et dans la fonction de ces cellules. Cependant, malgré le rôle crucial d’Eomes dans ce contexte, les signaux responsables de son induction et du maintien de son expression ne sont pas clairement établis. Dans ce travail, nous avons montré que les voies de signalisation induites par les interférons (IFN) de type I induisent directement l’expression d’Eomes tant dans les LT CD8+ naïfs que mémoires. Ce processus ne semble pas impacter la différenciation en cellules mémoires conventionnelles. Par contre, nous avons observé que l’absence de cette voie de signalisation affecte de façon importante le phénotype, la fonction et l’expansion au cours du vieillissement des cellules mémoires « virtuelles » (VM). De plus, les IFNs de type I induisent l’expansion de cette population in vivo et de façon dépendante de l’expression d’Eomes. Enfin, nous avons montré que le développement des LT CD8+ mémoires innés thymiques est régulé par les mêmes voies de signalisation induites par les IFNs de type I. Ainsi, ce travail révèle qu’en induisant Eomes, les IFNs de type I sont importants pour le développement, le maintien et la fonction des lymphocytes T CD8+ mémoires non conventionnels. De nombreuses questions subsistent concernant les conditions dans lesquelles se développent ces cellules, leurs fonctions dans la réponse immunitaire et leur présence possible chez l’humain. / Doctorat en Sciences médicales (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-24T17:57:16Z No. of bitstreams: 1 Franklin Souza da Silva_Dissertação.pdf: 2017504 bytes, checksum: 0bb3de10c14f9cc14cda994594ad320a (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-24T17:57:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Franklin Souza da Silva_Dissertação.pdf: 2017504 bytes, checksum: 0bb3de10c14f9cc14cda994594ad320a (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Leishmania spp são modelos de parasitas intracelulares de macrófagos que apresentam uma série de peculiaridades adaptativas nesta fase do seu ciclo biológico. A nossa hipótese é que fragmentos peptídicos da região COOH-terminal das cisteínas proteinases B de Leishmania (Leishmania) amazonensis atuem como uma dessas peculiaridades, modulando a resposta imune do hospedeiro vertebrado. Nesse trabalho, propomos definir a região bioativa (fragmento peptídico indutor da resposta imune) de dois peptídeos descritos como imunomoduladores durante a infecção experimental por L. (L.) amazonensis. Utilizando o servidor online SYFPEITHI, a partir dos peptídeos P1 (VMVEQVICFD) e P6 (EFCLGGGLCL) foi possível triar sequências peptídicas (P6.1 FCLGGGLCL, P6.2 EFCLGGGLCL, P6.3 EFCLGGGL, P6.4 CLGGGLCL, P6.5 EFCLGGGLC, P6.6 FCLGGGLC, P1.7 VMVEQVICF, P1.8 VMVEQVICFD, P1.9 MVEQVICFD, P1.10 VEQVICFD) que apresentaram um potencial de ligação favorável (escore > 8) aos dímeros de H-2 (H-2Db, H-2Kd, H-2Kk e H-2Ld). Os epítopos preditos foram sintetizados quimicamente e utilizados em ensaios ex vivo e in vitro com as linhagens de camundongos C57BL/6 (H-2Db) e BALB/c (H-2Ld). Os ensaios de quantificação dos linfócitos T CD8+ com o dimeric, H2-Db:Ig e H2-Ld:Ig complexadas aos peptídeos previstos, indicaram a presença de clones deste tipo celular para todos os peptídeos previstos, exceto para o P6.5 na linhagem C57BL/6, nos linfonodos drenantes da infecção. A propriedade de induzir proliferação de linfócitos T CD8+ in vitro foi observada apenas para sete peptídeos previstos (P6.1, P6.3, P6.4, P6.5, P6.6 P1.8 e P1.10) nos ensaios com BALB/c e apenas dois epítopos (P1.7 e P1.10) nos ensaios com C57BL/6. Adicionalmente foram realizados ensaios de interação entre o H2-Db:Ig e H2-Ld:Ig e os peptídeos sintéticos, em tempo real, pela técnica de ressonância plasmônica de superfície. Os peptídeos testados com H-2Db (P6.1, P6.3, P6.4, P6.5, P6.6, P1.7, P1.8 e P1.10) e H-2Lb (P6.2, P6.3, P6.4, P6.5, P6.6 e P1.8 e P1.9) indicaram valores de Ka (~ 10+1-10+3 M-1 s-1) e de Kd ( ∼ 10-4 s-1 - 10-6 s-1) favoráveis para formar complexos com os dímeros H-2Db e H-2Lb em pH neutro. Os valores de G < 0 destes complexos (em ambos os haplotipos), sugeriram que os mesmos existam durante a resposta imune acarretada pela infecção por L. (L.) amazonensis em camundongos. / Leishmania spp are models of intracellular macrophage parasites that show several adaptive peculiarities during that particular phase of the biological cycle. We hypothesized that peptide fragments from the COOH-terminal region of a cysteine proteinase B from Leishmania (Leishmania) amazonensis act in such peculiar way by modulating the immune response of vertebrate hosts. The aim of this work is the determination of the bioactive region (peptide fragment inducer of immune response) of two peptides described as immunomodulating during experimental infection by L. (L.) amazonensis. Using the online server Syfpeithi for P1(VMVEQVICFD) and P6(EFCLGGGLCL) peptides, we selected short sequences (P6.1 FCLGGGLCL, P6.2 EFCLGGGLCL, P6.3 EFCLGGGL, P6.4 CLGGGLCL, P6.5 EFCLGGGLC, P6.6 FCLGGGLC, P1.7 VMVEQVICF, P1.8 VMVEQVICFD, P1.9 MVEQVICFD, P1.10 VEQVICFD) with favorable binding potential (score > 8) to H-2 dimmers (H-2Db, H-2Kd, H-2Kk and H-2Ld). The predicted epitopes were chemically synthesized and used for ex vivo and in vitro assays with isogenic mice C57BL6 (H-2Db) and BALB/C (H-2Ld). We have also performed a quantification assay of CD8+ T lymphocytes in draining lymph node from lesion. In this assay, we used dimeric, H2-Db:Ig and H2-Ld:Ig, complexed to predicted peptides. The results indicated the presence of CD8+ T lymphocytes clones, for all tested peptides, excep for P6.5 in C57BL/6 mice. The capacity to induce CD8+ T lymphocytes blastogenesis, in vitro, was only observed for seven predicted peptides (P6.1, P6.3, P6.4, P6.5, P6.6 P1.8 and P1.10) in the assay with BALB/c mice cells and only for two peptides (P1.7 and P1.10) in C57BL/6 mice cell assay. Additionally, we performed a binding assay between H2-Db:Ig and H2-Ld:Ig and the synthetic peptides, in real time, by surface plasmon resonance. The peptides tested with H-2Db (P6.1, P6.3, P6.4, P6.5, P6.6, P1.7, P1.8 and P1.10) and H-2Lb (P6.2, P6.3, P6.4, P6.5, P6.6, P1.8 and P1.9) indicated values of Ka (~ 10+1-10+3 M-1 s-1) and Kd (∼ 10-4 s-1 - 10-6 s-1 ) favorable to form complexes with H-2Db e H-2Lb dimmers at neutral pH. The G < 0 values of these complexes (for both haplotypes), suggest that they can exist during the immune response caused by L. (L.) amazonensis infection in mice.