Information about extreme precipitation is of great interest for a variety of purposes, which include dam design and its operation, public safety, engineering projects concerned with river management and drainage as well as rainfall-runoff relations. These require knowledge about the spatial and temporal variability of average rainfall over an area. Design rainfall values are generally expressed in the form of point rainfall intensity values which is the rainfall depth at a location. In order to obtain areal average values for an area, hydrologists and engineers require techniques whereby point rainfall amounts can be transformed to average rainfall amounts over a specified area. This problem of point-to-area rainfall conversion can be addressed using depth??area curves which require the use of areal reduction factors. The derivation of areal reduction factors is a focal issue and has been dealt with in diverse manners. Though the methods of derivation of the areal reduction factors vary, results shown by them are comparable. But all these methods have certain shortcomings in the procedures adopted by them. In this application the analysis is based on radar rainfall values obtained from NEXRAD for the study area of Texas as provided by West Gulf River Forecasting Centre (WGRFC). Using NEXRADradar rainfall data, geographically fixed depth area relationships will be determined. Here the objectives are to develop areal reduction factors using radar data and to identify the potential obstacles that might hinder the use of such data. The values of the factors developed will be finally compared to other studies which have been carried out. This approach aims to mitigate the difficulties faced in the applications of various procedures and the shortcomings of the various techniques used to determine the values of areal reduction factors.

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In this thesis, I characterized the association of Arf4GDP with ER-Golgi intermediate compartment membranes. We confirmed that GDP-arrested Arf4 mutants associated with membranes irrespective of nature of tag or mutation. Recruitment appeared specific since loss of N-terminal myristoylation abolished binding. Surprisingly, mutations of residues unique to class II Arfs did not prevent recruitment of Arf4 to peripheral puncta. We then examined the failure of the GDP-arrested Arf4 mutant to disrupt Golgi structure. We identified residues R79 and E113 (likely involved in salt bridge interaction) only present in Arf1 and Arf5 as critical to the ability of their GDP-arrested mutants to disrupt Golgi structure. As predicted, introduction of these residues transformed Arf4GDP into a dominant negative mutant. Interestingly, overexpression of the putative ArfGDP receptor membrin prevented the effects of dominant negative Arf1 but not dominant negative Arf4. These results will facilitate identification of a novel Arf target critical to protein trafficking.

Le verre est un matériau prometteur qu'on retrouve dans de nombreuses applications en photonique et en optoélectronique. Au cours de la dernière décennie, un intérêt croissant a été porté sur ce matériau pour la fabrication de micro système électro-mécanique. Les méthodes conventionnelles de micro-usinage de verre sont trop lents, et l'ablation laser conduit à des fissures et une rugosité élevée. Dans ce contexte, le verre photosensible, tels que le Foturan(TM), offrent des avantages notables dans la fabrication de microstructures à deux ou trois dimensions. Pour aborder le problème de fabrication rapide de ces microstructures à faible rugosité, nous avons entrepris une étude de micro-usinage de Foturan(TM) avec un laser excimère ARF ([lambda] = 193 nm ). À notre connaissance, c'est la plus courte longueur d'onde laser jamais utilisée pour l'irradiation du Foturan(TM). Cette technique de micro-usinage se compose de trois grandes étapes: (1) Irradiation laser. (2) traitement thermique et, (3) gravure humide pour éliminer le volume de zones irradiés et recuit. En raison de la forte absorption optique à 193 nm, on s'attendait à ce qu'un meilleur contrôle pourrait être réalisé de l'usinage de la surface par rapport aux résultats précédemment obtenus avec des lasers excimère à 266 et 355 nm, ou avec des lasers femtoseconde. De plus, l'utilisation d'une technique de projection de masques permet l'irradiation de gaufres de dimension relativement importante. Nous avons démontré que la technique permet la fabrication de cratères avec une profondeur maximale ne dépassant pas 35 [micromètres]. Des cratères plus profond, jusqu'à 120 [micromètres], ont été fabriqués à la suite d'une série d'irradiation-recuit-gravure. mous avons fabriqué une série de structures complexes en 3D en utilisant la technique de projection de masques et le balayage du laser. La rugosité de surface des microstructures qui ont été fabriqués sont de l'ordre de 100 nm. Ce qui pourrait être réduits à moins de 10nm par la mise en oeuvre d'un post-traitement de recuit. Les résultats de cette étude ont indiqué clairement la faisabilité de l'utilisation du laser excimère à 193 nm combiné à la projection de masques pour la fabrication rapide de microstructures en verre photosensible en 3 D . Le méthode proposée devrait trouver des applications dans le domaine de la fabrication, par exemple, des dispositifs microfluidiques, ou des composantes spécialisés d'optoélectroniques.

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abstract: The majority of chronic myeloid leukemia (CML) and some of acute lymphocytic leukemia (ALL) cases are associated with possessing the BCR-Abl fusion protein from an oncogenic translocation, resulting in a constantly active form of Abl and rapid proliferation. CML and ALL cells that possess the BCR-Abl fusion protein are known as Philadelphia chromosome positive (Ph+). Currently, Imatinib (selective Abl inhibitor) is used as therapy against CML and ALL. However, some patients may have malignancies which show resistance to Imatinib. Previous work displays that the transformation of progenitor B cells with the v-Abl oncogene of Abelson murine leukemia virus results in cell cycle progression, rapid proliferation, and potentially malignant transformation while preventing any further differentiation. Progenitor B cells transformed with the temperature-sensitive form of the v-Abl oncogene have served as a model to study cellular response to Imatinib treatment. After some manipulation, very few cells were forced to progress to malignancy, forming tumor in vivo. These cells were no long sensitive to v-Abl inactivation, resembling the Imatinib resistant ALL. Autophagy is the process by which proteins and organelles are broken-down and recycled within the eukaryotic cell and has been hypothesized to play a part in cancer cell survival and drug-resistance. LC3 processing is a widely accepted marker of autophagy induction and progression. It has also been shown that Imatinib treatment of Ph+ leukemia can induce autophagy. In this study, we examined the autophagy induction in response to v-Abl inactivation in a Ph+-B-ALL cell model that shows resistance to Imatinib. In particular, we wonder whether the tumor cell line resistant to v-Abl inactivation may acquire a high level of autophagy to become resistant to apoptosis induced by v-Abl inactivation, and thus become addicted to autophagy. Indeed, this tumor cell line displays a high basal levels of LC3 I and II expression, regardless of v-Abl activity. We further demonstrated that inhibition of the autophagy pathway enhances the tumor line's sensitivity to Imatinib, resulting in cell cycle arrest and massive apoptosis. The combination of autophagy and Abl inhibitions may serve as an effective therapy for BCR-Abl positive CML. / Dissertation/Thesis / M.S. Biological Design 2011

Orientador: André Luis Balbi / Banca: Jacqueline Teixeira Caramori / Banca: Pedro Alejandro Gordan / Resumo: A Insuficiência Renal Aguda apresenta uma alta incidência em pacientes internados em hospitais terciários, principalmente em Unidades de Terapia Intensiva, estando associada a elevada mortalidade. Este trabalho tem como objetivos descrever a população de pacientes internados no Hospital das Clínicas de Faculdade de Medicina de Botucatu - UNESP com diagnóstico de Insuficiência Renal Aguda atendidos pelo Grupo de Interconsultas do Serviço de Nefrologia e avaliar os fatores de risco associados ao óbito nestes pacientes. Foram acompanhados 946 pacientes no período de abril de 2002 a dezembro de 2006, todos maiores de 12 anos, com diagnóstico de Necrose Tubular Aguda e internados nas diferentes enfermarias e Unidades de Terapia Intensiva do Hospital das Clínicas, exceto na Pediatria e Nefrologia. Insuficiência Renal Aguda foi definida como um aumento de creatinina sérica de pelo menos 30% de seu valor basal em período mínimo de 48 horas. A média de idade foi de 61,8 ± 16,7 anos, com predomínio do sexo masculino (61,9%). Pacientes provenientes de enfermarias clínicas foram mais freqüentes (62,1%), sendo que 15,9% estavam internados na cardiologia e 15,2% na clínica médica geral, enquanto 13,3% estavam internados na enfermaria de gastroenterologia cirúrgica. 46,1% estavam internados em Unidades de Terapia Intensiva e a sepse esteve presente em 9,7% dos casos. Isquemia (51,2%) foi a etiologia mais freqüente e o tempo de acompanhamento nefrológico apresentou mediana de 7,5 dias, com intervalo interquartílico de 4 a 14 dias. / Abstract: Acute Renal Failure (ARF) present a high incidence in critically ill patients taken into tertiary care hospitais, mostly in the Intensive Care Unit (ICU) patients, were also associate with great mortality rate. The objective of this work was to describe the population of patients hospitalized in the School Medicine, Botucatu- UNESP with diagnosis of ARF, attended by Group of - Interconsults of Service Nephrology and to evaluate the risk factors associate with death in this patients. This was a cohort study which evaluated 946 patients with ARF, from April 2002 to December 2006, was included patients older than 12 years, with diagnosis of ARF due to Acute Tubular Necrosis (ATN) and hospitalized in wards and ICU of HC- FMBUNESP (except in the Pediatrics and Nephroloy wards). ARF was defined as serum creatinine at least 30% above basal value from 48 hours at minimum. The average of age was 61,8 ± 16,7 years, with predominantly masculine gender (61,9%). 15,9% were hospitalized in the cardiology and 15,2% in the clinical medical, while 13,3% were hospitalized in the gastroenterology surgical ward. 46,1% of patients were hospitalized in ICU and the sepsis was present in 9,7% of the cases. Ischemia was the etiology more frequent (51,2%) and the time of accompaniment nephrologic presented an median of 7,5 days (4 - 14). / Mestre

La croissance et le développement des plantes sont fortement régulés par plusieurs hormones végétales, dont l’auxine qui joue un rôle prépondérant. La modification de l’expression de certains gènes en réponse à l’auxine est contrôlée par des interactions spécifiques entre les facteurs de transcription ARF (Auxin Response Factors) et les protéines Aux/IAA. Des études sur Arabidopsis thaliana ont aussi montré l’implication de corépresseurs de la famille TOPLESS pour réprimer les gènes cibles des ARF. Toutefois, cette régulation transcriptionnelle a surtout été caractérisée chez la plante modèle Arabidopsis et la validité de ce modèle n’a pas encore été confortée par l’étude d’autres modèles. La tomate (Solanum lycopersicon), espèce modèle tant pour les Solanacées que pour les plantes à fruits constitue une bonne alternative pour élucider les caractères généraux liés à la signalisation auxinique. Dans notre travail, nous avons d’abord mis en place des protocoles expérimentaux – double-hybride, pull-down, complémentation de fluorescence (BiFC, Bifluorescence Complementation) – permettant d’étudier les interactions protéines-protéines. Ces méthodes ont d’abord été validées sur des couples Aux/IAA – ARF étant connus chez la tomate pour leur implication dans le développement et la maturation des fruits (SlIAA9, SlARF8, SlIAA3, SlARF4, SlIAA27). L’utilisation du double hybride a également permis de construire une carte d’interactions entre les Aux/IAA et les ARF de tomate. Dans un deuxième temps, la disponibilité de la séquence du génome de la tomate a permis d’entreprendre une étude globale de la famille des corépresseurs TOPLESS. Cette étude a inclus : la caractérisation et le clonage des gènes, l’analyse de la séquence protéique, une analyse phylogénétique de la famille sur un ensemble de génome séquencés, la caractérisation du profil d’expression des différentes isoformes ainsi qu’une analyse comparative de leur capacité d’interaction avec les protéines Aux/IAA. Enfin, dans un dernier temps, nous avons souhaité construire des premiers outils permettant d’entreprendre une recherche non-ciblée de nouveaux partenaires interagissant avec les protéines ARF ou Aux/IAA en partant de protoplastes de cellules BY-2 de tabac exprimant de façon transitoire des gènes codant des protéines chimères (tagged proteins). Même si ce travail reste préliminaire, il a pu notamment illustrer l’importance de l’intégrité des noyaux pour la stabilité des Aux/IAA, même en l’absence d’auxine. / The plant hormone auxin plays a central role in plant growth and development. The specific Aux/IAAs and Auxin Response Factors (ARFs) interactions are involved in auxin signaling pathway to regulate the auxin-responsive gene expression. Studies in Arabidopsis showed that TOPLESS family (TPLs) also was recruited by some Aux/IAAs to repress the function of ARFs. The whole machinery of the auxin signaling pathway is not clear yet, and most of this knowledge comes from the research on Arabidopsis. As a reference for Solanaceae and fleshy fruit plant, tomato (Solanum lycopersicon) is a good alternative model to better understand general traits of the auxin regulation process. In our work, we first established in our labs three experimental protocols – Yeast two-Hybrid, Pull-down and Bifluorescence complementation to unravel protein-protein interactions. These methods were first challenged on specific Aux/IAA and ARF proteins that were already characterized as major actors in fruit tomato development or ripening (SlIAA9, SlARF8, SlIAA3, SlARF4, SlIAA27). This also enabled us to build an ARF-Aux/IAA interaction map. In a second part, taking advantage of the tomato genome sequence, we carried a whole-genome study on tomato TOPLESS family. This investigation included gene cloning and characterization, protein sequence analysis, phylogenetic analyses, expression pattern and construction of protein-protein interaction maps. In a last part, we developed tools to start a non-targeted approach aiming at identifying new potential partners or protein complex involved in auxin signaling pathway using BY-2 tobacco cell protoplasts transiently expressing tagged-proteins. Although this study is still preliminary, it demonstrated the importance of nucleus integrity for Aux/IAA stability even in absence of auxin.

Les petites molécules bioactives sont des acteurs clés dans la recherche biomédicale et les études de chimie biologiques, pour leur application potentielle comme sondes moléculaires pour enquêter les systèmes biologiques, et la possibilité de développer de nouveaux traitements puissants et sélectifs. Dans ce travail, nous avons exploré l'utilisation de plusieurs classes de petites molécules capables d'interférer avec des cibles biologiquement significatives, comme les acides nucléiques et les lysosomes, et déclencher des réponses biologiques. A partir de l'étoposide, l'un des agents anti-néoplasiques le plus employé en clinique, nous avons développé une nouvelle classe de petites molécules actives capables de cibler différemment les deux isoformes humaines de la topoisomérase II, TOP2A et TOP2B, qui jouent des rôles différents dans l'inhibition de la croissance des cellules cancéreuses, et le développement de tumeurs malignes secondaires. Dans un autre projet, nous avons utilisé une stratégie d'étiquetage « click in situ » pour enquêter sur la localisation subcellulaire d'un nouvel inhibiteur de la réaction d'échange nucléotidique des protéines Arf, un outil potentiel pour l'étude du trafic cellulaire et la signalisation liés a ces protéines. Enfin, nous avons étudié l'origine de l'efficacité d'un nouveau agent de ciblage du compartiment lysosomal: l'artesumycin, un hybride moléculaire des petites molécules bioactives la marmycine A et l'artésunate, qui possède une activité antiproliferative accrue en comparaison avec les deux produits naturels utilisés indépendamment. Nos résultats fournissent une précieuse contribution dans ces domaines de recherche. / Bioactive small molecules are key players in biomedical research and chemical biology studies given their potential application as molecular probes to investigate biological system, together with the possibility to develop new potent and selective therapeutics. In this work, we explored the use of several classes of small molecules able to interfere with therapeutically relevant targets, from nucleic acids to lysosomes, and evaluate ensuing biological responses. Starting from etoposide, one of the most clinically employed anti-neoplastic agents, we developed a new class of active small molecules able to differentially target the two human topoisomerase II isoforms, TOP2A and TOP2B, which have been shown to play different roles in inhibiting cancer cell growth and initiating secondary malignancies. In a separate project, we aimed to use an in situ click labelling strategies to investigate the subcellular localization of a new inhibitor of the nucleotide exchange reaction of Arf proteins, a potential tool for the study of Arf-related cellular trafficking and signalling. Finally, we studied the origins of the synergy displayed by the new lysosome targeting agent artesumycin, a molecular hybrid of the bioactive small molecules marmycin A and artesunate, which has been shown to possess enhanced antiproliferative activity in comparison to the two natural product used independently. Our results provide valuable contributions for future advances in these research areas.

L’auxine est une hormone végétale impliquée dans presque toutes les étapes du développement des plantes, de la formation de l’embryon jusqu’à la floraison, déterminant la position des organes et donc la structure de la plante. Comme pour les autres hormones, la perception de l’auxine est suivie par une transduction du signal qui produit une série de changements dans les cellules végétales dont des régulations transcriptionnelles. Cette thèse est divisée en 3 chapitres, chacun d’eux étant focalisé sur des aspects structuraux, moléculaires et évolutifs de différentes protéines impliquées dans la régulation des gènes de réponse à l’auxine.Nous avons tout d’abord centré nos études sur TOPLESS (TPL), un corépresseur qui agit au niveau de la répression des gènes de réponse à l’auxine, mais aussi dans d’autres processus végétaux compte tenu de son interaction avec de nombreux répresseurs transcriptionnels. Nous avons déterminé la structure de la partie N-terminale de TPL et compris comment TPL interagit avec différents partenaires au niveau d’un même site de liaison. Nous avons alors démontré que TPL forme un tétramère à l’aide d’une surface de tétramérisation constituée par un nouveau domaine, le domaine CRA, qui fait aussi partie du site de liaison. Les résidus impliqués dans la tétramérisation et l’interaction avec des partenaires sont très conservés depuis des centaines de millions d’années montrant ainsi l’importance du rôle de TPL depuis l’origine des plantes. Enfin, les similarités de structure entre TPL et d’autres corépresseurs qui possèdent des domaines similaires mais possédant une fonction différente montrent un bel exemple de la manière dont l’évolution joue avec des domaines protéiques pour créer de nouvelles fonctions.Nous avons ensuite étudié les préférences de liaison à l’ADN des facteurs de transcription de la réponse à l’auxine (ARF). Pour cela nous avons utilisé une combinaison d’analyses bio-informatiques de données de DAP-seq sur la liaison des ARFs sur le génome, des tests d’interaction ADN-protéine in vitro et de la modélisation de structures. Nos résultats indiquent que les différents ARFs ont des sites préférentiels de liaison sur le génome et que ces préférences sont déterminées par l’orientation et l’espacement entre motifs de liaison. Enfin, ces études suggèrent qu’en fonction du site de liaison, les ARFs pourraient se lier avec différentes conformations à l’aide de surfaces de dimérisation qui ne sont pas encore décrites. Ces résultats permettent d’expliquer comment différents ARFs coexprimés dans la même cellule peuvent fonctionner ensemble pour contribuer à une réponse transcriptionnelle à l’auxine spécifique et robuste.Finalement, nous avons remonté le temps pour positionner l’origine de la voie de signalisation de l’auxine chez les plantes. Pour cela, nous avons recherché des homologues des protéines de la voie de signalisation de l’auxine dans des algues vertes charophytes, les ancêtres les plus lointains (450 Millions d’années) des plantes. Nous avons alors trouvé un homologue des ARFs et TPL chez les premières algues multicellulaires (Chlorokybus atmophyticus). La caractérisation biochimique de l’ARF de C. atmophyticus indique qu’il partageait déjà les mêmes propriétés que les ARFs des plantes terrestres et était aussi capable d’interagir avec TPL comme certains ARFs. L’absence d’homologues du récepteur de l’auxine chez ces algues primitives indique cependant que la dépendance à l’auxine aurait été acquise plus tard avec l’apparition du système corécepteur TIR1/AFB-Aux/IAA après la divergence des charophytes vers les plantes terrestres. / Auxin is a plant hormone implicated in almost all plant developmental stages, since the embryo formation till flowering, determining the position of the organs in the plant and thus, its whole structure. As for any other hormone, auxin perception is followed by a signal transduction that finishes in a series of changes in a plant cell, including transcriptional changes. This thesis is divided in 3 chapters, each with a focus on the structural, molecular and evolutionary aspects of different proteins involved in the regulation of auxin genes response.First, we focused our studies on TOPLESS (TPL), a co-repressor implicated, not only in auxin responsive genes repression, but also in many other plant processes due to its interactions with numerous transcriptional repressors in plants. Our determination of the TPL N-terminal structure allowed us to understand that TPL can interact with different partners through the same binding site. Moreover, it revealed that TPL is a tetrameric protein, with the tetramerization interface formed by a newly identify domain, the CRA domain, that is also part of the binding site. The high residues conservation in both tetramerization interface and TPL binding site since m.y.a indicates the importance of TPL role since the origin of plants. This work also shows that the structural similarities between TPL and other co-repressor with similar domains but different function nicely exemplify how evolution plays with common features for creating new functions.Second, we studied ARF proteins, the transcription factors of the auxin transcriptional response, with a focus on their DNA binding preferences. For this, we used a combination of bioinformatic analyses of DAP-seq ARFs genomic binding, with in vitro DNA binding tests and structure modelling. Our results point out that different ARFs can have different preferential binding sites within the genome, with these preferences being determined by the orientation and spacing of the binding motifs. Moreover, our studies suggest that depending on the binding site, ARFs could bind with different conformations using dimerization interfaces not yet discovered. These results can explain how different ARFs co-expressed inside a plant cell can collaborate to the specificity and robustness of auxin transcriptional response by differential bindings to the genome.Finally, we travelled back in time to position the origin of auxin signalling pathway in the evolution of plants. Here we looked for protein homologues of the auxin signalling pathway in charophyte green algae, the most ancient plants ancestor (450 M years). This search retrieved an ARF and a TPL homologue in the first multicellular charophyte algae (Chlorokybus atmophyticus). The biochemical characterization of C. atmophyticus ARF indicated that it presented already the same properties of the ARFs from land plants and that it was able to interact with TPL protein, as it is the case for some ARFs. The absence of auxin receptor homologues in these primitive algae indicates however that auxin-dependency appeared with the acquisition of TIR1/AFB-Aux/IAA coreceptor system, after charophytes divergence into land plants.