Mitochondrial ATP synthase represents the final complex of oxidative phosphorylation (OXPHOS) system located in the inner mitochondrial membrane. Its primary role is to utilize mitochondrial membrane potential (Δψm) generated by respiratory chain complexes to produce energy in the form of ATP. Mammalian ATP synthase comprises of 17 different subunits organized into membranous Fo and matrix-oriented F1 domains. Defects of complex V and their manifestation have been studied on mitochondrial, cellular, tissue and organism levels using different models, including human cell lines and cell lines derived from patient tissues. In many cases mitochondrial diseases display threshold behaviour, when genetic defect is phenotypically manifested only bellow certain threshold in particular enzyme complex activity and/or content. This work was aimed at elucidation of functional consequences of ATP synthase deficiency in HEK293 cell lines with suppressed gene expression of γ, δ or ε subunits of ATP synthase central stalk. We have analysed range of clones with respective subunits knockdown and found varying decrease in assembled ATP synthase content, which was mirrored by the decrease in individual ATP synthase subunits. The only exception was subunit Fo-c, whose levels remained unchanged or even increased. ATP...

Le transporteur NTT1 est responsable pour l'import d'ATP dans les chloroplastes afin de maintenir le métabolisme en période d'activité réduite ou nulle de la photosynthèse. Cependant, le mécanisme moléculaire de ce transporteur est encore méconnu, essentiellement du à la difficulté de manipulation des protéines membranaires. Nous avons réussi à développer un protocole pour la production de ce transporteur, permettant une bon rendement de solubilisation et obtention de protéines purifiées pour des études structurales. Combinant des caractérisations biochimiques et biophysiques, nous avons pu identifier des conditions de préparation d'échantillons qui ont mené aux premiers cristaux. Afin d'étendre notre connaissance sur les transporteurs de nucléotides, nous avons également entrepris des études structurales et fonctionnelles sur AAC, le transporteur ADP/ATP des mitochondries. AAC et NTT1 appartiennent à des familles de protéines différentes mais ont des fonctions voisines. À partir de la première structure d'AAC déjà connue, nous avons recherché par des criblages in silico de nouvelles molécules se liant au transporteur de façon compétitive avec le nucléotide et pouvant ainsi inhiber le transport. Les outils de docking ont été mis en place et ont permis à partir d'une librairie de 75000 composés d'identifier 17 molécules. Ensuite, nous avons testés ces molécules expérimentalement et montré qu'une d'entre elles inhibent le transport. De plus, trois nouveaux analogues d'ADP ont également été identifiés comme inhibiteurs. / Chloroplast NTT1 mediates external supply of ATP in the plastids, which is pre- requisite for the maintenance of plastid metabolism during limited or missing photosynthetic activity. However, their molecular mechanism remains poorly understood, primarily due to the difficulty of producing and purifying functional recombinant forms of these transporters. We have successfully developed a protocol for the production of this transporter, that is compatible for efficient solubilization and good yield of purified protein. Combining biochemical and biophysical analyses, we could characterize the protein solution and identify conditions from which first crystals could be obtained. To further extend our work with nucleotide transporter, structural and functional studies on mitochondrial ADP/ATP carrier (AAC) have been performed. AAC and NTT1 belong to different families but exhibit similar functional features. To discover small-molecule inhibitors of AAC's transport for structural studies, virtual docking of compounds was performed into the AAC active site, using the already known structure of AAC. Docking tools were installed and screening a large library of 75,000 compounds allowed the identification of 17 molecules. The experimental binding assay for AAC, revealed that one of the compounds has inhibitory activity in the micromolar regime. In addition, 3 novel ADP analogues showing inhibitory effect against ATP transport of AAC have also been identified.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Trypanosoma cruzi infection causes Chagas disease (CD), a chronic inflammatory disease. The most infected individuals present no apparent morbidity, consistent with the indeterminate form of Chagas disease (IFCD). Although parasite-related factors may influence the clinical progress of disease, factors such as immune and inflammatory responses of host have a fundamental participation in the dynamic of pathology. The cellular immune response is closely associated with the presence of a tissue inflammatory infiltrate, which is composed by mononuclear cells that proliferate and produce pro- and anti-inflammatory cytokines. The inflammatory reaction triggered by T. cruzi infection is maintained by persistence of parasite in the host, and produces systemic effects, including microvascular changes. The puricergic signaling system plays an important role in the modulatiib of immune and inflammatory responses as well as vascular thrombosis by adenine nucleotides (ATP, ADP and AMP) and their derivative nucleoside adenosine. These signaling molecules are released from cells such as lymphocytes and platelets in response to damage or cell stimulation by the action of pathogens. The effects of adenine nucleotides and adenosine are promoted through the agonism of specific purinergic receptors and controlled by an enzymatic complex located on the cell surface. The aim of this study was to evaluate the influence of purinergic signaling in the regulation of microvascular dysfunction triggered by infection and in the adaptive immune response induced by the host through ectoenzymes activities involved in the metabolism of ATP in lymphocytes and platelets of patients IFCD. It was observed a decrease in both E-NTPDase and E-ADA activities, representing an adaptive consequence of host to a low antigenic stimulation during the latent phase of disease. Therefore, low concentrations of extracellular ATP would lead the induction of a Th2 response that would protect the host from an intense Th1 response, while high concentrations of extracellular adenosine would be responsible for anti-inflammatory and immunosuppressive effects. It was not observed any change in E-NTPDase expression when compared with the control group, demonstrating that its decreased activity may be a result of some tridimencional alteration of the enzyme itself. In platelets of IFCD patients, there was an increase in E-NPP and E-5 -NT activities and a decrease in E-ADA activity, which could be related to tromboregulatory effects by nucleotides degradation as well as formation and preservation of extracellular adenosine levels, in view of its vasodilator and cardioprotective roles. The decreased platelet aggregation observed in IFCD patients probably occurred due to antiaggregating action of adenosine. In conclusion, the purinergic system ectoenzymes, which are responsible for ATP metabolism, contribute in tromborregulation and modulation of host immune responses during the indeterminate form of the disease. / A infecção pelo Trypanosoma cruzi causa a doença de Chagas (DC), uma doença inflamatória crônica. A maioria dos indivíduos infectados não apresenta morbidade aparente, compatível com a forma indeterminada da doença de Chagas (FIDC). Embora fatores relacionados ao parasito possam influenciar a evolução clínica da doença, fatores como resposta imune e inflamatória do hospedeiro têm fundamental participação na dinâmica da patologia. A resposta imune celular está intimamente associada à presença de um infiltrado inflamatório tecidual, composto por células mononucleares que proliferam e produzem citocinas pró e anti-inflamatórias. A reação inflamatória desencadeada pela infecção pelo T. cruzi é mantida pela persistência do parasito no hospedeiro, e produz alterações sistêmicas, incluindo alterações microvasculares. O sistema de sinalização purinérgica desempenha um importante papel na modulação da resposta imune e inflamatória, assim como da trombose vascular, através dos nucleotídeos da adenina (ATP, ADP e AMP) e seu derivado nucleosídeo adenosina. Estas moléculas sinalizadoras são liberadas de células como linfócitos e plaquetas em resposta ao dano ou ao estímulo celular por ação de patógenos. Os efeitos dos nucleotídeos de adenina e da adenosina são promovidos através da ativação de receptores purinégicos específicos e controlados por um complexo enzimático localizado na superfície das células. O objetivo deste trabalho foi avaliar a influência da sinalização purinérgica na regulação das disfunções microvasculares desencadeadas pela infecção, bem como da resposta imune adaptativa induzida pelo hospedeiro, através da determinação da atividade de ectoenzimas envolvidas no metabolismo do ATP em linfócitos e plaquetas de pacientes FIDC. Foi observada uma diminuição nas atividades da E-NTPDase e da E-ADA, representando uma conseqüência adaptativa do hospedeiro frente a uma baixa estimulação antigênica durante o período de latência da doença. Logo, baixas concentrações do ATP extracelular liberadas, levariam à indução de uma resposta Th2 que protegeria o hospedeiro de uma intensa resposta Th1, enquanto, elevadas concentrações de adenosina extracelular seriam responsáveis por efeitos anti-inflamatórios e imunossupressores. Não foi observada alteração na expressão da E-NTPDase em relação ao grupo controle, demonstrando que a diminuição da sua atividade enzimática pode ser resultado de alguma modificação na conformação tridimensional da própria enzima. Em plaquetas de pacientes FIDC, foi observado um aumento nas atividades da E-NPP e E-5 -NT e uma diminuição na atividade da E-ADA, o que poderia estar relacionado a um efeito tromborregulatório, com a formação e preservação dos níveis extracelulares de adenosina, tendo em vista seu papel vadodilatador e cardioprotetor. A agregação plaquetária diminuída observada nos pacientes FIDC, provavelmente ocorreu devido à ação anti-agregante da adenosina circulante. Dessa forma, sugere-se que as ectoenzimas do sistema purinérgico, responsáveis pelo metabolismo do ATP contribuem na tromborregulação e na modulação das respostas imunes do hospedeiro durante a forma indeterminada da doença.

As descargas atmosféricas estão entre as principais causas de distúrbios nos sistemas elétricos, provocando sobretensões e ocasionando uma parcela significativa das interrupções não programadas. Tais distúrbios são cada vez mais percebidos pelos consumidores, ocasionando desde o mau funcionamento até a queima de aparelhos e equipamentos eletro-eletrônicos residenciais, comerciais e industriais. Antigamente eletromecânicos, tais aparelhos são atualmente, em grande parte, produzidos com componentes semicondutores, o que os torna mais sensíveis a interferências. As descargas atmosféricas também apresentam um agravante de, salvo raras exceções, não serem registradas nos bancos de dados das concessionárias, ao contrário das operações de manobra, faltas e variações de carga na rede de distribuição. Essa situação contribui para os conflitos cada vez mais freqüentes entre consumidores e empresas de energia a respeito dos pedidos de indenização por danos em aparelhos elétricos (PID). Dada a relevância do tema, muitos estudos têm sido realizados ao longo dos últimos anos, sem entretanto esclarecer todos os aspectos necessários para a minimização desses problemas. Neste trabalho são avaliadas as amplitudes e formas de onda das sobretensões transferidas à rede de baixa tensão via transformador quando da ocorrência de surtos no primário. Esses surtos podem ser oriundos de descargas diretas na rede primária ou decorrentes de descargas em suas proximidades. O estudo visa a obtenção de informações tendo em vista a melhoria do desempenho das redes de distribuição e conseqüentemente a minimização dos danos causados aos consumidores. Nas simulações, realizadas através do programa ATP (“Alternative Transients Program”), são consideradas linhas com configurações típicas, bem como modelos de comprovada validade para representação dos isoladores de média e de baixa tensão e do transformador de distribuição. O trabalho analisa a influência, nas sobretensões, de diversos parâmetros, como por exemplo amplitude e forma de onda da corrente da descarga, ponto da incidência da descarga, resistência de terra e presença de dispositivos de proteção contra surtos. Os resultados apresentados constituem-se em importantes subsídios para a definição de critérios de instalação de dispositivos de proteção contra surtos em redes de baixa tensão. / Lightning discharges are among the main causes of disturbances in electrical systems, causing overvoltages and leading to a significant portion of unscheduled interruptions. Such disturbances are increasingly noticed by consumers, causing from malfunction to the burnt-out of electrical-electronic devices and equipment in homes, businesses and industries. Formerly electromechanical, such devices currently are, in their majority, produced with semiconductors, what makes them more sensitive to interferences. Lightning discharges also present the aggravation of not being recorded in power suppliers’ databases, but for seldom exceptions, as opposed to switching operations, failures and charge variations in the distribution network. This situation contributes for the increasingly frequent conflicts among consumers and power companies regarding indemnity claims due to damages to electrical devices. Given the subject’s significance, many studies have been conducted along the past years, not explaining, however, all the aspects required to minimize those problems. On this work, the amplitudes and waveforms of overvoltages on medium and low voltage lines are evaluated upon the incidence of direct discharges on the primary. The voltages transferred to the low voltage side are also evaluated in case of strikes in the vicinity of the line. The study intends to obtain information in order to achieve a performance improvement of distribution networks and, as a consequence, the reduction of damages to consumers to a minimum. In the simulations conducted through ATP (“Alternative Transients Program”), lines with typical configurations are considered and models of proven validity are used to represent the low and medium voltage insulators and the distribution transformer. The work analyses the effect of several parameters on the overvoltages, such as amplitude and waveform of the stroke current, lightning strike point, grounding resistance and existence of surge protective devices. The results presented constitute an important foundation to define the installation criteria of surge protective devices on low voltage networks.

Orientador: Paulo Mazzafera / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Insituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-12T18:35:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Andreazza_NathaliaLuiza_M.pdf: 3988387 bytes, checksum: 14f12a095b5cbb5989b090f57b961f01 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A pilocarpina é um alcalóide imidazólico, que possui como única fonte natural spécies do gênero Pilocarpus. Este alcalóide é utilizado no tratamento de glaucoma e xerostomia. O elevado custo de folhas de Pilocarpus microphyllus no mercado internacional e conseqüente extrativismo predatório resultaram na sua inclusão na lista de espécies em extinção do IBAMA. Na busca de fontes alternativas do alcalóide conseguiu-se demonstrar que suspensões celulares desta espécie podem ser um modelo para produção e estudo da biossíntese e do transporte de pilocarpina, uma vez que produz os mesmos alcalóides encontrados nas folhas. A extração de pilocarpina a partir do meio de cultura poderá minimizar a quantidade de solventes altamente poluentes utilizados na extração deste alcalóide a partir das células, assim como, reduzir a contaminação por outros constituintes celulares. Neste contexto o presente trabalho teve como objetivo inicial determinar o local e limite de acúmulo intracelular de pilocarpina e verificar se o fornecimento externo de altas doses do alcalóide causaria toxidez às células produtoras e não produtoras de pilocarpina. Em seguida, caracterizar a absorção do alcalóide pelas células submetidas a diferentes valores de pH do meio de cultura e também identificar o mecanismo de transporte do alcalóide nas suspensões procurando definir qual é a proteína de membrana responsável pelo transporte de pilocarpina entre células e meio de cultura através do uso de inibidores de transportadores da família das ATPases e ATP-binding cassete proteins (ABC). Os testes histoquímicos e o ensaio de fracionamento celular, apesar de não conclusivos, indicaram o acúmulo de pilocarpina no vacúolo, ainda que a fração correspondente a essa organela venha misturada com o conteúdo do citoplasma. As informações sobre a localização subcelular em adição aos dados de toxicidade mostraram que pilocarpina apresenta forte citotoxicidade a cultura de plantas que não apresentam sua via de biossíntese. Culturas de P. microphyllus produtoras de pilocarpina apresentaram uma clara tolerância às altas doses do alcalóide (crescimento semelhante ao controle), mesmo que não produzindo o alcalóide em altas quantidades. Isto sugere a existência de um mecanismo de detoxificação espécifico-específico nas células aqui estudadas, que evitam a toxicidade de seus alcalóides (pilocarpina e pilosina) armazenando-os no vacúolo. Nos ensaios de absorção do alcalóide em diferentes valores de pH, observou-se que quanto maior o pH, menor a absorção do alcalóide. Nos ensaios com os inibidores de proteínas transportadoras de membrana verificou-se que as menores taxas de inibição na absorção e liberação provocadas por inibidores específicos de ATPases, a bafilomicina e pelo NH4Cl, não descartam a participação destas proteínas, mas podem indicam uma menor participação, visto que a inibição provocada pela azida sódica, também um inibidor de ATPases, foi muito intensa. Contudo, os resultados de absorção e liberação de pilocarpina mostraram intensa inibição na presença dos inibidores de ABCs o que aponta para um transporte de pilocarpina mediado por esta família de proteínas, tanto para fora como para dentro da célula. Por fim, os ensaios de cinética apontam para uma inibição do tipo competitiva gerada pelos dois inibidores utilizados, sendo que os menores valores da Constante de Inibição (Ki), encontrados para a nifedipina indicam que este composto possue uma ação inibitória mais intensa que o vanadato de sódio. / Abstract: Leaves of species from Pilocarpus genus are the only known source of pilocarpine, an imidazole alkaloid, which has been used for the treatment of glaucoma and xerostomy. Because the leaves of jaborandi are collected from plants living in the wild and the high price of pilocarpine in the international market, jaborandi was included in the endangered species list of IBAMA. Looking for alternative sources of this alkaloid, it has been shown that cell suspension cultures of Pilocarpus microphyllus can be a model to study the production of pilocarpine as well as a model to study its biosynthesis and metabolism, as it produces the same alkaloids that are found in leaves. Previous studies showed that high concentrations of nitrogen and the medium pH resulted in higher production and release of pilocarpine to the medium culture. Therefore, the objective of this study was to define the cell intracellular accumulation of pilocarpine and verify if exogenous by supplied pilocarpine to jaborandi cell suspensions is toxic to the cells. Moreover, the absorption of pilocarpine by cells treated with exogenous by supplied pilocarpine at different medium pH, as well as, the alkaloid transport mechanism through the cell membrane, using inhibitors of the protein families ATPases and ATP-Binding Cassette, were studied. The histochemical tests and the cell fractionation assays showed the accumulation of pilocarpine in the vacuole. This, together with the results of experiments that showed that pilocarpine was not toxic to jaborandi cells, suggests that vacuolar transport may be one of the mechanisms for the detoxification of pilocarpine in this species. In the absorption assays with different medium pH, the higher the pH, the lower absorption of pilocarpine by the cells. Bafilomicin and NH4Cl, which are ATPase inhibitors, were the least effective inhibitors among all the inhibitors tested for absorption and release of pilocarpine. This result does not discard the participation of these proteins in the process but indicate that they are less important, in view of the fact that inhibition by sodium azide which affects both ABC and ATPases, was very effective. The results on absorption and release of pilocarpine by the jaborandi cells showed strong inhibition by specific ABC inhibitors, which indicates an important participation of this protein family in the transport of the alkaloid through the cell membranes. Kinetics assays showed that inhibition was a reversible competitive type in the presence of nifedipine and sodium vanadate. The lowest Inhibition Constant (Ki) was observed for nifepidine. / Mestrado / Mestre em Biologia Vegetal

A qualidade da energia elétrica tem sido objeto constante de estudos, pois problemas inerentes a ela podem trazer grandes prejuízos econômicos, principalmente em processos industriais. Dentre os vários fatores que afetam a qualidade da energia elétrica, destacamos aqueles relacionados com os transitórios, originados pelo chaveamento de banco de capacitares nas redes elétricas de distribuição primária. Neste trabalho, além das características dos transitórios provenientes da energização de bancos de capacitares da concessionária, são analisados fatores que influenciam em suas intensidades. As condições sob as quais estes transitórios são atenuados foram investigadas. Além disto, é feita uma análise espectral das ondas de corrente e tensão, permitindo que sejam revelados os componentes harmônicos que podem afetar o funcionamento de equipamentos de controle, proteção e cargas sensíveis da indústria. Um circuito que representa um sistema real de distribuição, 13,8 kV, da concessionária CPFL (Cia Paulista de Força e Luz) foi simulado através do ATP (Alternative Transients Program). / The quality of electric power has been a constant topic of study, because inherent problems to it can bring great economic losses, mainly in industrial processes. Among the several factors that atfect power quality, those related to the transients originated by capacitar bank switching in the primary distribution systems must be highlighted. In this work, the characteristics of the transients resulting from the switching of the utility capacitor banks are analyzed, as well as factors that influence their intensities. The conditions under which these effects are mitigated was investigated. In addition, a spectral analysis of the current and voltage waves is made. This procedure can reveal the harmonic components that can affect the operation of control and protection equipment, as well as sensitive Ioads of the industry. A circuit that represents a real distribution system, 13.8 kV, from CPFL (Cia Paulista de Força e Luz) utility, was simulated through the software ATP (Alternative Transients Program).

Este estudo foi realizado com o objetivo de desenvolvimento e validação do método microbiológico rápido empregando a técnica de bioluminescência de Adenosina Trifosfato (ATP) como método alternativo para o teste de esterilidade. O ATP reage com o sistema enzimático luciferina/luciferase e gera um fóton de luz em presença de íons magnésio, reação que pode ser utilizada na detecção de microrganismos. A luz gerada na reação é medida por um dispositivo chamado luminômetro, que traduz o sinal em unidades relativas de luz (URL), metodologia altamente sensível que pode ser utilizada na análise de produtos estéreis com o objetivo de diminuição no tempo do ensaio. Enquanto a turbidez do meio de cultura só pode ser visualizada quando o contaminante chega à concentração de 106 UFC/ml, a tecnologia de bioluminescência de ATP pode detectar amostras com concentração em torno de 104 UFC. Foram empregados na validação dados obtidos a partir do método tradicional de esterilidade (técnica de filtração) realizado paralelamente ao método alternativo. As soluções parenterais utilizadas nos ensaios foram: solução fisiológica 0,9%; solução de dextrose 5%; ringer lactato; e solução de metronidazol 0,5%. As soluções-teste foram inoculadas intencionalmente com suspensões microbianas preparadas através da diluição de Bioballs&#174, com concentrações de 10 UFC/100 ml, 2 UFC/100 ml e 0,4 UFC/100 ml. Após a realização do teste convencional, as membranas resultantes do ensaio foram incubadas nos meios de cultura caldo caseína de soja e tioglicolato. Alíquotas destes meios foram retiradas após 96 horas de incubação para análise pelo método alternativo. Os seguintes microrganismos foram selecionados para o estudo: Staphylococcus aureus, Bacilus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Clostridium sporogenes, Aspergillus brasiliensis, Kocuria rosea e Micrococcus luteus. A análise dos resultados obtidos mostrou que o método alternativo é capaz de detectar os microrganismos testados. Quanto à sensibilidade, o método alternativo apresentou vantagem na concentração 2 UFC/100 ml, e equivalência nas outras concentrações. A não interferência dos diferentes produtos e meios nos resultados encontrados permite vislumbrar evidência de robustez do método. Adicionalmente, em relação ao tempo de resposta, o método alternativo demonstrou ser equivalente ao convencional (p-valor=0,43). / This study is being conducted with a goal of validating and developing the fast microbiological method of ATP bioluminescence, as an alternative method to the sterility test. The ATP reacts with the enzymatic system luciferin-luciferase and produces light in the presence of magnesium ions, this reaction can be used for microorganism\'s detection. The light generated in this reaction can be measured by a device called luminometer that translates the signal in relative light units (RLU). This methodology has high sensibility and it can be used in the sterile products analysis with the objective of reducing the time of the sample. While the turbidity of the culture medium it can be visualized just when the sample reaches a concentration of 106 UCF per mL, the bioluminescence assay can detect samples at concentrations around 104 UCF per mL. The both methods, conventional (filtration technique) and alternative were done in parallel and the result data were used in the validation study. It was used in the assay the next parenteral solutions: physiological solution 0,9%, metronidazole solution 0,5%, dextrose solution 5% and Ringer lactate. The test solutions were inoculated with the microorganism suspensions, prepared by the dilution of the Bioballs® with result concentrations of 10 CFU/100 mL, 2 FU/100 mL and 0,4 CFU/ mL. After the conventional test was performed, the result membranes were incubated in thioglicollate and soybean casein broth. After 96 hours of incubation, aliquots from the broth were taken to perform the analysis by the alternative method. The following microorganisms were selected to perform the validation study: Staphylococcus aureus, Bacilus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Clostridium sporogenes, Candida albicans, Aspergillus brasiliensis, Kocuria rosea and Micrococcus luteus. The analysis of results shows that the alternative method can detect the test microorganisms. Regarding of the sensibility, the alternative method shows advantage in the 2 CFU/mL inoculum concentration and equivalence in the other two concentrations. The method shows evidence of robustness because the results were not affected by the products or culture media used in the assay. Additionally concerning the detection time, the alternative method was established equivalent to the conventional method (p-value=0,43).

Todas as células eucarióticas apresentam mecanismos para controlar e operar o cálcio (Ca2+). Apesar desse íon não ser importante para regulação osmótica e manutenção da concentração iônica da hemolinfa em crustáceos, ele é finamente regulado, pois desempenha papel fundamental no enrijecimento do exoesqueleto desses organismos. Dessa forma o crescimento e fisiologia desses organismos estão ligados ao massivo transporte de Ca2+ que ocorre através das células epiteliais durante o ciclo da muda. Para avaliar os mecanismos transportadores de Ca2+ presentes na membrana plasmática, foram utilizadas células isoladas a partir de hepatopâncreas de D. pagei, um crustáceo dulcícola. Quando essas células foram submetidas a um pulso de 1mM de ATP externo, ocorreu uma queda rápida (50 s) na concentração de cálcio intracelular ([Ca2+]i), que foi totalmente inibida por 10mM de vanadato e parcialmente por 2mM de amiloride, sugerindo que o efluxo ocorreu através de uma Ca-ATPase (PMCA) e de um trocador Na+/Ca2+ (NCX ou NHE), respectivamente. Essa queda foi seguida de uma recuperação dos valores iniciais, que pode ter ocorrido via influxo de Ca2+ do meio externo, sensível ao verapamil (1mM), ou através da liberação de Ca2+ de estoque intracelulares. Células incubadas em meio livre de Ca2+ apresentam uma redução no [Ca2+]i e quando são submetidas a um pulso de Ca2+ externo ocorre um influxo imediato do íon, que é sensível tanto a 1mM de verapamil quanto a 2mM de amiloride, sugerindo que a entrada ocorra via canais para cálcio e via trocador Na+/Ca2+, respectivamente. Juntos esses resultados sugerem que o transporte de cálcio em células isoladas de hepatopâncreas de D. pagei parece ocorrer de maneira semelhante ao modelo proposto em outros crustáceos: efluxo via Ca-ATPase (PMCA) sensível ao vanadato e via trocador Na+/Ca2+ (NCX ) sensível ao amiloride; influxo via canais para Ca2+ sensíveis ao verapamil e modo de influxo de Ca2+ do trocador Na+/Ca2+ ou trocador Na+/H+ (NHE) operando como Ca2+ /(n) Na+, sensíveis ao amiloride. Esses dados contribuem para um maior entendimento do transporte de cálcio em D. pagei (e outros crustáceos) e sua importância para a homeostase e o ciclo da muda. / All eukaryotic cells display several mechanisms to control and operate calcium (Ca2+). Although there is no apparent importance for hemolymph osmo-ionic regulation, it plays an essential role on exoskeleton calcification (hardening). Crustaceans growth and physiology are linked to massive calcium transport during molting cycle. The aim of this work was to evaluate calcium transport mechanisms in hepatopancreatic cells of the freshwater crab D. pagei. When these cells were exposed to external ATP pulse (1mM), it was observed a decrease in intracellular calcium concentration ([Ca2+]i), inhibited by 10mM vanadate and partially by 2mM amiloride, suggesting the involvement of a Ca-ATPase (PMCA) and Na+/Ca2+ exchanger (NCX ou NHE), respectively. Recovery of [Ca2+]i was inhibited by 1mM verapamil, a calcium channel blocker. The same was observed in calcium free environment and so, calcium must have been provided by intracellular stocks (endoplasmatic reticulum and/or mitochondria). When cells incubated in calcium free environment were exposed to calcium pulse (1mM or 10mM), a rapid rise in [Ca2+]i was observed, suggesting calcium influx. This could be partially inhibited by 1mM verapamil or 2mM amiloride, suggesting the participation of calcium channels and Na+/Ca2+ exchanger (Ca2+ influx mode), respectively. Calcium transport in these cell appears to be the same as described for other crustaceans: efflux occurs via a vanadate sensitive Ca-ATPase (PMCA) and by an amiloride sensitive Na+/Ca2+ (NCX exchanger); influx is mediated by a verapamil sensitive calcium channel and by an amiloride sensitive Na+/Ca2+ or Na+/H+ (NHE) operating as Ca2+ /(n) Na+ exchanger. Taken together, these data contributes to a better understanding of D. pagei calcium homeostasis and the moult cycle.

O ATP mediando a sinalização purinérgica no bulbo ventrolateral rostral contribui para o controle do quimiorreflexo central e periférico regulando a pressão arterial e a respiração, mediante o envolvimento dos neurônios do núcleo retrotrapezóide (RTN). No entanto, as potenciais contribuições da sinalização purinérgica, no RTN, na função cardiorrespiratória em animais não anestesiados ainda não foram testadas. Mostramos que a injeção de ATP no RTN promoveu aumento cardiorrespiratório por um mecanismo dependente de receptores P2. Mostramos também que o bloqueio de receptor P2 não específico (PPADS), mas não de receptores específicos P2Y (MRS2179), reduziu a resposta ventilatória à hipercapnia (7% CO2) e hipóxia (8 % O2) em ratos não anestesiados. Além disso, a adenosina (ADO) no RTN atenuou o aumento da ventilação induzido por hipercapnia in vivo e o disparo dos neurônios in vitro. Estes resultados demonstram que a sinalização mediada por ATP contribui para o controle respiratório do quimiorreflexo central e periférico em ratos acordados e uma vez que o ATP se metaboliza rapidamente em ADO, esta teria ação no balanço da resposta quimiorreceptora no RTN. / ATP-mediated purinergic signaling at the level of the rostral ventrolateral medulla (RVLM) contributes to both central and peripheral chemoreceptor control of breathing and blood pressure within the retrotrapezoid nucleus (RTN). However, potential contributions of purinergic signaling in the RTN to cardiorespiratory function in conscious animals has not been tested. We show that in the absence of functional C1 cells, ATP into the RTN increased cardiorespiratory output by a P2-recepor dependent mechanism. We also show that a non-specific P2 receptor blocker (PPADS) reduced the ventilatory response to hypercapnia (7% CO2) and hypoxia (8% O2) in unanesthetized awake rats. Conversely, a specific P2Y1-receptor blocker (MRS2179) into the RTN had no measurable effect on respiratory responses elicited by hypercapnia or hypoxia. Moreover, adenosine (ADO) into the RTN could attenuate the hypercapnia-induced increase in ventilation in vivo and firing rate in RTN neurons in vitro. These results demonstrate that ATP-mediated purinergic signaling contributes to central and peripheral chemoreflex control of breathing in awake rats and ADO could provide a balance between ATP stimulation and its inhibition in RTN during hipercapnia.

Submitted by isabela.moljf@hotmail.com (isabela.moljf@hotmail.com) on 2017-05-12T15:33:22Z No. of bitstreams: 1 thaisvieirasoares.pdf: 151024 bytes, checksum: dfb7ee8f9e6e385cff4e13ff23904a99 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-05-12T15:42:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 thaisvieirasoares.pdf: 151024 bytes, checksum: dfb7ee8f9e6e385cff4e13ff23904a99 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-12T15:42:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 thaisvieirasoares.pdf: 151024 bytes, checksum: dfb7ee8f9e6e385cff4e13ff23904a99 (MD5) Previous issue date: 2012-07-18 / FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Um polipeptídio originado do domínio B conservado da apirase de batata (r78-117), homólogo ao domínio B da isoforma ATPDase 2 de Schistosoma mansoni (r156-195), foi obtido como um polipeptídio com cauda de hexahistidina (r-potDomínio B). Anticorpos policlonais anti-r-potDomínio B, quando imobilizados em Proteína A-Sepharose, imunoprecipitaram 67-91% das atividades ATPásica e ADPásica de preparação de vermes adultos. Por “Western blots”, o soro imune reconheceu bandas de 63 e 55 kDa na preparação do parasito e no complexo imunoprecipitado, confirmando a identidade da isoforma ATPDase 2. Adicionalmente, anticorpos policlonais anti-r-potDomínio B inibiram 38-58% das atividades ATPásica e ADPásica, sugerindo que o domínio B da ATPDase 2 de S.mansoni é um novo alvo para o desenho de inibidores. Amostras de soros de pacientes com esquistossomose foram testados em ELISA usando r-potDomínio B como antígeno. A soropositividade da subclasse IgG1 (27%, 8/30), IgG2 (27%, 8/30), IgG3 (50%, 15/30) ou IgG4 (17%, 5/30) sugeriu que o domínio B da ATPDase 2 está potencialmente envolvido na resposta imune do hospedeiro. A apirase de batata ou r-potDomínio B, emulsificado em adjuvantes Completo e Incompleto de Freund, foi inoculado em camundongos Suíços, aumentando a produção de anticorpos IgG, os quais foram também reativos com antígenos solúveis de ovos (SEA). Imunidade protetora induzida por cada biomolécula foi avaliada 60 dias após o desafio com cercárias. Nenhuma redução de vermes ou do número de ovos foi observada. Camundongos imunizados com apirase de batata desenvolveram altos níveis de anticorpos IgG1 reativos com as biomoléculas e SEA, enquanto anticorpos IgG2a foram produzidos em menor proporção, sugerindo uma tendência de resposta imune do tipo Th2. O r-potDomínio B foi capaz de induzir maior produção de anticorpos IgG2a reativos com as biomoléculas e SEA, uma resposta imune possivelmente associada ao tipo Th1. Análises histológicas de cortes de fígado corados por hematoxilina-eosina, obtidos de camundongos imunizados com apirase de batata, mas não com r-potDomínio B, mostraram uma redução significativa na área do granuloma, como evidenciado pela redução do número de células e substituição por fibras de colágeno. Estudos futuros destas biomoléculas poderão contribuir para um melhor entendimento da interação parasito e hospedeiro, e poderão ser exploradas como novas ferramentas de estudo da esquistossomose. / A polypeptide belonging to the conserved domain B (r78-117) from the potato apyrase, homologue to the domain B (r156-195) from the S. mansoni ATPDase 2 isoform, was obtained as a 6xHis tag polypeptide (r-potDomain B). Polyclonal anti-r-potDomain B antibodies, when immobilized on Protein A-Sepharose, immunoprecipitated 67-91% of the ATPase and ADPase activities from the adult worm preparation. By Western blots, the immune serum recognized band of 63 and 55 kDa in both parasite preparation and immunoprecipitated complex, confirming the ATPDase 2 identity. Additionally, polyclonal anti-r-potDomain B antibodies inhibited 38-58% of the ATPase and ADPase activities, suggesting that the domain B from the S.mansoni ATPDase 2 is a new target for inhibitor design. Serum samples from patients with schistosomiasis were tested in ELISA using r-potDomain B as coating antigen. The seropositivity of the subclass IgG1 (27%, 8/30), IgG2 (27%, 8/30), IgG3 (50%, 15/30) or IgG4 (17%, 5/30) suggested that the domain B from the ATPDase 2 is potentially involved in the host immune response. The potato apyrase or r-potDomain B, emulsified in Freund Complete and Incomplete adjuvants, was inoculated in Swiss mice, increasing the IgG antibodies production, which were also reactive with soluble egg antigens (SEA). Protective immunity induced by each biomolecule was evaluated 60 days after challenge infection. No worm burden or egg number reduction was observed. Mice immunized with potato apyrase developed high IgG1 antibody levels, reactive with either biomolecules or SEA, while IgG2a antibody levels were produced in lower proportion, suggesting a tendency of a Th2 type immune response. The r-potDomain B was able to induce higher IgG2a antibody production, an immune response possibly associated to the Th1 type. Histological analyses of haematoxylin-eosin-sections obtained from mice immunized with potato apyrase, but not with r-potDomain B, showed a significant reduction in liver granuloma area as evidenced by the cells number reduction and substitution by collagen fibbers. Further studies of these biomolecules could contribute to a better understanding of host-parasite interactions, and may to be explored as new tools in schistosomiasis research.