A sepse causa uma alta taxa de mortalidade no mundo. A fisiopatologia da doença envolve uma rede complexa de mediadores inflamatórios que promovem a lesão de diversos tecidos, além de diversas alterações hemodinâmicas e disfunção do sistema nervoso autonômico (SNA). Assim sabe-se que o sistema nervoso cumpre um papel importante no controle da inflamação sistêmica mediante a via colinérgica anti-inflamatória (VCA) através do receptor nicotínico de acetilcolina alfa7 (alfa7nAChR). O uso das células-tronco mesenquimais (CTM) tem mostrado efeitos benéficos em diversos ensaios clínicos de doenças inflamatórias. Neste contexto, as células-tronco mesenquimais derivadas da geleia de Wharton do cordão umbilical (CTM-GW) tornam-se promissórias, uma vez que essas células são reconhecidas pela regulação da resposta imunológica, reparação neural, efeito anti-apoptose, assim como a melhora da sobrevida na sepse, em modelos experimentais. Nossa hipótese foi de que as CTM-GW poderiam cumprir um papel neuroimunomodulador através da VCA e atenuar a disfunção de múltiplos órgãos em um modelo animal de sepse de ligadura e punção do ceco (LPC). Inicialmente células da matriz do cordão umbilical foram isoladas e caracterizadas de acordo com o consenso internacional vigente. Ratos Wistar machos adultos foram subdivididos em grupos: 1) sham (operação simulada); 2) LPC; 3) LPC+CTM-GW (injetado 106 CTM-GW via intraperitoneal, i.p. 6 h após LPC) e 4) LPC+MLA+CTM-GW (MLA: Metillicaconitine, antagonista do alfa7nAChR, i.p., 5:30 h após LPC e 106 CTM-GW 6h após). Às 24 horas após LPC, foram avaliadas a função cardiovascular, hemodinâmica assim como os outros parâmetros. Interessantemente, o tratamento com CTM-GW na sepse atenuou a disfunção diastólica e protegeu a sensibilidade baroreflexa. Além disso, as CTM-GW estimularam a atividade autonômica, simpática e parassimpática no coração. Observamos que o tratamento celular induziu uma regulação da expressão do receptor alfa7nAChR e TLR4 no baço e no coração, assim como a redução da relação p-STAT3TYR705 e STAT3 total no baço. Outros efeitos importantes e adicionais foram a diminuição da infiltração de leucócitos e a regulação das citocinas pró-inflamatórias pelas células. O bloqueio da VCA usando MLA confirmou que o receptor alfa7nAChR pode ser um provável alvo, chave da ação das CTM entre vários outros mecanismos envolvidos na resposta imune. Finalmente, as CTM-GW conseguiram reduzir a apoptose no pulmão e no baço independentemente da VAC reforçando o conceito de que as células-tronco tem efeitos diversos além da imuno-regulação. Em conclusão, as CTM-GW na sepse foram capazes de atenuar a lesão cardiopulmonar assim como modular a atividade autonômica, reduzindo a inflamação sistêmica, pelo menos em parte, através da via colinérgica anti-inflamatória. Indubitavelmente todos estes efeitos anteriormente descritos e em associação se demonstraram fundamentais no mecanismo de reparo e proteção tecidual em resposta a sepse. Mais estudos pré-clínicos e futuros testes clínicos precisam ser realizados para maior compreensão destes mecanismos bem como uma possível validação terapêutica / Sepsis induces organ dysfunction due to overexpression of the inflammatory host response, involving cardiorespiratory and autonomic dysregulation, thus increasing the associated morbidity and mortality. The cholinergic anti-inflammatory pathway (CAP) is mediated by nervous system through alpha7 nicotinic acetylcholine receptor (alpha7nAChR). This receptor has an important role in systemic inflammation control. Wharton\'s jelly-derived mesenchymal stem cells (WJ-MSCs) are known to express genes and secreted factors related to neurological and immunological protection, as well as to improve survival in experimental sepsis. We hypothesized that WJ-MSCs play a modulatory role through the CAP and attenuate sepsis-induced organ injury in a cecal ligation and puncture (CLP) model. Rats were randomly divided into 4 groups: 1) Control (sham-operated); 2) submitted to CLP without treatment; 3) submitted to CLP and treated with 106 WJ-MSCs 6 h later and 4) CLP+MLA+WJ-MSC group (MLA: Methyllycaconitine, alpha7nAChR antagonist). All experiments were performed 24 h post-surgery. Echocardiographic parameters and heart rate variability were assessed. Importantly, treatment with WJ-MSCs attenuated diastolic heart failure and recovered barorreflex sensitivity. Moreover, WJ-MSCs injection increased cardiac sympathetic and cardiovagal activity. In cardiac and splenic tissue, WJ-MSC treatment downregulated TLR4 and alpha7nAChR expression, as well as it reduced p-STAT3/Total STAT3 ratio in the spleen. In addition, WJ-MSC reduced leukocyte infiltration and pro-inflammatory cytokines, which only were abolished by MLA treatment. Finally, WJ-MSC treatment diminished apoptosis in lung and spleen tissue. Together these findings suggest that treatment with WJ-MSCs appears to protect against sepsis-induced organ injury reducing systemic inflammation, at least in part, through cholinergic anti-inflammatory pathway

Congenital myasthenic syndromes (CMS) are a group of heterogeneous disorders caused by mutations in genes encoding for proteins that are essential for neuromuscular transmission. All CMS share the clinical feature of fatigable muscle weakness. The differential diagnosis of CMS is wide, with a range of diseases going from autoimmune myasthenia gravis to muscle disorders. In this thesis, it was shown that measuring antibodies to clustered acetylcholine receptors (AChRs) by cell-based assay is helpful in the differential diagnosis of CMS. The findings of the current investigations showed that mutations in COL13A1, encoding the Collagen Type XIII α1 chain, were responsible for the symptoms of several patients with previously undefined myasthenias. In addition, this work described the clinical and complementary features of a novel CMS subtype due to mutations in the glycosylation pathway gene GMPPB. Investigations on a novel MUSK missense mutation (p.Ala617Val) uncovered previously unrecognised mechanisms of how levels of MuSK phosphorylation are critical to maintain synaptic structure, and guided suitable treatment for the patient. The study on the clinical and molecular basis of stridor, a novel clinical feature recently identified in patients with DOK7-CMS, prompted the identification of a novel DOK7 isoform, which warrants further investigation to elucidate its role in AChR clustering. Finally, the therapy of patients with severe AChR-deficiency was optimised thanks to a case series study that showed a robust improvement following the addition of β2-adrenergic agonists to their long-term treatment regime that included pyridostigmine.

Chlamydia trachomatis is the most prevalent agent of bacterial sexually transmitted infections in the world. However, a profuse number of cases are unreported, as the infection is often asymptomatic. Sequelae such as pelvic inflammatory disease, an increased risk of cervical cancer, premature birth, and perinatal infections in pregnant women can occur. Inflammation occurs in the body in response to infection or injury. Although inflammation can lead to some unwanted secondary effects, such as pain, it serves to return the body to homeostasis by restoring injured tissues and eliminating pathogens. One recently identified connection between the central nervous system and the immune system that regulates inflammation is the cholinergic anti-inflammatory pathway (CAP). In the CAP, pathogen-associated molecular patterns stimulate the vagus nerve to activate the pathway, which ultimately results in acetylcholine (ACh) release, which down regulates inflammation. We hypothesized that genital chlamydial infection would increase the expression of choline acetyltransferase (ChAT), the enzyme that synthesizes ACh, in the female murine genital tract, therefore down regulating inflammation and promoting chlamydial infection. Transgenic female mice carrying a ChAT-promoter driven GFP reporter gene were vaginally infected with C. muridarum. Mice were sacrificed on days 3, 9, 15, and 21 post infection; cervical, uterine horn, and ovarian tissues were removed and embedded in paraffin. Small sections of each tissue were cut and mounted onto slides. The tissue sections were then stained for the expression of ChAT using immunohistochemical techniques. Finally, tissue sections were viewed under a microscope for positive staining and the data was analyzed. The results indicated that there is a significant increase in the number of cells that express ChAT in genital tract of chlamydia-infected mice versus non-infected mice.

Abstract not available

ΜΕΛΕΤΗ Α΄ Στόχος: Να διερευνηθεί αν ο κινητικός υπότυπος της αστάθειας κορμού και δυσχέρειας της βάδισης (ΑΚΔΒ) σχετίζεται με τη γνωστική δυσλειτουργία που εμφανίζουν οι ασθενείς με νόσο του Parkinson (NP) χωρίς άνοια. Μέθοδοι: Χορηγήσαμε μια συστοιχία επιλεγμένων νευροψυχολογικών δοκιμασιών σε δύο ομάδες μη ανοϊκών ασθενών με ήπια έως μέτριας βαρύτητας νόσο κατηγοριοποιημένους είτε στον υπότυπο της ΑΚΔΒ είτε σε υπότυπο μη ΑΚΔΒ, καθώς και σε μια ομάδα υγιών μαρτύρων. Οι ομάδες εξισώθηκαν κατά το δυνατόν όσον αφορά δυνητικούς συγχυτικούς παράγοντες που επηρεάζουν τις νευροψυχολογικές επιδόσεις. Αποτελέσματα: Δε διαπιστώθηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των δύο ομάδων ασθενών στην επίδοση σε οποιαδήποτε από τις χορηγηθείσες νευροψυχολογικές δοκιμασίες. Παρόλα αυτά, σε σχέση με τους μάρτυρες υπήρξε μια τάση διαφοροποίησης ως προς το κυρίαρχο πρότυπο της γνωστικής δυσλειτουργίας. Η ομάδα με τον υπότυπο της ΑΚΔΒ είχε βραδύτερες επιδόσεις σε μια δοκιμασία ψυχοκινητικής ταχύτητας και γνωστικής ευελιξίας, ενώ η ομάδα με υπότυπο της νόσου μη ΑΚΔΒ είχε χειρότερες επιδόσεις στις μετρήσεις της λεκτικής μάθησης και της οπτικοχωρικής αντίληψης. Συμπεράσματα: Ο υπότυπος της ΑΚΔΒ δε συσχετίσθηκε με σοβαρότερα γνωστικά ελλείμματα και έτσι είναι πιθανό οι μηχανισμοί της γνωστικής δυσλειτουργίας να είναι, έως ένα ορισμένο βαθμό, κοινοί ανεξάρτητα από τον κινητικό υπότυπο της νόσου. ΜΕΛΕΤΗ Β Στόχος: Να διερευνηθεί αν υπάρχει συσχέτιση μεταξύ της ΝΡ και του γονιδίου CHRNA4, το οποίο κωδικοποιεί την α4 υπομονάδα του α4β2 νικοτινικού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης (nAChR). Mέθοδοι: Στη μελέτη συμμετείχαν 100 ασθενείς με ΝΡ και 105 μάρτυρες, εξισωμένοι ως προς την ηλικία και το φύλο και ανήκοντες στην ίδια πληθυσμιακή ομάδα με τους ασθενείς. Ο γενετικός δείκτης που εξετάσθηκε είναι ένας μονονουκλεοτιδικός πολυμορφισμός στο 5ο εξόνιο του γονιδίου CHRNA4 (dbSNP rs1044396). Έγινε απομόνωση DNA γονιδιώματος από περιφερικό αίμα και ακολούθησε ανάλυση μεγέθους περιοριστικών τμημάτων μετά από αλυσωτή αντίδραση πολυμεράσης και κατάτμηση των προϊόντων αυτής με το ένζυμο Hha I. Μια υποομάδα 42 ασθενών υποβλήθηκαν επίσης σε λεπτομερή κλινική και νευροψυχολογική εκτίμηση. Η στατιστική ανάλυση για τη σύγκριση της συχνότητας των αλληλομόρφων και των γονοτύπων μεταξύ των ομάδων έγινε με τη δοκιμασία χ2, και τον ακριβή έλεγχο Fisher εάν έστω ένα κελί είχε n<5. Υπολογίστηκαν οι σχετικοί κίνδυνοι και τα κατά 95% διαστήματα αξιοπιστίας τους που αντιστοιχούσαν στα αλληλόμορφα και τους γονότυπους. Χρησιμοποιήθηκε η λογιστική ανάλυση παλινδρόμησης εάν ήταν απαραίτητη η προσαρμογή για την ηλικία ή το φύλο. Αποτελέσματα: Οι συχνότητες των γονοτύπων στην ομάδα των ασθενών (TT 34%; CT 58%; CC 8%) σε σύγκριση με τις συχνότητες των γονοτύπων στην ομάδα των μαρτύρων (TT 28.6 %; CT 47.6%; CC 23.8 %) παρουσίασαν στατιστικά σημαντική διαφορά (χ2 = 9.48, df = 2, p = 0.009). Η ομοζυγωτία CC συσχετίσθηκε με χαμηλότερο κίνδυνο παρουσίας της ΝΡ (CC vs φορείς T: OR = 0.28; 95% CI = 0.12–0.65; p = 0.002; στατιστική ισχύς 93.1%). Παρατηρήθηκε επίσης απόκλιση στην κατανομή των αλληλομόρφων μεταξύ των ασθενών και των μαρτύρων. Υπήρχε σημαντικά χαμηλότερη συχνότητα του αλληλόμορφου C μεταξύ των ασθενών (37%) σε σχέση με τους μάρτυρες (47.6%) (χ2 = 4.73; df = 1; OR=0.65; 95% CI = 0.44–0.96; p = 0.03). Η ανάλυση διαστρωμάτωσης έδειξε ότι η διαφορά στην κατανομή των γονοτύπων μεταξύ ασθενών και μαρτύρων ήταν στατιστικά σημαντική και συγκριτικά μεγαλύτερη στο θήλυ φύλο σε σχέση με το άρρεν φύλο και στους ασθενείς με εκδήλωση ΝΡ σε όψιμη ηλικία ( > 50 ετών) σε σχέση με αυτούς που εμφάνισαν πρώιμης έναρξης νόσο (< 50 ετών). Οι ασθενείς με ΝP που ανιχνεύθηκαν να φέρουν το γονότυπο CC και υποβλήθηκαν σε νευροψυχολογική αξιολόγηση έτειναν να έχουν καλύτερα διατηρημένες τις γνωστικές λειτουργίες που σχετίζονται με την προσοχή και την ταχύτητα επεξεργασίας των πληροφοριών. Συμπεράσματα: Η παρουσία του αλληλομόρφου C (dbSNP rs1044396) του γονιδίου CHRNA4 συνδέεται με μειωμένο κίνδυνο ΝΡ κατά 35%. Επίσης, τα άτομα με το γονότυπο CC εμφανίζουν σχεδόν τρισήμισυ (3,5) φορές χαμηλότερο κίνδυνο νόσου του Parkinson. Η ποικιλομορφία του γονιδίου CHRNA4 φαίνεται ότι σχετίζεται ιδιαίτερα με την επιρρέπεια εκδήλωσης της ΝΡ με ηλικιακά όψιμη έναρξη της νόσου, και επίσης με τις γνωστικές λειτουργίες των ασθενών χωρίς άνοια, ειδικά αυτές που εξαρτώνται από την προσοχή και την οπτικοκινητική αντίληψη. / Study A Aim: To investigate whether there is an association of the postural instability and gait difficulty (PIGD) motor subtype with cognitive dysfunction in non-demented Parkinson’s disease (PD) patients. Methods: We administered a battery of selected neuropsychological tests to assess attention, psychomotor speed, executive functions (set shifting ability and inhibitory control), visuospatial perception and visual constructive ability to two groups of non-demented patients with mild to moderate disease classified either as PIGD or as non-PIGD subtype and to a group of healthy controls. Groups were matched on potential confounders of neuropsychological performance. Results: No significant differences were revealed between the two groups of patients in the performance of any of the administered neuropsychological tests. However, relative to controls there was a tendency towards a differential pattern of cognitive dysfunction. The PIGD group had slower performance in a test of psychomotor speed and cognitive flexibility, whilst the non-PIGD group performed worse in measures of verbal learning and visuo-spatial perception. Conclusions: The PIGD subtype was not associated with more severe cognitive deficits and may to a certain extent share common mechanisms of cognitive dysfunction with non-PIGD subtypes. Study B Aim: to investigate whether there is an association between PD and a variation in the CHRNA4 gene coding for the α4 subunit, the primary subunit of the α4β2 brain nicotinic acetylcholine receptors. Methods: Patients (N=100) and controls (N=105), matched on the basis of sex, age and ethnicity, were genotyped for a single nucleotide polymorphism at cDNA position 1860 lying within the 5th exon of the CHRNA4 gene. DNA was extracted from peripheral blood samples and genotyping was done by PCR-based restriction fragment length polymorphism analysis. A subset of 42 patients also received detailed clinical and cognitive assessments. Comparisons of allele and genotype frequencies between groups were performed using the χ2 test, and the Fisher exact test if one cell had n<5. The relative risk for genotypes and alleles was estimated through calculation of odds ratios (ORs) with 95% confidence intervals (CIs). Logistic regression analysis was used if adjustment for age or sex was necessary. Results: The genotype frequencies in the patients group (TT 34%; CT 58%; CC 8%) vs. the genotype frequencies in the control group (TT 28.6 %; CT 47.6%; CC 23.8 %) demonstrated a statistically significant difference (χ2 = 9.48, df = 2, p = 0.009). CC homozygosity was associated with a lower risk of PD (CC vs T carriers: OR = 0.28; 95% CI = 0.12–0.65; p = 0.002). Also, the allelic distribution was significantly different between patients and controls. There was a significantly lower frequency of the C allele among the patients with PD (37%) as compared with the controls (47.6%) (χ2 = 4.73; df = 1; OR=0.65; 95% CI = 0.44–0.96; p = 0.03). Stratified analysis showed that the difference in the genotypic distribution between cases and controls was significant among females but did not reach significance among males. The frequency of CC homozygotes was also significantly lower in the group of patients with late onset PD than in the controls, but it was not significantly different between the early onset group of patients and the controls. CC homozygotes also tended to have better performance than T carriers on measures of attention and psychomotor speed (Trail Making Test part A and Symbol Digit Modalities Test). Conclusions: The presence of the C allele at SNP rs1044396 of the CHRNA4 gene is associated with a decreased risk for PD by 35%. Moreover, the CC genotype lowers the risk for PD by ~ 3.5 fold. Variation in the CHRNA4 gene may particularly influence susceptibility for late onset PD and further be associated with measurable effects on overt cognitive performance of yet not-demented PD patients, specifically the part loading on attentional capacities.

Introduction. Plusieurs maladies neurodégénératives bénéficieraient de meilleures ap-proches diagnostiques, dont la maladie d’Alzheimer. Celle-ci affecte en particulier les systèmes cholinergiques du SNC, et de nombreuses études d’imagerie ont tenté d’évaluer la dégénérescence de ce système à des fins diagnostiques, à l’aide de ligands radioactifs de diverses composantes du système ACh. En définitive, la plupart de ces études ne se sont pas montrées satisfaisantes. À la recherche de meilleures approches dans ce domaine, nous avons décidé d’évaluer les possibilités offertes par le (-)-[18F]Fluoroethoxy-benzovesamicol ((-)-[18F]FEOBV), un agent émetteur de positons se liant au VAChT de façon spécifique et réversible. Avant d’en arriver à une utilisation humaine cependant, une validation animale en plusieurs étapes s’avère nécessaire, mais celle-ci nous est apparue justifiée à la lumière de résultats d’études préliminaires en TEP chez le rat, qui se sont montrées très prometteuses. Nous nous sommes donc attaqués à la caractérisation du métabolisme de cet agent. Ceci a exigé, dans un premier temps, la mise au point d’une méthode chromatographique d’analyse des métabolites sanguins et, dans un deuxième temps, l’évaluation de ces métabolites et de leur cinétique chez le rat. Ces données permettront ultérieurement, chez l’humain, de procéder à des études quantitatives en TEP. Étude #1: Une fois les paramètres chromatographiques optimisés, le TR du (–)-FEOBV fut établi à 7.92 ± 0.18 minutes. Étude #2 : Le métabolisme in vivo s’est montré très rapide et temporellement variable, mais un seul métabolite hydrophile a été identifié. La fonction d’apport au cerveau du (–)-[18F]FEOBV a pu être établie après correction pour la présence du métabolite détecté. Conclusion. Dans l’ensemble, le (–)-[18F]FEOBV semble très prometteur en tant que marqueur biologique du système cholinergique pré-synaptique. / Background. Several neurodegenerative diseases would benefit from better diagnostic tools, and Alzheimer’s disease is an obvious point in case. Of interest, that disease par-ticularly affects CNS cholinergic systems. Many studies have evaluated neurodegenera-tion in that system during the course of Alzheimer’s disease, some using imaging tech-niques with radioactive ligands targeting the cholinergic system. However, most of those studies have shown rather unsatisfying results. Therefore, our team has decided to evaluate a so far never used in primates positron emitting ligand of the VAChT which reversibly binds to its target, (-)-[18F]Fluoroethoxy-benzovesamicol ((-)-[18F]FEOBV). Of course, before being able to use this ligand in a clinical setting, a multi-step animal validation needs to be performed. As initial experiments with PET imaging yielded encouraging results, assessing the metabolism of (-)-[18F]FEOBV was the next logical step. First, an HPLC methodology had to be developed to analyse blood metabolites. Then, we were able to use that methodology to analyse metabolites and their kinetics in the rat. That data will allow quantitative studies in humans with PET. Study #1: After the chromatographic parameters had been optimised, the TR of (–)-FEOBV was established at 7.92 ± 0.18 minutes. Study#2 In vivo metabolism was found to be fairly rapid and somewhat temporally variable, but a lone hydrophilic metabolite was identified. The plasmatic input function was obtained and corrected for metabolism. Conclusion. Overall, (–)-[18F]FEOBV holds promise as a potential ACh system pre-synaptic marker.

Les systèmes cholinergique et dopaminergique jouent un rôle prépondérant dans les fonctions cognitives. Ce rôle est exercé principalement grâce à leur action modulatrice de l’activité des neurones pyramidaux du cortex préfrontal. L’interaction pharmacologique entre ces systèmes est bien documentée mais les études de leurs interactions neuroanatomiques sont rares, étant donné qu’ils sont impliqués dans une transmission diffuse plutôt que synaptique. Ce travail de thèse visait à développer une expertise pour analyser ce type de transmission diffuse en microscopie confocale. Nous avons étudié les relations de microproximité entre ces différents systèmes dans le cortex préfrontal médian (mPFC) de rats et souris. En particulier, la densité des varicosités axonales en passant a été quantifiée dans les segments des fibres cholinergiques et dopaminergiques à une distance mutuelle de moins de 3 µm ou à moins de 3 µm des somas de cellules pyramidales. Cette microproximité était considérée comme une zone d’interaction probable entre les éléments neuronaux. La quantification était effectuée après triple-marquage par immunofluorescence et acquisition des images de 1 µm par microscopie confocale. Afin d’étudier la plasticité de ces relations de microproximité, cette analyse a été effectuée dans des conditions témoins, après une activation du mPFC et dans un modèle de schizophrénie par déplétion des neurones cholinergiques du noyau accumbens. Les résultats démontrent que 1. Les fibres cholinergiques interagissent avec des fibres dopaminergiques et ce sur les mêmes neurones pyramidaux de la couche V du mPFC. Ce résultat suggère différents apports des systèmes cholinergique et dopaminergique dans l’intégration effectuée par une même cellule pyramidale. 2. La densité des varicosités en passant cholinergiques et dopaminergiques sur des segments de fibre en microproximité réciproque est plus élevée comparé aux segments plus distants les uns des autres. Ce résultat suggère un enrichissement du nombre de varicosités axonales dans les zones d’interaction. 3. La densité des varicosités en passant sur des segments de fibre cholinergique en microproximité de cellules pyramidales, immunoúactives pour c-Fos après une stimulation visuelle et une stimulation électrique des noyaux cholinergiques projetant au mPFC est plus élevée que la densité des varicosités de segments en microproximité de cellules pyramidales non-activées. Ce résultat suggère un enrichissement des varicosités axonales dépendant de l’activité neuronale locale au niveau de la zone d'interaction avec d'autres éléments neuronaux. 4. La densité des varicosités en passant des fibres dopaminergiques a été significativement diminuée dans le mPFC de rats ayant subi une déplétion cholinergique dans le noyau accumbens, comparée aux témoins. Ces résultats supportent des interrelations entre la plasticité structurelle des varicosités dopaminergiques et le fonctionnement cortical. L’ensemble des donneès démontre une plasticité de la densité locale des varicosités axonales en fonction de l’activité neuronale locale. Cet enrichissement activité-dépendant contribue vraisemblablement au maintien d’une interaction neurochimique entre deux éléments neuronaux. / The cognitive functions of the rat medial prefrontal cortex (mPFC) are modulated by ascending modulatory systems such as the cholinergic and dopaminergic afferent systems. However, despite the well-documented pharmacological interactions between the cholinergic and dopaminergic afferents and pyramidal cells in the PFC, there is only scarce neuroanatomical data on the reciprocal interrelationships between these neuronal elements in the mPFC. This might be due to the diffuse rather than synaptic transmission mode of intercellular communication of the cholinergic system in the mPFC. For these reasons, the neuroanatomical relationships between the cholinergic and dopaminergic systems and pyramidal cells in the mPFC are examined, with an emphasis on the local density of the cholinergic and dopaminergic axon varicosities. To analyze the plasticity of these interrelationships, the two systems were examined in condition of increased neuronal activity in the mPFC, or of decrease dopaminergic activity in a model of schizophrenia. The microproximity relationships between cholinergic and dopaminergic fibers as well as with pyramidal cells were studied in the mPFC of rats and mice. In particular, the number of axon varicosities in cholinergic and dopaminergic fiber segments within 3 µm from each other or from pyramidal cells were quantified. This microproximity was considered as a possible interaction zone between two neuronal elements. Quantification was performed using triple immunofluorescence labeling and acquisition of 1 µm optic sections using confocal microscopy. To assess the plasticity of these relationships, the analysis has been performed in control condition as well as after a cortical activation or a decreased dopaminergic input in a schizophrenia model. Our results demonstrate a neuroanatomical convergence of cholinergic and dopaminergic fibers on the same pyramidal cell from layer V (output) of mPFC, suggestinggests the integration of different types of inputs by the same pyramidal cell, which may be transmitted to subcortical areas to execute prefrontal cognitive control. Close apposition between cholinergic and dopaminergic fibers could also be seen in the mPFC. There was an increase of the density of cholinergic and dopaminergic en passant varicosities on those fiber segments within microproximity of each other, compared to those outside the reciprocal microproximity, supporting functional importance of the close apposition between those two ascending neuromodulatory systems into the mPFC. There was enrichment of cholinergic en passant varicosities on the fiber segments within microproximity of c-Fos activated pyramidal cells in the mPFC of visually and HDB electrically stimulated rats, indicating association between axonal varicosity density and the local neuronal activity. There was decrease of dopaminergic en passant varicosities in the mPFC of rats with ChAT depletion in the N.Acc., compared to controls. This evidence supports the association between dopaminergic axonal varicosities and relevant neuronal activity in a complex neuronal network. This thesis shows that the density of cholinergic and dopaminergic axonal varicosity density in the mPFC is influenced by and contributes to the relevant local neuronal activity from the interactions of different transmitter systems. Such interactions of different systems in a complex and intricate prefrontal neuronal network endeavour to maintain the delicate balance for cognitive processes.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Οι νικοτινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης (nAChRs) ανήκουν στην υπερ-οικογένεια των ιοντικών καναλιών που ενεργοποιούνται από τη δέσμευση ενός προσδέτη (LGICs) και αποτελούνται από πέντε ομόλογες υπομονάδες. Κάθε μονομερής υπομονάδα αποτελείται από μία Ν-τελική εξωκυττάρια περιοχή (ΕΚΠ), από τέσσερεις διαμεμβρανικές α-έλικες και από μία κυτταροπλασματική περιοχή. Στην ΕΚΠ βρίσκεται η χαρακτηριστική Cys-θηλιά της υπερ-οικογένειας, καθώς και οι θέσεις πρόσδεσης αγωνιστών και ανταγωνιστών του υποδοχέα. Οι γνώσεις μας γύρω από τη δομή των nAChRs προέρχονται κυρίως από κρυσταλλογραφικές δομές ομολόγων πρωτεϊνών δέσμευσης της ACh (AChBP) μαλακίων, από μια δομή του nAChR από ιχθείς του γένους Torpedo που προέρχεται από ηλεκτρονική μικροσκοπία, από την κρυσταλλογραφική δομή της α1-ΕΚΠ ποντικού σε σύμπλοκο με α-μπουγκαροτοξίνη (α-Btx) και από κρυσταλλογραφικές δομές δύο προκαρυωτικών LGICs. Παρά τη μεγάλη πρόοδο που πραγματοποιήθηκε με τα παραπάνω επιτεύγματα, ακόμη δεν έχει επιλυθεί πειραματικά η δομή ανθρώπινου υποδοχέα. Επίσης λίγα είναι γνωστά για την επίδραση της γλυκοζυλίωσης των ΕΚΠ στη λειτουργία του nAChR. Χρησιμοποιώντας ως εκμαγείο την κρυσταλλογραφική δομή του συμπλόκου α1-ΕΚΠ ποντικού/α-Btx δημιουργήθηκαν υπολογιστικά μοντέλα της ανθρώπινης α1-ΕΚΠ προσδεμένης στις τοξίνες α-μπουγκαροτοξίνη (α-Btx), α-κομπρατοξίνη (α-Cbtx), α-κωνοτοξίνη (α-Ctx) ImI και α-κωνοτοξίνη GI. Στα σύμπλοκα με α-Btx και α-Cbtx προστέθηκε η υδατανθρακική αλυσίδα, συνδεδεμένη με το κατάλοιπο Asn141, που συγκρυσταλλώθηκε μαζί με την α1-ΕΚΠ ποντικού. Για να μελετηθεί η δυναμική συμπεριφορά της αλληλεπίδρασης υποδοχέα-τοξίνης καθώς και η συνεισφορά των σακχάρων σε αυτήν πραγματοποιήθηκαν προσομοιώσεις Μοριακής Δυναμικής σε υδατικό περιβάλλον. Με τη χρήση υπολογιστικών εργαλείων για τη μελέτη των συμπλόκων προσδιορίστηκαν σε ατομικό επίπεδο οι αλληλεπιδράσεις που καθοδηγούν την πρόσδεση τοξινών στην α1-ΕΚΠ. Βρέθηκε ότι η υδατανθρακική αλυσίδα συμμετέχει δυναμικά στη δέσμευση της τοξίνης στον υποδοχέα. Τα σάκχαρα συγκλίνουν προς την προσδεμένη τοξίνη στηριζόμενα στα κατάλοιπα Ser187 και Trp184 της α1 υπομονάδας. Η τοξίνη επίσης μετακινείται φέρνοντας τη θηλιά Ι σε επαφή με τα σάκχαρα. Αναγνωρίστηκαν σημαντικές αλληλεπιδράσεις των σακχάρων με τα τοξινικά κατάλοιπα Thr6, Ser9, και Th15 της α-Btx και Thr6 και Pro7 της α-Cbtx. Επίσης επιβεβαιώθηκε η ύπαρξη μιας υδρόφιλης κοιλότητας στο εσωτερικό του υδρόφοβου πυρήνα της α1-ΕΚΠ, η οποία πιθανόν εμπλέκεται στο άνοιγμα του ιοντικού καναλιού του nAChR. Τα αποτελέσματα αυτά παρέχουν σημαντικά δεδομένα για την κατανόηση της επίδρασης της υδατανθρακικής αλυσίδας στη λειτουργία του υποδοχέα, η οποία μπορεί να αξιοποιηθεί στην αντιμετώπιση των πολλών παθολογικών καταστάσεων στις οποίες εμπλέκονται οι nAChRs. / Nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) belong to the superfamily of ligand-gated ion channels (LGICs). LGICs form homo- or hetero-pentamers of related subunits, and each of them consists of a N-terminal extracellular ligand-binding domain (ECD), four transmembrane α-helixes and an intracellular region. The characteristic Cys-loop of the superfamily is found in the ECD of each subunit. The ECD also contains binding sites for agonists and competitive antagonists. Our knowledge regarding the nAChR structure mainly derives from the X-ray crystal structures of the molluscan ACh-binding proteins (AChBPs), the electron microscopy structure of the Torpedo nAChR, the X-ray crystal structure of the mouse nAChR α1-ECD bound to α-bungarotoxin (α-Btx), and the X-ray crystal structures of two prokaryotic LGICs. Despite the progress made by these achievements, the determination of any human nAChR structure has not yet been accomplished. Furthermore, the effect of glycosylation on nAChR function has not yet been explored. Based on the crystal structure of the extracellular domain of the mouse nAChR α1 subunit bound to α-Btx we have generated in silico models of the human nAChR α1-ECD bound to the toxins α-bungarotoxin (α-Btx), α-cobratoxin (α-Cbtx), α-conotoxin (α-Ctx) ImI and α-conotoxin GI. In the case of the α1-ECD/α-Btx and α-Cbtx complexes, a Asn141-linked carbohydrate chain was modeled, its coordinates taken from the crystal structure of the mouse α1-ECD. To gain further insight into the structural role of glycosylation molecular dynamics (MD) simulations were carried out in explicit solvent so as to compare the conformational dynamics of the binding interface between nAChR α1 and the two toxins. The use of computational methods allowed the monitoring of the interactions that govern toxin binding. The MD simulations revealed the strengthening of the receptor-toxin interaction in the presence of the carbohydrate chain. A shift in the position of the sugars towards the bound toxin was observed. Residues Ser187 and Trp184 of nAChR act as critical anchor points for the stabilization of the sugar chain in a close position to the toxin. Toxin Finger I shifts closer to the mannoses, forming important toxin-sugar interactions that implicate residues Thr6, Ser9, and Thr15 of α-Btx, as well as Thr6 and Pro7 of α-Cbtx. Additionally the MD simulations of the human α1 ECD–toxin complexes confirmed the possible accommodation of two water molecules into a hydration cavity inside the hydrophobic core of the subunit, which may contribute to the gating mechanism of the receptor. These findings provide additional structural data that are intended to inspire biophysical studies on the functional role of glycosylation in the gating mechanism of nAChR and also guide the development of novel therapeutic agents for the treatment of nAChR-associated diseases.

No description available.