L’intestin est un organe majeur de l’organisme de par ses fonctions et sa localisation, établissant une barrière active avec un environnement complexe composé du microbiote intestinal, des aliments digérés et d’éléments sécrétés par l’hôte. Outre ses fonctions digestives, absorptives et immuno-modulatrices, l’intestin est également un important organe endocrinien, sécrétant une vingtaine d’hormones régulant des fonctions physiologiques telles que la prise alimentaire, le métabolisme énergétique ou la digestion et le transit intestinal. Ces hormones sont produites par une famille de cellules épithéliales, les cellules entéroendocrines, et sécrétées en réponse à l’activation de récepteurs reconnaissant des éléments du contenu intestinal. En particulier, les cellules entéroendocrines de type L sécrètent GLP-1 et Peptide YY (PYY), impliqués respectivement dans le contrôle de la sécrétion d’insuline et dans la régulation de la prise alimentaire ainsi que le contôle du transit intestinal. Elles sont majoritairement localisées dans l’iléon et le côlon, là où le microbiote intestinal est le plus dense. Le microbiote intestinal permet notamment la fermentation des fibres en acides gras à chaîne courte (AGCC), la production de vitamines, la maturation du système immunitaire de l’hôte et joue lui-même un rôle de barrière contre les pathogènes. Un dialogue entre le microbiote intestinal et l’hôte est nécessaire dans le maintien de l’homéostasie intestinale, nécessitant la reconnaissance par l’hôte de produits bactériens. En particulier, les récepteurs Toll-Like (TLR) permettent la reconnaissance de motifs moléculaires microbiens conservés et sont impliqués dans l’immunité innée de l’hôte. Certains produits bactériens ont également un rôle physiologique tels que les AGCC qui sont une source d’énergie importante pour les colonocytes, en plus d’activer des voies de signalisation. Il a été montré que des régimes riches en fibres, et donc permettant une production accrue d’AGCC, ou plus directement l’administration d’AGCC dans le colon, induit chez l’Homme ou la souris une augmentation des concentrations plasmatiques de PYY, par des mécanismes encore peu compris. En utilisant des lignées cellulaires humaines modèles de cellules entéroendocrines, nous avons caractérisé les effets des AGCC et des motifs bactériens reconnus par les TLR sur l’expression et la sécrétion de PYY et les réponses calciques dans ces cellules. Nous avons pu démontrer que les TLR sont exprimés de manière fonctionnelle, à l’exception de TLR4 et TLR8 dans ces cellules, et que le butyrate augmente leur expression et leur activité. De plus, la stimulation des TLR augmente l’expression de Pyy d’un rapport de 2, mais a peu d’effet sur la sécrétion dans ces cellules. Les AGCC ont des effets divers sur l’expression et la sécrétion de PYY. Alors que le butyrate et le propionate augmentent très fortement l’expression de Pyy, par des rapports respectivement de 120 et 40, par un mécanisme d’inhibition des déacétylases d’histone et de lysine, l’acétate augmente l’expression de Pyy plus modestement par l’activation des récepteurs aux AGCC FFAR2 et FFAR3. L’activation de FFAR2 par les AGCC induit une forte réponse calcique oscillatoire induisant la sécrétion de PYY alors que l’activation de FFAR3 et de GPR109a par le butyrate diminue la concentration calcique cellulaire et réduit les réponses sécrétoires. Ainsi, les AGCC augmentent la production de PYY et régulent sa sécrétion, mais avec et par des effets différents. Ces travaux ont permis de montrer le rôle des cellules entéroendocrines humaines de type L dans la reconnaissance de produits bactériens par l’expression de TLR et par leurs réponses aux AGCCs modulant l’expression et de la sécrétion de PYY. De plus, ces résultats ont déterminés en partie les mécanismes impliqués dans la réponse bénéfique de l’hôte à la consommation de fibres et l’augmentation de la production d’AGCC. / The human gut exerts major functions, mainly due to its localization and by forming an active barrier between a complex environment made of the gut microbiota, digested food products and secreted elements by the host. The main functions of the gut are digestion and absorption of nutrients and it is the first pool of immune cells and a barrier against pathogens, but the gut is also a main endocrine organ secreting more than twenty different hormones. These hormones regulate a wide range physiological functions including food intake, energy metabolism or digestion. Enteroendocrine cells, a sparse family of intestinal epithelial cells, produce and secrete these hormones in response to the activation of a variety of receptors that sense luminal content. Among them, L-cells secrete GLP-1 and Peptide YY (PYY) that are implicated in the regulation of insulin secretion, food intake and intestinal motility. They are mainly found in the distal ileum and in the colon where the microbiota is the densest. Gut microbiota ferments fibers into short chain fatty acids (SCFAs), produces vitamins, participates in regulation of host immune system and is a barrier against pathogens. The cross talk between microbiota and intestinal epithelium is important to maintain the local homeostasis, and is mediated by host receptors recognizing microbial products. Among them, Toll-like receptors (TLRs) recognize conserved microbial associate molecular patterns (MAMPs) and participate to the host innate immunity. Some microbial products also have important functions for the host such has SCFAs that are an important energy substrate for colonocytes and can also activate different signaling pathways. It was shown that fiber-rich diets, increasing production of SCFAs, as well as direct administration of SCFAs in the colon in humans or mice increased PYY plasma levels through mechanisms still undeciphered. Taking advantage of human cell lines as L-cell models, we assessed the different effects of SCFAs and TLR stimulation on PYY expression and secretion and calcium signaling in these cells. We showed that TLRs are functionally expressed in these cells at the exception of TLR4 and TLR8, and that butyrate, one of the three main SCFAs produced by the microbiota increases cell sensitivity to TLR stimulation by increasing their expression. Moreover, TLR stimulation increases Pyy expression by a fold of two but has little effect on secretion. SCFAs differently regulate Pyy expression. Propionate and butyrate highly increase Pyy expression by a fold of 40 and 120 respectively, and their effects are mainly mediated by inhibition of lysine/histone deacetylases whereas acetate increases expression of Pyy by a fold of 1.8 through stimulation of FFAR2 and FFAR3. SCFAs also induce a strong FFAR2-dependent oscillatory response monitoring PYY secretion whereas butyrate via FFAR3 and GPR109a decreases cytosolic calcium concentration and consequently reduces secretory responses. Thus, SCFAs differently increase PYY production and secretion depending of their chain length. Altogether, these results highlight the role human L-cells in microbiota-host crosstalk by sensing microbial products through expression of TLRs and their responses to SCFAs modulating PYY production and secretion. Furthermore, we deciphered some of the mechanisms implicated in beneficial host response to enriched fiber diets and increased production of SCFAs.

Dans l'alimentation des pays industrialisés, l'apport en protéines est bien supérieur à l'apport nutritionnel conseillé (ANC). De plus, cet apport peut être encore supérieur lors de la consommation de régimes riches en protéines utilisés à des fins de perte de poids par des personnes obèses ou en surpoids. Cependant, les conséquences des régimes riches en protéines au niveau de l'écosystème du gros intestin sont encore très mal connues. Dans la première partie de cette thèse, nous avons étudié l'impact d'un régime hyperprotéique sur le microbiote, le contenu endoluminal du gros intestin et le métabolisme des colonocytes. Les rats ont consommé pendant 15 jours soit un régime hyperprotéique (53% de protéines) soit un régime normoprotéique (14% de protéines). Nous avons observé que le régime hyperprotéique réduit la quantité des groupes bactériens majeurs comme Clostridium coccoides et Clostridium leptum, ainsi que Faecalibacterium prausnitzii dans le microbiote du gros intestin avec conjointement des modifications sur sa biodiversité. En même temps, les quantités des produits finaux de la fermentation des acides aminés par le microbiote, les acides gras à chaîne courte (AGCC) et les acides gras à chaîne branchée sont fortement augmentées. Cependant, l'expression des transporteurs des acides monocarboxyliques et l'oxydation du butyrate par les colonocytes ne sont pas modifiés en lien avec des modifications mineures des concentrations en AGCC dues à une augmentation des contenus du gros intestin après l'ingestion du régime hyperprotéique. Il en résulte une augmentation de l'excrétion des AGCC dans les fèces. Ces phénomènes permettraient une homéostasie du métabolisme du butyrate dans les colonocytes, en lien avec le rôle crucial de cet AGCC sur l'épithélium du côlon. Dans la deuxième partie de cette thèse, nous avons testé l'effet d'un mélange d'acides aminés (Thr, Met et Glu) sur la cicatrisation de la muqueuse colique après une colite induite par le DSS (dextran sodium sulfate) ; un modèle d'étude des maladies inflammatoires intestinales souvent utilisé. Une optimisation de la cicatrisation de la muqueuse intestinale émerge comme une cible thérapeutique, dans la prise en charge de ces maladies. La colite a été induite chez le rat avec 5% (w/v) de DSS pendant 6 jours, puis, à l'arrêt du traitement DSS, les animaux ont soit reçu le mélange d'acides aminé soit l'Ala comme témoin iso-azoté, pendant 3, 7 et 10 jours. Nous avons observé que 10 jours de complément en mélange d'acides aminés améliorent la cicatrisation post-colite, avec des modifications sur le taux de synthèse protéique dans la muqueuse colique, sans toutefois modifier la résolution de l'inflammation. Nos résultats suggèrent que l'utilisation des mélanges d'acides aminés améliore la cicatrisation de la muqueuse colique après colite chimio-induite. / In industrialized countries, protein intake is largely higher than the recommended dietary allowance (RDA). Furthermore, high protein diets are used for their slimming effect by obese or overweight people. However, little is known regarding to the consequences of a high protein diet on the large intestinal ecosystem. We thus study the influence of a high protein diet on the microbiota, on the endoluminal composition of the large intestine and on the butyrate metabolism by isolated colonocytes. Rats received during 15 days either a high protein diet (53% of proteins) or a normo protein diet (14% of proteins). We observed that the quantity of major bacterial groups Clostridium coccoides and Clostridium leptum, but also Faecalibacterium prausnitzii was reduced in the microbiota of the large intestine together with modifications of its biodiversity. In the same time, the quantities of short-chain fatty acids (SCFA) and branched-chain fatty acids, final products of bacterial fermentation of amino acids, were increased. However, the expression of monocarboxylic acid transporters and butyrate oxidation in colonocytes remained unchanged, in association with minor changes of the SCFA concentrations due to marked increase of the weight of the large intestine content. We then observed an increase in the amount of SCFA in the feces. These phenomena would allow homeostatic metabolism of butyrate in colonocytes, in relationship with its crucial role on the colonic epitheliumIn. In the second part of this thesis, we have tested the effects of a mixture of amino acids (Thr, Met and Glu) on the colonic mucosa healing after colitis induced by DSS (dextran sodium sulphate); a model to study intestinal inflammatory bowel diseases largely used. Optimization of intestinal mucosa healing is more and more considered as a therapeutic goal. Colitis was induced in rats by 5% (w/v) DSS during 6 days, then at the end of the treatment with DSS, animals received either the amino acid mixture or Ala as iso-nitrogenous control, during 3, 7 or 10 days. We observed that 10 days amino acid mixture supplementation was able to improve the colonic mucosal healing, with modification of the protein synthesis rate, without however changes in the resolution of inflammation. Our results suggest that the supplementation with the amino acid mixture improve the mucosal healing after experimental colitis.

Les maladies métaboliques, comme le diabète, la dyslipidémie ou l'obésité, constituent un problème majeur de santé publique dans les pays développés. Ces maladies très répandues restent encore difficiles à traiter malgré une recherche active. Les stratégies thérapeutiques contre ces maladies incluent le développement de nouvelles molécules ciblant les récepteurs aux acides gras, étant donné leur rôle essentiel dans l'homéostasie du métabolisme. C'est dans ce contexte que s'inscrit ce travail portant sur deux récepteurs couplés aux protéines G, les récepteurs aux acides gras à courte chaîne 2 et 3 ou free fatty acid receptors 2 (FFA2) et 3 (FFA3). Nous avons tout d'abord cherché à déterminer le profil d'expression des deux récepteurs. Ensuite, nous avons établi des lignées cellulaires stable exprimant FFA2 ou FFA3 afin d'étudier la pharmacologie d'agonistes synthétiques et endogènes de ces récepteurs. Après avoir identifié les voies de signalisation engendrées par l'activation des récepteurs, nous avons démontré que les agonistes synthétiques étaient des activateurs allostériques, c'est-à-dire qu'ils se liaient aux récepteurs sur un site distinct de celui des ligands endogènes. Pour identifier les résidus d'acides aminés nécessaires à la reconnaissance des ligands, nous avons généré une gamme de mutants ponctuels de ces récepteurs par mutagénèse dirigée. En analysant l'effet des mutations dans des tests fonctionnels, nous avons pu déterminer avec précision où se liaient les ligands et ainsi pu dessiner par informatique des modèles structuraux des récepteurs qui pourront être utilisés pour le drug design de futures molécules agonistes de ces récepteurs.

Les maladies métaboliques, comme le diabète, la dyslipidémie ou l’obésité, constituent un problème majeur de santé publique dans les pays développés. Ces maladies très répandues restent encore difficiles à traiter malgré une recherche active. Les stratégies thérapeutiques contre ces maladies incluent le développement de nouvelles molécules ciblant les récepteurs aux acides gras, étant donné leur rôle essentiel dans l’homéostasie du métabolisme. C’est dans ce contexte que s’inscrit ce travail portant sur deux récepteurs couplés aux protéines G, les récepteurs aux acides gras à courte chaîne 2 et 3 ou free fatty acid receptors 2 (FFA2) et 3 (FFA3). Nous avons tout d'abord cherché à déterminer le profil d'expression des deux récepteurs. Ensuite, nous avons établi des lignées cellulaires stable exprimant FFA2 ou FFA3 afin d’étudier la pharmacologie d’agonistes synthétiques et endogènes de ces récepteurs. Après avoir identifié les voies de signalisation engendrées par l’activation des récepteurs, nous avons démontré que les agonistes synthétiques étaient des activateurs allostériques, c’est-à-dire qu’ils se liaient aux récepteurs sur un site distinct de celui des ligands endogènes. Pour identifier les résidus d’acides aminés nécessaires à la reconnaissance des ligands, nous avons généré une gamme de mutants ponctuels de ces récepteurs par mutagénèse dirigée. En analysant l’effet des mutations dans des tests fonctionnels, nous avons pu déterminer avec précision où se liaient les ligands et ainsi pu dessiner par informatique des modèles structuraux des récepteurs qui pourront être utilisés pour le drug design de futures molécules agonistes de ces récepteurs. / Metabolic diseases, such as diabetes, dyslipidemia or obesity, are more and more weighing on public health expenses in developed countries. Despite active research, these widespread diseases remain difficult to handle. Promising new therapeutic strategies against metabolic diseases include the development of drugs targeting the free fatty acid receptors, as key players in metabolism homeostasis. In this context, the current PhD thesis focuses on the study of two G protein-coupled receptors, namely the short-chain free fatty acid receptors 2 (FFA2) and 3 (FFA3). First, we investigated the expression of the two receptors of interest in a variety of cell types. Then, in order to study the pharmacology and the binding mode of endogenous and synthetic agonists on FFA2 and FFA3, we established stable cell lines expressing each receptor. Once we identified the signaling pathways engendered in response to receptor activation, we showed that synthetic agonists were allosteric activators of the receptors, in the sense that they bind to the receptors at a distinct site from short-chain fatty acids, i.e. the endogenous agonists. To identify the aminoacid residues that were involved in ligand binding, we generated a variety of point mutated receptors by site-directed mutagenesis. By analyzing the effects of the mutations in functional tests, we determined precisely the aminoacid residues that were essential for ligand binding. From these results, we designed in silico structural models which may aid future drug design efforts for the discovery of new FFA2 and FFA3 agonists.