The Smad proteins transduce the signal of transforming growth factor-β (TGF-β) and related factors from the cell surface to the nucleus. Following C-terminal phosphorylation by a corresponding receptor kinase, the R-Smad proteins form heteromeric complexes with Smad4. These complexes translocate into the nucleus, bind specific transcriptional activators and DNA, ultimately modulating gene expression. Though studied through a variety of means, the stoichiometry of the R-Smad/Smad4 complex is unclear. We investigated the stoichiometry of the phosphorylation-induced R-Smad/Smad4 complex by using acidic amino acid substitutions to simulate phosphorylation. Size exclusion chromatography, analytical ultracentrifugation, and isothermal titration calorimetry analysis revealed that the R-Smad/Smad4 complex is a heterotrimer consisting of two R-Smad subunits and one Smad4 subunit. In addition, a specific mechanism for phosphorylation-induced R-Smad/Smad4 complex formation was studied. Although it had been previously established that part of the mechanism through which phosphorylation induces Smad oligomerization is through relieving MH1-domain mediated autoinhibition of the MH2 (oligomerization) domain, it is also evident that phosphorylation serves to energetically drive Smad complex formation. Through mutational and size exclusion chromatography analysis, we established that phosphorylation induces oligomerization of the Smads by creating an electrostatic interaction between the phosphorylated C-terminal tail of one R-Smad subunit in a Smad trimer with a basic surface on an adjacent R-Smad or Smad4 subunit. The basic surface is defined largely by the L3 loop, a region that had previously been implicated in R-Smad interaction with the receptor kinase. Furthermore, the Smad MH2 domain shares a similar protein fold with the phosphoserine and phosphothreonine-binding FHA domains from proteins like Rad53 and Chk2. Taken together, these results suggest that the Smad MH2 domain may be a distinct phospho serine-binding domain, which utilizes a common basic surface to bind the receptor kinase and other Smads, and takes advantage of phosphorylation-induced allosteric changes dissociate from the receptor kinase and oligomerize with other Smads. Finally, the structural basis for the preferential formation of the R-Smad/Smad4 heterotrimeric complex over the R-Smad homotrimeric complex was explored through X-ray crystallography and isothermal titration calorimetry. Crystal structures of the Smad2/Smad4 and Smad3/Smad4 complexes revealed that specific residue differences in Smad4 compared to R-Smads resulted in highly favorable electrostatic interactions that explain the preference for the interaction with Smad4.

Eukaryotic DNA is packaged in chromatin, whose repeating subunit, the nucleosome, consists of an octamer of histone proteins wrapped by about 147bp of DNA. This packaging affects the accessibility of DNA and hence any process that occurs on DNA, such as replication, repair, and transcription. An early observation from genome-wide nucleosome mapping in yeast was that genes had a surprisingly characteristic structure, which has motivated studies to understand what determines this architecture. Both sequence and trans acting factors are known to influence chromatin packaging, but the relative contributions of cis and trans determinants of nucleosome positioning is debated. Here we present data using genetic approaches to examine the contributions of cis and trans acting factors on nucleosome positioning in budding yeast. We developed the use of yeast artificial chromosomes to exploit quantitative differences in the chromatin structures of different yeast species. This allows us to place approximately 150kb of sequence from any species into the S.cerevisiae cellular environment and compare the nucleosome positions on this same sequence in different environments to discover what features are variant and hence regulated by trans acting factors. This method allowed us to conclusively show that the great preponderance of nucleosomes are positioned by trans acting factors. We observe the maintenance of nucleosome depletion over some promoter sequences, but partial fill-in of NDRs in some of the YAC v promoters indicates that even this feature is regulated to varying extents by trans acting factors. We are able to extend our use of evolutionary divergence in order to search for specific trans regulators whose effects vary between the species. We find that a subset of transcription factors can compete with histones to help generate some NDRs, with clear effects documented in a cbf1 deletion mutant. In addition, we find that Chd1p acts as a potential “molecular ruler” involved in defining the nucleosome repeat length differences between S.cerevisiae and K.lactis. The mechanism of this measurement is unclear as the alteration in activity is partially attributable to the N-terminal portion of the protein, for which there is no structural data. Our observations of a specialized chromatin structure at de novo transcriptional units along with results from nucleosome mapping in the absence of active transcription indicate that transcription plays a role in engineering genic nucleosome architecture. This work strongly supports the role of trans acting factors in setting up a dynamic, regulated chromatin structure that allows for robustness and fine-tuning of gene expression.

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / Protein-protein interactions play a crucial role in a wide range of biological processes. Research on the design and synthesis of small molecules to modulate these proteinprotein interactions can lead to new targets and drugs to modulate their function. In Chapter one, we discuss the design and synthesis of small molecules to probe a proteinprotein interaction in a voltage-gated Ca2+ channel. Virtual screening identified a compound (BTT-3) that contained a 3,4-dihydro-3,4’-pyrazole core. This compound had modest biological activity when tested in a fluorescence polarization (FP) assay. The synthetic route to BTT-3 consisted of six steps. In addition, analogs of BTT-3 were made for a structure-activity study to establish the importance of a carboxylate moiety. We also synthesized a biotinylated benzophenone photo-affinity probe and linked it to BTT-3 to identify additional protein targets of the compound. In Chapter two, small-molecule antagonists targeting uPA-uPAR protein-protein interaction are presented. A total of 500 commercially-available compounds were previously identified by virtual screening and tested by a FP assay. Three classes of compounds were found with biological activity. The first class of compounds contains pyrrolidone core structures represented by IPR- 1110, the second class has a novel pyrrolo[3,4-c]pyrazole ring system, represented by xv IPR-1283 and the last series had compounds with a 1,2-disubstituted 1,2- dihydropyrrolo[3,4-b]indol-3(4H)-one core structure, represented by IPR-540. Each of these three compounds were synthesized and assessed by FP and ELISA assays. A binding mode of IPR-1110 with uPA was subsequently proposed. Based on this binding mode, another 61 IPR-1110 derivatives were synthesized by us to illustrate the SAR activity. Analogs of the other two series were also synthesized.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

A luminescência persistente é um fenômeno em que o material emite radiação de segundos a várias horas após cessada a irradiação (luz, radiação UV, feixe de elétrons, etc.). No entanto, os mecanismos que geram o fenômeno da luminescência persistente ainda não são totalmente estabelecidos. Neste trabalho os materiais Lu2O3:TR3+,M (TR,M: Pr,HfIV; Eu, Ca2+ ou Tb,Ca2+) foram preparados pelo método de estado-sólido assistido por micro-ondas (MASS) e comparados com aqueles sintetizados pelo método cerâmico. As vantagens do método MASS incluem curto tempo de processamento, aquecimento dielétrico seletivo, baixo consumo de energia e uso de equipamentos de baixo custo (forno micro-ondas doméstico), muitas vezes produzindo produtos de alta pureza e alto rendimento. Os materiais foram caracterizados pelas técnicas de espectroscopia de absorção na região do infravermelho (IR), espectroscopia Raman, difração de raios X método do pó (DRX), microscopia eletrônica de varredura (MEV), X-ray absorption near edge structure (XANES), Extended X-ray absorption fine structure (EXAFS), X-ray Excited Optical Luminescence (XEOL), espectroscopia de fotoluminescência na região do UV-Visível, espectroscopia de fotoluminescência na região do UV-UV vácuo e termoluminescência (TL). Os fósforos Lu2O3:TR3+,M (TR,M: Pr,HfIV; Eu, Ca2+ ou Tb,Ca2+) foram preparados em um curto período de tempo (22-26 min) pelo método MASS utilizando forno micro-ondas doméstico, carvão ativado como susceptor, fluxos (H3BO3 ou Na2CO3) e sem a aplicação de gases. Todos materiais preparados com fluxo de H3BO3 exibem impurezas de LuBO3 que foram quantificadas por refinamento Rietveld. Os fluxos e os dopantes não alteraram consideravelmente a estrutura cristalina da matriz C-Lu2O3. As micrografias MEV sugerem que o fluxo de Na2CO3 e os precursores nitratos geram partículas de Lu2O3 com tamanho menor devido a evolução de gases provenientes da decomposição destes compostos. Por outro lado, quando é usado óxidos como precursores os materiais apresentam maiores tamanhos de partícula e na presença de H3BO3 leva a maior agregação. Os dados de XANES indicam que houve completa redução do íon TbIV &#8594 Tb3+ e parcial do PrIV &#8594 Pr3+, devido ao uso de carvão ativado que gera CO(g) durante o tratamento térmico. Os espectros da luminescência persistente indicam emissões nas regiões do vermelho/NIR, vermelho alaranjado e verde atribuídas as transições 4fN &#8594 4fN características dos íons Pr3+, Eu3+ e Tb3+, respectivamente. As diferenças entre os espectros registrados sob excitação UV e após cessada a irradiação podem ser explicadas pela emissão da luminescência persistente predominante dos íons TR3+ no sítio S6 do que no C2. Além disso, a co-dopagem aliovalente com os íons HfIV e Ca2+ aumentam a intensidade e duração da luminescência persistente. Isto ocorre através da geração de armadilhas provenientes dos dois co-dopantes nos sítios de Lu3+ e por defeitos produzidos na compensação de carga. Os materiais fotônicos preparados pelo método MASS com fluxo de H3BO3 apresentam maior intensidade e duração da luminescência persistente comparados aos preparados pelo método cerâmico ou sem a presença de H3BO3. Os mecanismos da luminescência persistente foram desenvolvidos através de princípios similares baseados nos dados experimentais da energia do band gap, posição dos níveis de energia dos íons TR3+/2+ na matriz e energia das armadilhas. Isto confirma a solidez da interpretação dos dados experimentais dos materiais Lu2O3:TR3+,M exibindo luminescência persistentes e encoraja a expansão de modelos similares para outros materiais apresentando esse fenômeno. Os fósforos Lu2O3:Pr3+,HfIV,Lu2O3:Eu3+(,Ca2+) e Lu2O3:Tb3+,Ca2+) apresentaram sintonização de cores de emissão tanto para o fenômeno da fotoluminescência como da luminescência persistente, podendo atuar como bons candidatos nas aplicações de bioimageamento ou sensibilizadores de células solares. / Persistent luminescence is a phenomenon where the material emits radiation from seconds to several hours after cessation of irradiation (light, UV radiation, electron beam, etc.). The persistent luminescence mechanisms are not entirely established, however. In this work, the materials Lu2O3:TR3+,M (TR,M: PrHfIV; Eu, Ca2+ or Tb,Ca2+) were prepared by MASS method as well as compared to these materials synthetized by ceramic method. The advantages of MASS method include short processing time, selective dielectric heating, low energy consumption and use of inexpensive equipment (domestic microwave oven), often affording high-purity and high-yield products. The materials were characterized by Infrared absorption spectroscopy (IR), Raman spectroscopy, X-ray powder diffraction (XPD), Scanning electron microscopy (SEM), X-ray absorption near edge structure (XANES), Extended X-ray absorption fine structure (EXAFS), X-ray excited optical luminescence (XEOL), photoluminescence spectroscopy in the UV-Visible range, photoluminescence spectroscopy in the UV-UV vacuum region and thermoluminescence (TL). The phosphorsLu2O3:TR3+,M (TR,M: Pr,HfIV; Eu, Ca2+ or Tb,Ca2+) were rapidly (22-26 min) and successfully prepared by MASS method using a domestic microwave oven, carbon as susceptor, fluxes (H3BO3 or Na2CO3) and without special gases application. All materials prepared with H3BO3 flux exhibit LuBO3 impurities that were quantified by Rietveld refinement. The flux and dopants does not considerably affect the crystalline structure of the C-Lu2O3 host matrix. Scanning electron micrographs suggest that Na2CO3 flux and nitrates precursors produce Lu2O3 particles of small size due to the gases evolution from the decomposition of these compounds. On the other hand, the materials prepared from oxides precursors have particles of large size and H3BO3 flux induces particle xi aggregation. The carbon used as the susceptor generates CO gas, leading to complete reduction of TbIV to Tb3+ and partial conversion of PrIV to Pr3+ present in the Tb4O7 and Pr6O11 precursors, as indicated by XANES. Persistent luminescence spectra of the materials show emission in the red/NIR, reddish orange and green ranges assigned to the 4fN &#8594 4fN transitions characteristics of Pr3+, Eu3+ and Tb3+ ions, respectively. Differences between the spectra recorded under UV excitation and after ceased the irradiation can be explained by the predominant persistent luminescence emission of TR3+ ion in the S6 site rather than TR3+ in the C2 site. In addition, inclusion of HfIV and Ca2+ codopants in the Lu2O3 host increases the emission intensity and duration of persistent luminescence due to generation of traps caused by charge compensation in the lattice as well as these metal ions in the Lu3+ sites. The photonic materials prepared by MASS method with H3BO3 flux show higher persistent luminescence performance than those prepared by the ceramic method or MASS without flux. The persistent luminescence mechanisms were developed through similar principles based on experimental data of band gap energy, energy level positions of TR3+/2+ ions in the host and traps energy. This similarity confirms the consistency of the interpretation of experimental data for the Lu2O3:TR3+,M materials and encourages the expansion of similar models for other persistent luminescence materials. Color tuning of persistent luminescence in Lu2O3:TR3+,M (TR,M: Pr,HfIV; Eu,Ca2+ or Tb,Ca2+) provides potential applications in bioimaging as well as in solar cell sensitizers.

Distúrbios de hemostasia são uma das principais manifestações clínicas observadas nos acidentes por serpentes do gênero Bothrops. Tendo em vista a importância da ativação de fatores da cascata de coagulação no desenvolvimento da patologia no envenenamento, o presente trabalho descreve o isolamento e a caracterização bioquímica e funcional de uma metaloprotease capaz de induzir a ativação de fatores de coagulação, a partir da peçonha de Bothrops moojeni. A metaloprotease foi isolada por três etapas cromatográficas utilizando colunas de exclusão molecular (Sephacryl S-200), interação hidrofóbica (Phenyl Sepharose) e troca aniônica (ES 502N). A protease isolada, denominada moojenactivase, é uma glicoproteína com massa molecular de aproximadamente 89 kDa e ponto isoelétrico de 4,92, sendo composta por três cadeias com massas de 66; 17 e 14 kDa, ligadas por pontes dissulfeto. A determinação da sequência de aminoácidos por espectrometria de massas evidenciou grande identidade sequencial com outras metaloproteases, indicando a presença dos domínios metaloprotease, desintegrina-like e lectinas-like e classificando-a como uma protease da classe PIIId. Funcionalmente, a moojenactivase foi capaz de induzir a cogulação de plasma humano pela ativação dos fatores II (protrombina) e X da cascata de coagulação, gerando -trombina e fator X ativado, respectivamente. A protease apresentou atividade fibrinogenolítica, especialmente sobre a cadeia da molécula de fibrinogênio, porém não foi capaz de induzir a formação do coágulo de fibrina pela ativação deste. A moojenactivase foi parcialmente inibida quando incubada em condições de pH entre 3,5 e 5,0 e em pH 9,0, além de temperaturas acima de 60ºC, bem como na presença de ions Cu2+, além dos inibidores EDTA, SDS, DTT e soro anti-ofídico crotalico/botrópico. A protease induziu agregação plaquetária e não apresentou atividades fibrinolítica e hemorrágica. Células mononucleares de sangue periférico (PBMC) tratadas com a protease foram capazes de produzir TNF- assim como expressar fator tecidual (Fator III da coagulação) na forma ativa, fazendo com que essas células apresentassem caráter procoagulante. Com o objetivo avaliar os efeitos nos parâmetros hematológicos in vivo, a moojenactivase foi administrada em ratos (3g/Kg) onde foi observado que a protease foi capaz de prolongar o tempo de sangramento dos animais e induzir a diminuição do número de plaquetas sanguíneas, caracterizando um quadro de trombocitopenia. Ainda, o plasma dos animais administrados com a moojenactivase apresentaram valores elevados do tempo de protrombina e tempo de tromboplastina parcialmente ativada, assim como redução na concentração de fibrinogênio. Na análise dos parâmetros da série branca, foi observado aumento leucocitário na circulação, com predominância de neutrófilos até 3h após a administração, indicando a instalação de um quadro inflamatório. Com relação à análise da série vermelha, a moojenactivase não foi capaz de alterar nenhum dos parâmetros estudados. Os resultados obtidos no presente trabalho mostram, pela primeira vez, o isolamento de uma metaloprotease da classe P-IIId da peçonha de Bothrops moojeni capaz de atuar sobre diferentes ii eventos do processo hemostático, sendo essa ação prócoagulante responsável pelo quadro de incoagulabilidade sanguínea em animais. Os dados gerados podem auxiliar no entendimento dos distúrbios de coagulação em pacientes envolvidos em acidentes por serpentes da espécie Bothrops moojeni, levando ao melhor direcionamento na terapia anti-ofídica. Ainda, a função da moojenactivase sobre componentes biológicos credencia a molécula para uma possível aplicação biotecnológica em processos que envolvem o sistema hemostático. / Haemostasis disorders are a major clinical manifestation induced by Bothrops snake envenomations. Considering the relevance of the activation of coagulation factors during the envenomation pathophysiology, the present work describes, for the first time, the isolation and functional and biochemical characterization of a coagulation factor activator metalloprotease from Bothrops moojeni snake venom. The protease was purified by three chromatographic procedures using size exclusion (Sephacryl S-200), hydrophobic interaction (Phenyl Sepharose) and anion exchange (ES 502N) chromatographies. The isolated protease, named moojenactivase, is a glycoprotein with molecular mass of approximately 89 kDa by SDS-PAGE, and composed of 66 kDa, 17 kDa and 14 kDa disulfide linked chains, with pI of 4,92. The amino acid sequence determination of tryptic peptides from moojenactivase by mass spectrometry presented fragments with high identity to snake venom metalloproteases, confirming the presence of the metalloprotease, disintegrin-like and lectin-like domains, which allowed its classification as a PIIId class snake venom metalloprotease. Regarding its functional properties, the protease was capable to induce human plasma coagulation by inducing activation of coagulation factors II and X, forming-thrombin and factor X activated, respectively. Also, moojenactivase presented fibrinogenolitic activity, by cleaving preferentially -chain of fibrinogen, however was not capable to induce the formation of fibrin clot from fibrinogen. The enzyme stability was assessed and showed that moojenactivase presented a reduced functional activity when preincubated in pH values ranging from 3,5 to 5,0 and at pH 9,0, and in temperature conditions over 60ºC. Cu2+ ions and inhibitors such as EDTA, SDS, DTT and crotalic/bothropic antiophidian serum reduced the protease activity. Moojenactivase induced platelet aggregation, but no fibrinolytic and haemorrhage activities. In order to evaluate the stimulation of peripheral blood mononuclear cells (PBMC), cells were treated with the protease and we observed the release of proinflammatory cytokine TNF- and expression of active Tissue Factor (coagulant factor III), inducing a procoagulant state on PBMC. In order to evaluate in vivo haematological effects, the protease (3 g/Kg) was administered in rat (i.v.) and was observed that moojenactivase induced a prolonged bleeding time and reduced platelet counting (indicating a thrombocytopenia state). Moreover, the evaluation of the hemostasis parameters was assessed by the the prothrombin time and activated partial thromboplastin time assays and showed a prolonged clot time on both tests, and also a decrease in fibrinogen plasma levels. The leukogram analysis showed an increase in the circulating leukocyte number up to 3 hours after moojenactivase administration, composed predominantly of neutrophils. However, parameters envolving red cells shows that the protease do not affect. The results obtained in the present work show, for the first time, the isolation of a PIIId class metalloprotease from Bothrops moojeni snake venom involved on the activation of several hemostatic events, inducing a pro coagulant activity and leading to blood unclottable state in experimental animals. These data can assit in understanding coagulation disturbs in iv patients involved in Bothrops moojeni envenomation and leading to a better anti ophidic therapy guidance. Moreover, moojenactivase functional activities accredits this protease as a possible molecular instrument applied on biotechnological prospect related to the hemostasis.

L'òxid de zinc és un compost àmpliament utilitzat en la indústria del cautxú a causa de les excel•lents propietats que mostra com activador per a la vulcanització amb sofre. Malgrat les seves característiques superiors, hi ha una creixent preocupació sobre els seus efectes mediambientals i nombrosos estudis s’han portat a terme per tal de reduir els nivells de ZnO als compostos de cautxú o per a substituir-lo. Entre totes les alternatives propostes per reduir la quantitat d'òxid de zinc, l'ús de nanopartícules de ZnO amb una alta superfície específica sembla prometedor. Una altra proposta per reduir els nivells de ZnO que ha estat estudiada per nombrosos autors és l'ús d'altres òxids metàl•lics, com el CaO, MgO, CdO, CuO, PbO i NiO. En aquest treball, nous activadors amb un reduït contingut de zinc han estat desenvolupats per tal de reduir l'impacte ambiental de la indústria del cautxú. Nanopartícules d'òxids metàl•lics mixtes de zinc i altres metalls s’han sintetitzat per tal de beneficiar-se de la seva grandària i aprofitar-se del comportament tant del ZnO com del MgO a la vulcanització amb sofre. Un altre gran problema mediambiental relacionat amb la indústria del cautxú és la gestió dels compostos de cautxú que han arribat al final de la seva vida útil, especialment de pneumàtics. L'impacte mediambiental dels pneumàtics, juntament amb els problemes econòmics relacionats amb la seva gestió i eliminació, ha donat lloc a una gran varietat d'estudis per desenvolupar tecnologies per a reutilitzar i reciclar els pneumàtics fora d'ús. L'ús de cautxú recuperat o regenerat en mescles amb cautxú verge s’ha investigat per diferents autors. No obstant això, la migració de les substàncies químiques entre el cautxú triturat i la matriu verge no ha estat considerada com un avantatge per tal d'utilitzar el cautxú de pneumàtics fora d'ús com un activador i, per tant, reduir els nivells de zinc emprats en els compostos de cautxú i introduir noves aplicacions per als pneumàtics fora d'ús. Aquest enfocament ha estat investigat en aquesta tesi. / El óxido de zinc es un compuesto ampliamente utilizado en la industria del caucho debido a las excelentes propiedades que muestra como activador para la vulcanización con azufre. A pesar de sus características superiores, existe una creciente preocupación acerca de sus efectos medioambientales y numerosos estudios han sido realizados con el fin de reducir los niveles de ZnO en los compuestos de caucho o para sustituirlo. Entre todas las alternativas propuestas para reducir la cantidad de óxido de zinc, el empleo de nanopartículas de ZnO con una alta superficie específica parece ser prometedor. Otro propuesta para reducir los niveles de ZnO que ha sido estudiado por numerosos autores es el uso de otros óxidos metálicos, como el CaO, MgO, CdO, CuO, PbO y NiO. En este trabajo, nuevos activadores con un reducido contenido de zinc han sido desarrollados con el fin de reducir el impacto ambiental de la industria del caucho. Nanopartículas de óxidos metálicos mixtos de zinc y otros metales han sido sintetizados con el fin de beneficiarse de su tamaño y aprovecharse del comportamiento tanto del ZnO como del MgO en la vulcanización con azufre. Otro gran problema medioambiental relacionado con la industria del caucho es la gestión de los compuestos de caucho que han alcanzado el final de su vida útil, especialmente de neumáticos. El impacto medioambiental de los neumáticos, junto con los problemas económicos relacionados con su gestión y eliminación, ha dado lugar a una gran variedad de estudios para desarrollar tecnologías para reutilizar y reciclar los neumáticos fuera de uso. El uso de caucho recuperado o regenerado en mezclas con caucho virgen ha sido investigado por diferentes autores. Sin embargo, la migración de las sustancias químicas entre el caucho triturado y la matriz virgen no ha sido considerada como una ventaja con el fin de utilizar el caucho de neumáticos fuera de uso como un activador y, por lo tanto, reducir los niveles de zinc empleadas en los compuestos de caucho e introducir nuevas aplicaciones para los neumáticos fuera de uso. Este enfoque ha sido investigado en esta tesis. / Zinc oxide is a widely used compound in rubber industry due to the excellent properties that shows as activator for sulphur vulcanisation. Despite its superior characteristics, there is an increased concern about its environmental effects and several research studies have been carried out in order to reduce the ZnO levels in rubber compounds or substitute it. Between all the alternatives proposed to reduce the ZnO levels, the use of nano-sized ZnO particles with high surface area seems to be promising. Another approach to reduce the ZnO levels that has been studied by many authors is the use of alternative metal oxides, such us CaO, MgO, CdO, CuO, PbO and NiO. In this work, novel activators with reduced zinc content have been developed in order to reduce the environmental impact of the rubber industry. Mixed metal oxides nanoparticles of zinc and other metal have been synthesised with the aim of profiting from its size and to take advantage of the behaviour of both ZnO and MgO in sulphur vulcanisation. Another environmental problem related to the rubber industry is the management of end of life and waste rubber, especially tyres. The environmental impact of waste tyres, together with the economic problems related with the management and disposal, has led to a great variety of studies to develop technologies to re-use and recycle waste tyres. The use of reclaimed or regenerated rubber in blends with virgin rubber has been investigated by different authors. However, the migration of chemicals between the crumb and the matrix has not been considered as an advantage in order to use tyre crumb as an activator and, therefore, reduce the zinc levels employed in rubber compounds and introducing new applications for the waste rubber from end of life tyres. This approach has been investigated in this thesis.

Distúrbios de hemostasia são uma das principais manifestações clínicas observadas nos acidentes por serpentes do gênero Bothrops. Tendo em vista a importância da ativação de fatores da cascata de coagulação no desenvolvimento da patologia no envenenamento, o presente trabalho descreve o isolamento e a caracterização bioquímica e funcional de uma metaloprotease capaz de induzir a ativação de fatores de coagulação, a partir da peçonha de Bothrops moojeni. A metaloprotease foi isolada por três etapas cromatográficas utilizando colunas de exclusão molecular (Sephacryl S-200), interação hidrofóbica (Phenyl Sepharose) e troca aniônica (ES 502N). A protease isolada, denominada moojenactivase, é uma glicoproteína com massa molecular de aproximadamente 89 kDa e ponto isoelétrico de 4,92, sendo composta por três cadeias com massas de 66; 17 e 14 kDa, ligadas por pontes dissulfeto. A determinação da sequência de aminoácidos por espectrometria de massas evidenciou grande identidade sequencial com outras metaloproteases, indicando a presença dos domínios metaloprotease, desintegrina-like e lectinas-like e classificando-a como uma protease da classe PIIId. Funcionalmente, a moojenactivase foi capaz de induzir a cogulação de plasma humano pela ativação dos fatores II (protrombina) e X da cascata de coagulação, gerando -trombina e fator X ativado, respectivamente. A protease apresentou atividade fibrinogenolítica, especialmente sobre a cadeia da molécula de fibrinogênio, porém não foi capaz de induzir a formação do coágulo de fibrina pela ativação deste. A moojenactivase foi parcialmente inibida quando incubada em condições de pH entre 3,5 e 5,0 e em pH 9,0, além de temperaturas acima de 60ºC, bem como na presença de ions Cu2+, além dos inibidores EDTA, SDS, DTT e soro anti-ofídico crotalico/botrópico. A protease induziu agregação plaquetária e não apresentou atividades fibrinolítica e hemorrágica. Células mononucleares de sangue periférico (PBMC) tratadas com a protease foram capazes de produzir TNF- assim como expressar fator tecidual (Fator III da coagulação) na forma ativa, fazendo com que essas células apresentassem caráter procoagulante. Com o objetivo avaliar os efeitos nos parâmetros hematológicos in vivo, a moojenactivase foi administrada em ratos (3g/Kg) onde foi observado que a protease foi capaz de prolongar o tempo de sangramento dos animais e induzir a diminuição do número de plaquetas sanguíneas, caracterizando um quadro de trombocitopenia. Ainda, o plasma dos animais administrados com a moojenactivase apresentaram valores elevados do tempo de protrombina e tempo de tromboplastina parcialmente ativada, assim como redução na concentração de fibrinogênio. Na análise dos parâmetros da série branca, foi observado aumento leucocitário na circulação, com predominância de neutrófilos até 3h após a administração, indicando a instalação de um quadro inflamatório. Com relação à análise da série vermelha, a moojenactivase não foi capaz de alterar nenhum dos parâmetros estudados. Os resultados obtidos no presente trabalho mostram, pela primeira vez, o isolamento de uma metaloprotease da classe P-IIId da peçonha de Bothrops moojeni capaz de atuar sobre diferentes ii eventos do processo hemostático, sendo essa ação prócoagulante responsável pelo quadro de incoagulabilidade sanguínea em animais. Os dados gerados podem auxiliar no entendimento dos distúrbios de coagulação em pacientes envolvidos em acidentes por serpentes da espécie Bothrops moojeni, levando ao melhor direcionamento na terapia anti-ofídica. Ainda, a função da moojenactivase sobre componentes biológicos credencia a molécula para uma possível aplicação biotecnológica em processos que envolvem o sistema hemostático. / Haemostasis disorders are a major clinical manifestation induced by Bothrops snake envenomations. Considering the relevance of the activation of coagulation factors during the envenomation pathophysiology, the present work describes, for the first time, the isolation and functional and biochemical characterization of a coagulation factor activator metalloprotease from Bothrops moojeni snake venom. The protease was purified by three chromatographic procedures using size exclusion (Sephacryl S-200), hydrophobic interaction (Phenyl Sepharose) and anion exchange (ES 502N) chromatographies. The isolated protease, named moojenactivase, is a glycoprotein with molecular mass of approximately 89 kDa by SDS-PAGE, and composed of 66 kDa, 17 kDa and 14 kDa disulfide linked chains, with pI of 4,92. The amino acid sequence determination of tryptic peptides from moojenactivase by mass spectrometry presented fragments with high identity to snake venom metalloproteases, confirming the presence of the metalloprotease, disintegrin-like and lectin-like domains, which allowed its classification as a PIIId class snake venom metalloprotease. Regarding its functional properties, the protease was capable to induce human plasma coagulation by inducing activation of coagulation factors II and X, forming-thrombin and factor X activated, respectively. Also, moojenactivase presented fibrinogenolitic activity, by cleaving preferentially -chain of fibrinogen, however was not capable to induce the formation of fibrin clot from fibrinogen. The enzyme stability was assessed and showed that moojenactivase presented a reduced functional activity when preincubated in pH values ranging from 3,5 to 5,0 and at pH 9,0, and in temperature conditions over 60ºC. Cu2+ ions and inhibitors such as EDTA, SDS, DTT and crotalic/bothropic antiophidian serum reduced the protease activity. Moojenactivase induced platelet aggregation, but no fibrinolytic and haemorrhage activities. In order to evaluate the stimulation of peripheral blood mononuclear cells (PBMC), cells were treated with the protease and we observed the release of proinflammatory cytokine TNF- and expression of active Tissue Factor (coagulant factor III), inducing a procoagulant state on PBMC. In order to evaluate in vivo haematological effects, the protease (3 g/Kg) was administered in rat (i.v.) and was observed that moojenactivase induced a prolonged bleeding time and reduced platelet counting (indicating a thrombocytopenia state). Moreover, the evaluation of the hemostasis parameters was assessed by the the prothrombin time and activated partial thromboplastin time assays and showed a prolonged clot time on both tests, and also a decrease in fibrinogen plasma levels. The leukogram analysis showed an increase in the circulating leukocyte number up to 3 hours after moojenactivase administration, composed predominantly of neutrophils. However, parameters envolving red cells shows that the protease do not affect. The results obtained in the present work show, for the first time, the isolation of a PIIId class metalloprotease from Bothrops moojeni snake venom involved on the activation of several hemostatic events, inducing a pro coagulant activity and leading to blood unclottable state in experimental animals. These data can assit in understanding coagulation disturbs in iv patients involved in Bothrops moojeni envenomation and leading to a better anti ophidic therapy guidance. Moreover, moojenactivase functional activities accredits this protease as a possible molecular instrument applied on biotechnological prospect related to the hemostasis.

A luminescência persistente é um fenômeno em que o material emite radiação de segundos a várias horas após cessada a irradiação (luz, radiação UV, feixe de elétrons, etc.). No entanto, os mecanismos que geram o fenômeno da luminescência persistente ainda não são totalmente estabelecidos. Neste trabalho os materiais Lu2O3:TR3+,M (TR,M: Pr,HfIV; Eu, Ca2+ ou Tb,Ca2+) foram preparados pelo método de estado-sólido assistido por micro-ondas (MASS) e comparados com aqueles sintetizados pelo método cerâmico. As vantagens do método MASS incluem curto tempo de processamento, aquecimento dielétrico seletivo, baixo consumo de energia e uso de equipamentos de baixo custo (forno micro-ondas doméstico), muitas vezes produzindo produtos de alta pureza e alto rendimento. Os materiais foram caracterizados pelas técnicas de espectroscopia de absorção na região do infravermelho (IR), espectroscopia Raman, difração de raios X método do pó (DRX), microscopia eletrônica de varredura (MEV), X-ray absorption near edge structure (XANES), Extended X-ray absorption fine structure (EXAFS), X-ray Excited Optical Luminescence (XEOL), espectroscopia de fotoluminescência na região do UV-Visível, espectroscopia de fotoluminescência na região do UV-UV vácuo e termoluminescência (TL). Os fósforos Lu2O3:TR3+,M (TR,M: Pr,HfIV; Eu, Ca2+ ou Tb,Ca2+) foram preparados em um curto período de tempo (22-26 min) pelo método MASS utilizando forno micro-ondas doméstico, carvão ativado como susceptor, fluxos (H3BO3 ou Na2CO3) e sem a aplicação de gases. Todos materiais preparados com fluxo de H3BO3 exibem impurezas de LuBO3 que foram quantificadas por refinamento Rietveld. Os fluxos e os dopantes não alteraram consideravelmente a estrutura cristalina da matriz C-Lu2O3. As micrografias MEV sugerem que o fluxo de Na2CO3 e os precursores nitratos geram partículas de Lu2O3 com tamanho menor devido a evolução de gases provenientes da decomposição destes compostos. Por outro lado, quando é usado óxidos como precursores os materiais apresentam maiores tamanhos de partícula e na presença de H3BO3 leva a maior agregação. Os dados de XANES indicam que houve completa redução do íon TbIV &#8594 Tb3+ e parcial do PrIV &#8594 Pr3+, devido ao uso de carvão ativado que gera CO(g) durante o tratamento térmico. Os espectros da luminescência persistente indicam emissões nas regiões do vermelho/NIR, vermelho alaranjado e verde atribuídas as transições 4fN &#8594 4fN características dos íons Pr3+, Eu3+ e Tb3+, respectivamente. As diferenças entre os espectros registrados sob excitação UV e após cessada a irradiação podem ser explicadas pela emissão da luminescência persistente predominante dos íons TR3+ no sítio S6 do que no C2. Além disso, a co-dopagem aliovalente com os íons HfIV e Ca2+ aumentam a intensidade e duração da luminescência persistente. Isto ocorre através da geração de armadilhas provenientes dos dois co-dopantes nos sítios de Lu3+ e por defeitos produzidos na compensação de carga. Os materiais fotônicos preparados pelo método MASS com fluxo de H3BO3 apresentam maior intensidade e duração da luminescência persistente comparados aos preparados pelo método cerâmico ou sem a presença de H3BO3. Os mecanismos da luminescência persistente foram desenvolvidos através de princípios similares baseados nos dados experimentais da energia do band gap, posição dos níveis de energia dos íons TR3+/2+ na matriz e energia das armadilhas. Isto confirma a solidez da interpretação dos dados experimentais dos materiais Lu2O3:TR3+,M exibindo luminescência persistentes e encoraja a expansão de modelos similares para outros materiais apresentando esse fenômeno. Os fósforos Lu2O3:Pr3+,HfIV,Lu2O3:Eu3+(,Ca2+) e Lu2O3:Tb3+,Ca2+) apresentaram sintonização de cores de emissão tanto para o fenômeno da fotoluminescência como da luminescência persistente, podendo atuar como bons candidatos nas aplicações de bioimageamento ou sensibilizadores de células solares. / Persistent luminescence is a phenomenon where the material emits radiation from seconds to several hours after cessation of irradiation (light, UV radiation, electron beam, etc.). The persistent luminescence mechanisms are not entirely established, however. In this work, the materials Lu2O3:TR3+,M (TR,M: PrHfIV; Eu, Ca2+ or Tb,Ca2+) were prepared by MASS method as well as compared to these materials synthetized by ceramic method. The advantages of MASS method include short processing time, selective dielectric heating, low energy consumption and use of inexpensive equipment (domestic microwave oven), often affording high-purity and high-yield products. The materials were characterized by Infrared absorption spectroscopy (IR), Raman spectroscopy, X-ray powder diffraction (XPD), Scanning electron microscopy (SEM), X-ray absorption near edge structure (XANES), Extended X-ray absorption fine structure (EXAFS), X-ray excited optical luminescence (XEOL), photoluminescence spectroscopy in the UV-Visible range, photoluminescence spectroscopy in the UV-UV vacuum region and thermoluminescence (TL). The phosphorsLu2O3:TR3+,M (TR,M: Pr,HfIV; Eu, Ca2+ or Tb,Ca2+) were rapidly (22-26 min) and successfully prepared by MASS method using a domestic microwave oven, carbon as susceptor, fluxes (H3BO3 or Na2CO3) and without special gases application. All materials prepared with H3BO3 flux exhibit LuBO3 impurities that were quantified by Rietveld refinement. The flux and dopants does not considerably affect the crystalline structure of the C-Lu2O3 host matrix. Scanning electron micrographs suggest that Na2CO3 flux and nitrates precursors produce Lu2O3 particles of small size due to the gases evolution from the decomposition of these compounds. On the other hand, the materials prepared from oxides precursors have particles of large size and H3BO3 flux induces particle xi aggregation. The carbon used as the susceptor generates CO gas, leading to complete reduction of TbIV to Tb3+ and partial conversion of PrIV to Pr3+ present in the Tb4O7 and Pr6O11 precursors, as indicated by XANES. Persistent luminescence spectra of the materials show emission in the red/NIR, reddish orange and green ranges assigned to the 4fN &#8594 4fN transitions characteristics of Pr3+, Eu3+ and Tb3+ ions, respectively. Differences between the spectra recorded under UV excitation and after ceased the irradiation can be explained by the predominant persistent luminescence emission of TR3+ ion in the S6 site rather than TR3+ in the C2 site. In addition, inclusion of HfIV and Ca2+ codopants in the Lu2O3 host increases the emission intensity and duration of persistent luminescence due to generation of traps caused by charge compensation in the lattice as well as these metal ions in the Lu3+ sites. The photonic materials prepared by MASS method with H3BO3 flux show higher persistent luminescence performance than those prepared by the ceramic method or MASS without flux. The persistent luminescence mechanisms were developed through similar principles based on experimental data of band gap energy, energy level positions of TR3+/2+ ions in the host and traps energy. This similarity confirms the consistency of the interpretation of experimental data for the Lu2O3:TR3+,M materials and encourages the expansion of similar models for other persistent luminescence materials. Color tuning of persistent luminescence in Lu2O3:TR3+,M (TR,M: Pr,HfIV; Eu,Ca2+ or Tb,Ca2+) provides potential applications in bioimaging as well as in solar cell sensitizers.