Submitted by FABIANA DA SILVA FRANÇA (fabiana21franca@gmail.com) on 2017-11-09T16:00:06Z No. of bitstreams: 2 arquivototal.pdf: 6569210 bytes, checksum: e5c8caef20052f8926c2763bec055f88 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-09T16:00:06Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivototal.pdf: 6569210 bytes, checksum: e5c8caef20052f8926c2763bec055f88 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-02-22 / Background: Nitric oxide (NO) donors can act in the control and treatment of various cardiovascular complications, such as hypertension. In particular, an organic nitrate, 2-nitrate-1,3-dibutoxipropane (NDBP) developed in recent years by UFPB has shown great therapeutic potential. However, its mechanisms are not fully clarified. Aim: To investigate the effects and mechanisms of NDBP, elucidating their therapeutic potential in angiotensin II-mediated hypertension. Methods: In the first stage of the study, were performed in vitro experiments in normotensives Wistar rats (n=11) tissues for characterization of compound about ability to release NO by direct measurement of NO; and modulation of NADPH oxidase activity, by chemiluminescence technique. In the second stage of the study, in vivo experiments in C57BL / 6J mice (n=24), divided in four groups (control, NDBP, Ang II and Ang II + NDBP) were performed to investigate the therapeutic potential of NDBP in angiotensin II-mediated hypertension. The animals had implantation of osmotic minipumps containing Ang II (400 mg / kg / 24h) and after 9 days were treated with NDBP (40 mg / kg / day; ip). Blood pressure (BP) was measured by tail-cuff. At the end of the experiments, the animals were euthanized and blood and tissues were collected for analysis. Histopathological analyzes were performed using staining picrosirius. Superoxide levels were measured by NADPH oxidase activity via chemiluminescence and DHE fluorescence (5 mmol • L-1). Levels of serum nitrate/nitrite and cGMP were performed using specific kits. NADPH oxidase subunit expression were analyzed by real time qPCR. Putative antioxidant activity was determined by autoxidation with pyrogallol. Results: In vitro experiments revealed a dose-dependent increase in NO production mediated by NDBP in liver and kidney tissues, which was attenuated by the xanthine oxidase inhibitor febuxostat. In addition, the NDBP reduced NADPH oxidase activity and prevented its activation induced by ANG II. In vivo experiments showed that NDBP prevents the increase in hypertension in mice with chronic infusion of ANG II. This results were associated to the attenuation of cardiac hypertrophy, renal fibrosis, and reduced NADPH oxidase-derived oxidative stress in the kidneys, the heart, and liver. Furthermore, NDBP also increased plasma levels of nitrite and nitrate. On the other hand, the autoxidation with pyrogallol revealed that NDBP does not act as a direct antioxidant, justifying its involvement in the modulation of NADPH oxidase. Conclusions: The organic nitrate NDBP prevents the progression of angiotensin II-mediated hypertension. Regarding the mechanisms, our findings suggest that NDBP treatment is associated with sustained NO release and attenuated activity of NADPH oxidase, which requires functional xanthine oxidase. / Introdução: Doadores de óxido nítrico (NO) podem atuar no controle e tratamento de diversas complicações cardiovasculares, como por exemplo, a hipertensão arterial. Em particular, um nitrato orgânico, 2-nitrato-1,3-dibutoxipropano (NDBP) desenvolvido nos últimos anos pela UFPB vem apresentando grande potencial terapêutico. No entanto, seus mecanismos não estão totalmente esclarecidos. Objetivo: Investigar os efeitos e os mecanismos de ação do NDBP, elucidando seu potencial terapêutico na hipertensão arterial induzida por Angiotensina II (ANG II). Métodos: Na primeira etapa do estudo foram realizados experimentos in vitro em tecidos de ratos Wistar normotensos (n=11) para caracterização do composto, sobre sua capacidade de liberação de NO, por meio da medida direta de NO; e modulação da atividade da enzima NADPH oxidase, pela técnica de quimioluminescência. Na segunda etapa do estudo, experimentos in vivo em camundongos C57BL/6J (n=24), classificados em quatro grupos (Controle, NDBP, ANG II e ANG II + NDBP), foram realizados para investigar o potencial terapêutico do NDBP na hipertensão induzida por ANG II. Os animais tiveram implante de minibombas osmóticas contendo ANG II (400 μg/kg/24h) e após 9 dias receberam tratamento com NDBP (40 mg/kg/dia; i.p.). A pressão arterial (PA) foi verificada via pletismografia de cauda. Ao término dos experimentos, os animais foram eutanasiados e tecidos e sangue foram coletadas para análise posterior. Análises histopatológicas foram realizadas utilizando a coloração com Picro-sirius. Os níveis de superóxido foram mensurados por meio da atividade da enzima NADPH oxidase, via quimioluminescência e fluorescência com DHE (5 mmol·L−1). Além disso, os níveis séricos de nitrato/nitrito e cGMP foram realizados, utilizando kits específicos. Foi investigada também a expressão de subunidades da enzima NADPH oxidase pela técnica de qPCR em tempo real e a possível atividade antioxidante por meio da autoxidação com pyrogallol. Resultados: os experimentos in vitro utilizando tecidos de fígado e rim revelaram um aumento dose-dependente na produção de NO, mediado pelo NDBP, que foi atenuado pelo inibidor da enxima xantina oxidase, o febuxostato. Além disso, o NDBP reduziu a atividade da NADPH oxidase e preveniu sua ativação induzida pela ANG II. Os experimentos in vivo mostraram que o NDBP previne o aumento da hipertensão arterial em camundongos com infusão crônica de ANG II. Esses resultados foram associados à atenuação da hipertrofia cardíaca, fibrose renal, e redução do estresse oxidativo mediado pela redução da atividade da enzima NADPH oxidase nos rins, coração e fígado. Além disso, o NDBP aumentou os níveis plasmáticos de nitrito e nitrato. Por outro lado, a autooxidação com pyrogalol revelou que o NDBP não atua como um antioxidante direto, justificando então sua participação na modulação da NADPH oxidase. Conclusão: o nitrato orgânico NDBP impede a progressão da hipertensão arterial mediada pela angiotensina II. Em relação aos seus mecanismos, os achados sugerem que o tratamento com NDBP está associado a uma contínua liberação de NO e redução da atividade da enzima NADPH oxidase, que parece ser dependente da xantina oxidase funcional.

O balanço redox em mitocôndrias de mamíferos é realizado pelo transportador de aspartato-glutamato (AGC), o qual é o principal mecanismo para o movimento de equivalentes redutores na forma de NADH. A citrulinemia do tipo II (CTLN2) é uma doença autossômica recessiva de início tardio, causada por mutações no gene SLC25A13 que codifica a citrina. A citrina é uma isoforma do transportador AGC e catalisa o transporte de glutamato citosólico através da troca com o aspartato mitocondrial, o qual será utilizado no ciclo da ureia. A CTLN2 promove uma deficiência no ciclo da ureia e consequente hiperamonemia. A deficiência da citrina promove um aumento da razão NADH/NAD+ citosólica. O aumento dessa razão inibe a glicólise e a gliconeogênese. O desenvolvimento de modelo in vitro da CTLN2 é importante para estudos do mecanismo da doença e de novas terapias. A expressão heteróloga de proteínas entre diferentes reinos tem sido utilizado como uma forma de corrigir algumas doenças mitocondriais. Estudos bioquímicos e moleculares em nosso laboratório demonstraram a presença de um transportador mitocondrial de nicotinamida adenina dinucleotídeo (Ndt1) em Aspergillus fumigatus. Ndt1 realiza o transporte de NAD+ citosólico para a matriz mitocondrial, sendo dessa forma uma proteína importante para manter o balanço redox em A. fumigatus. Assim, o objetivo deste trabalho foi obter uma linhagem de células de mamífero HEK293 com knockdown para o gene SLC25A13, ou seja, um modelo in vitro de CTLN2 e a expressão heteróloga da proteína Ndt1 como uma forma de recuperação do metabolismo. As células com knockdown para o gene SLC25A13 apresentaram um aumento da razão NADH/NAD+ citosólico, redução da glicólise, redução da concentração da ureia e aumento da concentração de amônia. A expressão de Ndt1 foi capaz de reduzir a razão NADH/NAD+ citosólico e recuperou a atividade glicolítica. Entretanto, a expressão de Ndt1 não foi capaz de aumentar a concentração de ureia e reduzir a concentração de amônia causadas pela CTLN2. Dessa forma, nossos resultados sugerem que a expressão da proteína Ndt1 em células de mamíferos recupera o metabolismo mitocondrial e atividade glicolítica das células com CTLN2, mas não melhora o ciclo da ureia e o aumento da concentração de amônia. / Redox balance in mammalian mitochondria is performed by the aspartate-glutamate carrier (AGC), which is the main mechanism for the movement of reducing equivalents in the form of NADH.Type II citrullinemia (CTLN2) is an adult-onset autosomal recessive disease caused by mutations in SLC25A13 gene, and that coding citrin. Citrin is an isoform of AGC and catalyzes the transport of cytosolic glutamate through exchange with mitochondrial aspartate. It will be used in the urea cycle. CTLN2 causes urea cycle deficiency and hyperammonemia. Citrin deficiency cause an increase in the cytosolic NADH/NAD+ ratio. The increase in this ratio inhibits glycolysis and gluconeogenesis. The development an in vitro CTLN2 model is important for new studies about the disease mechanism and new therapies. Heterologous expression of proteins from different organisms has been used to recover some mitochondrial diseases. Biochemical and molecular studies in our laboratory demonstrated the presence of a mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide transporter (Ndt1) in Aspergillus fumigatus. Ndt1 protein performs cytosolic NAD+ transport to the mitochondria matrix, thus being an important protein to keep the redox balance in A. fumigatus. Thus, the aim of this work was to obtain a line of HEK293 mammalian cells with knockdown for the SLC25A13 gene, an in vitro CTLN2 model and the heterologous expression of the Ndt1 protein as a form of metabolism recovery. Cells with citrin knockdown showed an increase of cytosolic NADH/NAD+ ratio, reduction of glycolysis, reduction of urea concentration, and increase of ammonia concentration. Expression of Ndt1 protein was able to reduce cytosolic NADH/NAD+ ratio and recovered the glycolytic activity. However, Ndt1 protein was not able to increase the urea concentration and reduce of ammonia concentration caused by CTLN2. Thus, our results suggest that expression of Ndt1 protein in mammal cells recovers the mitochondrial metabolism and glycolytic activity in CTLN2 cells but does not improve urea cycle and reduce ammonia concentration.

O excesso de adenina na dieta (ADE) promove precipitação intratubular de cristais, levando à instalação de uma nefrite intersticial progressiva e perda da função renal. Observações recentes indicam que a sobrecarga de ADE em camundongos em que os genes para TLR-2, -4, MyD88, ASC ou caspase-1 foram inativados provoca menos dano renal do que quando administrado a camundongos selvagens, sugerindo a existência de um papel patogênico para a ativação de TLRs e a montagem de inflamassomas nesse modelo. O presente estudo foi concebido para investigar se outro importante componente da imunidade inata, o sistema NF-B, também exerce papel patogênico na nefropatia associada ao excesso de ADE. Ratos Munich-Wistar machos e adultos foram divididos em 3 grupos: C (N=17), ração padrão; ADE (N=17), ADE na ração, 0,7% durante 1 semana e 0,5% durante 2 semanas; ADE+PDTC (N=14), ADE administrada como descrito anteriormente, associada ao inibidor do NF-B, pirrolidina ditiocarbamato (PDTC), 120 mg/kg/dia na água do bebedouro. Após 3 semanas, observou-se deposição de numerosos cristais no tecido renal, em sua maioria no interior de granulomas de corpo estranho, acompanhada de intensa atividade proliferativa tubulointersticial. Uma parte dos cristais apareceu envolvida por uma camada de células aparentemente derivadas do epitélio tubular, que pareciam segregar os precipitados e, em alguns casos, expulsá-los ao interstício. Essas alterações associaram-se a uma grande expansão da área intersticial, com deposição de colágeno, além de hipotrofia glomerular. Foi possível ainda demonstrar um aumento da expressão da interleucina-6, do interferon-, da proteína específica de fibroblastos (FSP-1) e da proteína quimiotática para macrófagos (MCP-1). A abundância do IKK-, uma quinase ativadora do sistema NK-B, mostrou-se também acentuadamente elevada nesses ratos. O tratamento com PDTC normalizou a expressão do IKK-, diminuindo o número de granulomas e a proliferação celular, além de atenuar fortemente a fibrose e o declínio da função renal. Esses achados, que contribuem para elucidar os mecanismos de formação de granulomas no modelo de sobrecarga de adenina, são consistentes com o conceito de que o sistema NF-B é ativado pela precipitação intratubular de cristais e contribui, juntamente com outros mecanismos ligados à imunidade inata, para iniciar a intensa resposta inflamatória associada a esse modelo. Descritores: 1.Insuficiência renal crônica 2.Adenina 3.Imunidade inata 4.NF-kappa B 5.GranulomaO excesso de adenina na dieta (ADE) promove precipitação intratubular de cristais, levando à instalação de uma nefrite intersticial progressiva e perda da função renal. Observações recentes indicam que a sobrecarga de ADE em camundongos em que os genes para TLR-2, -4, MyD88, ASC ou caspase-1 foram inativados provoca menos dano renal do que quando administrado a camundongos selvagens, sugerindo a existência de um papel patogênico para a ativação de TLRs e a montagem de inflamassomas nesse modelo. O presente estudo foi concebido para investigar se outro importante componente da imunidade inata, o sistema NF-B, também exerce papel patogênico na nefropatia associada ao excesso de ADE. Ratos Munich-Wistar machos e adultos foram divididos em 3 grupos: C (N=17), ração padrão; ADE (N=17), ADE na ração, 0,7% durante 1 semana e 0,5% durante 2 semanas; ADE+PDTC (N=14), ADE administrada como descrito anteriormente, associada ao inibidor do NF-B, pirrolidina ditiocarbamato (PDTC), 120 mg/kg/dia na água do bebedouro. Após 3 semanas, observou-se deposição de numerosos cristais no tecido renal, em sua maioria no interior de granulomas de corpo estranho, acompanhada de intensa atividade proliferativa tubulointersticial. Uma parte dos cristais apareceu envolvida por uma camada de células aparentemente derivadas do epitélio tubular, que pareciam segregar os precipitados e, em alguns casos, expulsá-los ao interstício. Essas alterações associaram-se a uma grande expansão da área intersticial, com deposição de colágeno, além de hipotrofia glomerular. Foi possível ainda demonstrar um aumento da expressão da interleucina-6, do interferon-, da proteína específica de fibroblastos (FSP-1) e da proteína quimiotática para macrófagos (MCP-1). A abundância do IKK-, uma quinase ativadora do sistema NK-B, mostrou-se também acentuadamente elevada nesses ratos. O tratamento com PDTC normalizou a expressão do IKK-, diminuindo o número de granulomas e a proliferação celular, além de atenuar fortemente a fibrose e o declínio da função renal. Esses achados, que contribuem para elucidar os mecanismos de formação de granulomas no modelo de sobrecarga de adenina, são consistentes com o conceito de que o sistema NF-B é ativado pela precipitação intratubular de cristais e contribui, juntamente com outros mecanismos ligados à imunidade inata, para iniciar a intensa resposta inflamatória associada a esse modelo / Excessive dietary adenine (ADE) promotes intratubular precipitation of crystals, leading to the installation of progressive interstitial nephritis and renal function loss. Recent observations indicate that ADE overload in mice in which genes for TLR-2, -4, MyD88, ASC or caspase-1 were inactivated causes less renal damage than when administered to wild-type mice, suggesting the existence of a pathogenic role for the activation of TLRs and the assembly of inflamassomes in this model. The present study was designed to investigate whether another important component of innate immunity, the NF-B system, also plays a role in the pathogenesis of the nephropathy associated with excess ADE. Adult Male Munich-Wistar rats were distributed among three groups: C (n = 17), receiving standard diet; ADE (N = 17), given ADE in the diet at 0.7% for 1 week and 0.5% for 2 weeks; and ADE + PDTC (N = 14), receiving ADE as described above, associated with the NF-B inhibitor, pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), 120 mg/kg/ day in drinking water. After three weeks, there was widespread deposition of crystals in the renal tissue, mostly within granulomas, accompanied by florid tubulointerstitial proliferative activity. Part of these crystals was enclosed in a layer of cells apparently derived from the tubular epithelium, which appeared to segregate the precipitates, and in some cases, to extrude them to the interstitium. These changes were associated with marked interstitial expansion, collagen deposition, and glomerular hypotrophy. Increased expression of interleukin-6, interferon-, fibroblast specific protein (FSP-1) and macrophage chemoattractant protein (MCP-1) were also shown. The abundance of IKK-, a kinase that activates the NF-B system, was also markedly elevated in these mice. Treatment with PDTC normalized the expression of IKK-, reducing the number of granulomas and cell proliferation, and strongly attenuated interstitial fibrosis and the decline of renal function. These findings, which contribute to illuminate some mechanisms of granuloma formation in the ADE overload model, are consistent with the concept that the NF-B system is activated by intratubular precipitation of crystals and contributes, along with other mechanisms related to innate immunity, to initiate the intense inflammatory response associated with this model

O A. fumigatus é um fungo saprofítico e tornou-se um dos principais agente patogênico oportunista em pacientes imunossuprimidos. Estudos prévios em nosso laboratório foi demonstrado que em mitocôndrias de P. brasiliensis e de A. fumigatus, o NAD+ era capaz de induzir a formação de potencial de membrana mitocondrial, o qual podia ser dissipado por FCCP, sugerindo a presença de um transportador de NAD+/NADH, conforme havia sido descrito em S. cerevisiae. Através de ferramentas de bioinformática, foi identificado no Aspergillus Gene Database, uma sequência com 32% de identidade com o gene ndt1p de S. cerevisiae. A sequência de cDNA, contendo 1.194 pb foi obtida usando PCR-Overlaping e clonada em vetor pGEM®-T Easy. Em seguida, a sequência foi subclonada em vetor de expressão pET28-a(+) e expressa em E. coli BL21(DE3). A proteína recombinante foi purificada a partir dos corpos de inclusão e sua identidade confirmada por espectrometria de massas e por Western Blotting usando anticorpo anti-His-tag. A proteína recombinante foi utilizada para produção de anticorpo policlonal anti-Ndt1 em coelho. Para expressão em levedura, o cDNA do gene ndt1 de A. fumigatus foi subclonado em vetor pYES2 e as leveduras S. cerevisiae ?ndt1?ndt2 foram transformadas. Foi realizada a curva de crescimento e indução da expressão da proteína recombinante Ndt1, a presença da proteína foi detectada utilizando anticorpo policlonal anti-Ndt1 após 16 horas de expressão. Nesse período foi verificado que as leveduras estavam em fase de crescimento exponencial. A cepa duplo mutante apresenta uma taxa de crescimento menor quando comparada com a cepa expressando a proteína recombinante quando crescidas em meio fermentável. As mitocôndrias isoladas de ambas as cepas foram submetidas à medida do potencial de membrana onde apresentavam acoplamento entre a oxidação de substratos e a fosforilação oxidativa. Além disso, ficou evidenciado que na cepa expressando a proteína recombinante, NAD+ induziu a formação de um potencial de membrana maior que na cepa controle. O transporte de NAD+ foi realizado e demonstrou que a cepa expressando a proteína Ndt1 tinha um aumento na fluorescência de NADH, mostrando que NAD+ foi capaz de entrar na matriz mitocondrial e posteriormente ser reduzido a NADH por enzimas da matriz mitocondrial. A determinação da produção de espécies reativas de oxigênio foi realizada utilizando as sondas fluorescentes CM-H2DCFDA e MitoSox Red em esferoplastos da levedura S. cerevisiae. Ambos experimentos não houve diferença significativa entre a cepa expressando a proteína Ndt1 e a cepa controle. As proteínas carboniladas foram determinadas utilizando anticorpo anti-DNP, após a reação com dinitrofenilhidrazona e não há diferença significativa entre as cepas. Finalmente, para confirmação da localização celular da proteína Ndt1, os esferoplastos de S. cerevisiae foram submetidos à microscopia confocal, onde ficou evidenciado a co-localização da proteína Ndt1 com as mitocôndrias na cepa de S. cerevisiae transformada com a construção pYES/ndt1, o mesmo perfil não foi observado na cepa ?ndt1?ndt2. / The A. fumigatus is a saprophytic fungus and is a major opportunistic pathogen in immunosuppressed patients. Previous studies in our lab has showed that mitochondrias of the P. brasiliensis and A. fumigatus, NAD+ is able to induce the formation of mitochondrial membrane potential, which could be dissipated by FCCP, suggesting the presence of a NAD+/NADH carrier as described in S. cerevisiae. Using bioinformatics tools, it was identified in Aspergillus Gene database a sequence containing 32% of identity with the gene ndt1p of S. cerevisiae. A fragment of cDNA was obtained from the ndt1p mRNA sequence, containing 1194 bp by using PCR-overlaping and cloned in pGEM®-T Easy vector. Then, the sequence was subcloned in pET28-a(+) vector and expressed in E. coli BL21 (DE3). The recombinant protein was purified from inclusion bodies and the identity confirmed by mass spectrometry and by Western Blotting using anti-His-tag antibody. The recombinant protein was used to produce polyclonal antibody anti-Ndt1 in rabbit. For expression in yeast, the ndt1 cDNA of A. fumigatus was subcloned into pYES2 vector and the yeast S. cerevisiae ?ndt1?ndt2 were transformed. Growth curve and induction of the recombinant protein expression Ndt1 was performed and the protein was detected using a polyclonal anti-Ndt1 antibody after 16 hours of expression. During this period it was found that the yeast were in exponential growth phase. The double mutant strain shows a slower growth rate compared to the strain expressing the recombinant protein growth rate when grown in fermentable medium. The isolated mitochondria from both strains were subjected to measurement of the membrane potential which showed coupling between substrate oxidation and oxidative phosphorylation. Furthermore, these measurements evidenced that the strain expressing the recombinant protein NAD+ induced the formation of a membrane potential larger than the control strain. The transport NAD+ was evaluated and showed that the strain expressing the protein Ndt1 has an increase in NADH fluorescence, indicating that NAD+ was able to enter into the mitochondrial matrix and then reduced to NADH by enzymes from the matrix. The determination of the production of reactive oxygen species was performed using the fluorescent probe CM-H2DCFDA and MitoSox Red in spheroplasts of the yeast S. cerevisiae. Both experiments showed no significant difference between the strain expressing Ndt1 protein and strain control. The carbonylated proteins levels were checked using anti-DNP, after the reaction with dinitrophenylhydrazone and there is no significant difference between the strains. Finally, to confirm the cellular localization of the protein Ndt1, spheroplasts of S. cerevisiae were subjected to confocal microscopy, which evidenced the co-location of Ndt1 protein with mitochondria in S. cerevisiae strain transformed with the construction pYES/ndt1. This same profile was not observed in strain ?ndt1?ndt2.

Made available in DSpace on 2015-04-01T14:16:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 5234352 bytes, checksum: 404f7b4f1ab797fa6090d6cd85ee8163 (MD5) Previous issue date: 2013-08-16 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Plants are sessile organisms susceptible to biotic and abiotic stresses. Insect herbivore attacks are factors that affect their survival and development. To defend themselves, plants produce and release chemical compounds, such as non protein amino acids, that negatively affect the development processes of their attackers, as well as use phytohormones that regulate defense responses against herbivory. In the present work, we seek to understand in depth the insecticidal activity related to ConM, a lectin isolated from beach bean seeds (Canavalia maritima Aub.), through their crystal structure analysis in complex with the non protein amino acid GABA (gamma-aminobutyric acid) and adenine, a nitrogen base-precursor of cytokinins, phytohormones involved in defense responses against insect herbivores. In this way, we co-crystallized ConM with GABA and soaked the derived crystals into an adenine 5mM solution. It was viewed through ConM monomeric model that GABA stabilization occurs through interactions displayed with amino acid residues that participate in the coordination of its isomer alpha-aminobutyric acid (Abu). In the other hand, adenine molecule displays interactions with amino acid residues from ConM Carbohydrate Recognition Domain due ahydrophobic pocket adjacently localized to this ligand-binding site and formed from a secondary non repetitive structure of β-bulge. A dimeric model of ConM reveals that lectin insecticidal activity is related to conformational changes of Gln132, resulting in GABA release without quaternary structure change. Hence, the presented results might contribute to greater understanding of lectins interactions with different chemical ligands, helping their application as biotechnological tools. / Plantas são organismos sésseis que encontram-se susceptíveis a estresses bióticos e abióticos. O ataque de insetos herbívoros é um fator que afeta sua sobrevivência e seu desenvolvimento. Como defesa, estes organismos são capazes de produzir e liberar compostos químicos, como aminoácidos não proteicos, que interferem no desenvolvimento dos insetos agressores, e utilizam fitohormônios para regular suas respostas de defesa. No presente trabalho, buscamos entender o papel inseticida da ConM, uma lectina isolada de sementes do feijão-de-praia (Canavalia maritima Aub.), a partir da análise de sua estrutura tridimensional em complexo com o aminoácido não proteico GABA (ácidogama-aminobutírico) e com a base nitrogenada adenina, precursora das citocininas, fitohormônios envolvidos com processos de defesa contra insetos herbívoros. Para tanto, resolvemos a estrutura cristalográfica da ConM co-cristalizada com o GABA e soaked com a adenina 5mM. O modelo monomérico da lectina mostrou que o GABA encontra-se coordenado por interações com resíduos de aminoácidos previamente reportados como sendo participantes da estabilização do ácido alfaaminobutírico (Abu). A adenina, por outro lado, é estabilizada por interações com resíduos constituintes do domínio de reconhecimento a carboidrato da ConM, o que pode ser explicado pela presença de uma região hidrofóbica adjacente a este sítio, formada por uma estrutura secundária não repetitiva do tipo β-bulge. Um modelo dimérico da ConM revela que a atividade inseticida de lectinas está relacionada com mudanças conformacionais da Gln132, permitindo que o GABA seja liberado sem alteração da estrutura quaternária. Assim, os resultados aqui apresentados podem contribuir para um maior entendimento acerca da capacidade de interação de lectinas vegetais com diferentes tipos de ligantes, facilitando sua utilização como ferramenta biotecnológica.

O A. fumigatus é um fungo saprofítico e tornou-se um dos principais agente patogênico oportunista em pacientes imunossuprimidos. Estudos prévios em nosso laboratório foi demonstrado que em mitocôndrias de P. brasiliensis e de A. fumigatus, o NAD+ era capaz de induzir a formação de potencial de membrana mitocondrial, o qual podia ser dissipado por FCCP, sugerindo a presença de um transportador de NAD+/NADH, conforme havia sido descrito em S. cerevisiae. Através de ferramentas de bioinformática, foi identificado no Aspergillus Gene Database, uma sequência com 32% de identidade com o gene ndt1p de S. cerevisiae. A sequência de cDNA, contendo 1.194 pb foi obtida usando PCR-Overlaping e clonada em vetor pGEM®-T Easy. Em seguida, a sequência foi subclonada em vetor de expressão pET28-a(+) e expressa em E. coli BL21(DE3). A proteína recombinante foi purificada a partir dos corpos de inclusão e sua identidade confirmada por espectrometria de massas e por Western Blotting usando anticorpo anti-His-tag. A proteína recombinante foi utilizada para produção de anticorpo policlonal anti-Ndt1 em coelho. Para expressão em levedura, o cDNA do gene ndt1 de A. fumigatus foi subclonado em vetor pYES2 e as leveduras S. cerevisiae ?ndt1?ndt2 foram transformadas. Foi realizada a curva de crescimento e indução da expressão da proteína recombinante Ndt1, a presença da proteína foi detectada utilizando anticorpo policlonal anti-Ndt1 após 16 horas de expressão. Nesse período foi verificado que as leveduras estavam em fase de crescimento exponencial. A cepa duplo mutante apresenta uma taxa de crescimento menor quando comparada com a cepa expressando a proteína recombinante quando crescidas em meio fermentável. As mitocôndrias isoladas de ambas as cepas foram submetidas à medida do potencial de membrana onde apresentavam acoplamento entre a oxidação de substratos e a fosforilação oxidativa. Além disso, ficou evidenciado que na cepa expressando a proteína recombinante, NAD+ induziu a formação de um potencial de membrana maior que na cepa controle. O transporte de NAD+ foi realizado e demonstrou que a cepa expressando a proteína Ndt1 tinha um aumento na fluorescência de NADH, mostrando que NAD+ foi capaz de entrar na matriz mitocondrial e posteriormente ser reduzido a NADH por enzimas da matriz mitocondrial. A determinação da produção de espécies reativas de oxigênio foi realizada utilizando as sondas fluorescentes CM-H2DCFDA e MitoSox Red em esferoplastos da levedura S. cerevisiae. Ambos experimentos não houve diferença significativa entre a cepa expressando a proteína Ndt1 e a cepa controle. As proteínas carboniladas foram determinadas utilizando anticorpo anti-DNP, após a reação com dinitrofenilhidrazona e não há diferença significativa entre as cepas. Finalmente, para confirmação da localização celular da proteína Ndt1, os esferoplastos de S. cerevisiae foram submetidos à microscopia confocal, onde ficou evidenciado a co-localização da proteína Ndt1 com as mitocôndrias na cepa de S. cerevisiae transformada com a construção pYES/ndt1, o mesmo perfil não foi observado na cepa ?ndt1?ndt2. / The A. fumigatus is a saprophytic fungus and is a major opportunistic pathogen in immunosuppressed patients. Previous studies in our lab has showed that mitochondrias of the P. brasiliensis and A. fumigatus, NAD+ is able to induce the formation of mitochondrial membrane potential, which could be dissipated by FCCP, suggesting the presence of a NAD+/NADH carrier as described in S. cerevisiae. Using bioinformatics tools, it was identified in Aspergillus Gene database a sequence containing 32% of identity with the gene ndt1p of S. cerevisiae. A fragment of cDNA was obtained from the ndt1p mRNA sequence, containing 1194 bp by using PCR-overlaping and cloned in pGEM®-T Easy vector. Then, the sequence was subcloned in pET28-a(+) vector and expressed in E. coli BL21 (DE3). The recombinant protein was purified from inclusion bodies and the identity confirmed by mass spectrometry and by Western Blotting using anti-His-tag antibody. The recombinant protein was used to produce polyclonal antibody anti-Ndt1 in rabbit. For expression in yeast, the ndt1 cDNA of A. fumigatus was subcloned into pYES2 vector and the yeast S. cerevisiae ?ndt1?ndt2 were transformed. Growth curve and induction of the recombinant protein expression Ndt1 was performed and the protein was detected using a polyclonal anti-Ndt1 antibody after 16 hours of expression. During this period it was found that the yeast were in exponential growth phase. The double mutant strain shows a slower growth rate compared to the strain expressing the recombinant protein growth rate when grown in fermentable medium. The isolated mitochondria from both strains were subjected to measurement of the membrane potential which showed coupling between substrate oxidation and oxidative phosphorylation. Furthermore, these measurements evidenced that the strain expressing the recombinant protein NAD+ induced the formation of a membrane potential larger than the control strain. The transport NAD+ was evaluated and showed that the strain expressing the protein Ndt1 has an increase in NADH fluorescence, indicating that NAD+ was able to enter into the mitochondrial matrix and then reduced to NADH by enzymes from the matrix. The determination of the production of reactive oxygen species was performed using the fluorescent probe CM-H2DCFDA and MitoSox Red in spheroplasts of the yeast S. cerevisiae. Both experiments showed no significant difference between the strain expressing Ndt1 protein and strain control. The carbonylated proteins levels were checked using anti-DNP, after the reaction with dinitrophenylhydrazone and there is no significant difference between the strains. Finally, to confirm the cellular localization of the protein Ndt1, spheroplasts of S. cerevisiae were subjected to confocal microscopy, which evidenced the co-location of Ndt1 protein with mitochondria in S. cerevisiae strain transformed with the construction pYES/ndt1. This same profile was not observed in strain ?ndt1?ndt2.

O excesso de adenina na dieta (ADE) promove precipitação intratubular de cristais, levando à instalação de uma nefrite intersticial progressiva e perda da função renal. Observações recentes indicam que a sobrecarga de ADE em camundongos em que os genes para TLR-2, -4, MyD88, ASC ou caspase-1 foram inativados provoca menos dano renal do que quando administrado a camundongos selvagens, sugerindo a existência de um papel patogênico para a ativação de TLRs e a montagem de inflamassomas nesse modelo. O presente estudo foi concebido para investigar se outro importante componente da imunidade inata, o sistema NF-B, também exerce papel patogênico na nefropatia associada ao excesso de ADE. Ratos Munich-Wistar machos e adultos foram divididos em 3 grupos: C (N=17), ração padrão; ADE (N=17), ADE na ração, 0,7% durante 1 semana e 0,5% durante 2 semanas; ADE+PDTC (N=14), ADE administrada como descrito anteriormente, associada ao inibidor do NF-B, pirrolidina ditiocarbamato (PDTC), 120 mg/kg/dia na água do bebedouro. Após 3 semanas, observou-se deposição de numerosos cristais no tecido renal, em sua maioria no interior de granulomas de corpo estranho, acompanhada de intensa atividade proliferativa tubulointersticial. Uma parte dos cristais apareceu envolvida por uma camada de células aparentemente derivadas do epitélio tubular, que pareciam segregar os precipitados e, em alguns casos, expulsá-los ao interstício. Essas alterações associaram-se a uma grande expansão da área intersticial, com deposição de colágeno, além de hipotrofia glomerular. Foi possível ainda demonstrar um aumento da expressão da interleucina-6, do interferon-, da proteína específica de fibroblastos (FSP-1) e da proteína quimiotática para macrófagos (MCP-1). A abundância do IKK-, uma quinase ativadora do sistema NK-B, mostrou-se também acentuadamente elevada nesses ratos. O tratamento com PDTC normalizou a expressão do IKK-, diminuindo o número de granulomas e a proliferação celular, além de atenuar fortemente a fibrose e o declínio da função renal. Esses achados, que contribuem para elucidar os mecanismos de formação de granulomas no modelo de sobrecarga de adenina, são consistentes com o conceito de que o sistema NF-B é ativado pela precipitação intratubular de cristais e contribui, juntamente com outros mecanismos ligados à imunidade inata, para iniciar a intensa resposta inflamatória associada a esse modelo. Descritores: 1.Insuficiência renal crônica 2.Adenina 3.Imunidade inata 4.NF-kappa B 5.GranulomaO excesso de adenina na dieta (ADE) promove precipitação intratubular de cristais, levando à instalação de uma nefrite intersticial progressiva e perda da função renal. Observações recentes indicam que a sobrecarga de ADE em camundongos em que os genes para TLR-2, -4, MyD88, ASC ou caspase-1 foram inativados provoca menos dano renal do que quando administrado a camundongos selvagens, sugerindo a existência de um papel patogênico para a ativação de TLRs e a montagem de inflamassomas nesse modelo. O presente estudo foi concebido para investigar se outro importante componente da imunidade inata, o sistema NF-B, também exerce papel patogênico na nefropatia associada ao excesso de ADE. Ratos Munich-Wistar machos e adultos foram divididos em 3 grupos: C (N=17), ração padrão; ADE (N=17), ADE na ração, 0,7% durante 1 semana e 0,5% durante 2 semanas; ADE+PDTC (N=14), ADE administrada como descrito anteriormente, associada ao inibidor do NF-B, pirrolidina ditiocarbamato (PDTC), 120 mg/kg/dia na água do bebedouro. Após 3 semanas, observou-se deposição de numerosos cristais no tecido renal, em sua maioria no interior de granulomas de corpo estranho, acompanhada de intensa atividade proliferativa tubulointersticial. Uma parte dos cristais apareceu envolvida por uma camada de células aparentemente derivadas do epitélio tubular, que pareciam segregar os precipitados e, em alguns casos, expulsá-los ao interstício. Essas alterações associaram-se a uma grande expansão da área intersticial, com deposição de colágeno, além de hipotrofia glomerular. Foi possível ainda demonstrar um aumento da expressão da interleucina-6, do interferon-, da proteína específica de fibroblastos (FSP-1) e da proteína quimiotática para macrófagos (MCP-1). A abundância do IKK-, uma quinase ativadora do sistema NK-B, mostrou-se também acentuadamente elevada nesses ratos. O tratamento com PDTC normalizou a expressão do IKK-, diminuindo o número de granulomas e a proliferação celular, além de atenuar fortemente a fibrose e o declínio da função renal. Esses achados, que contribuem para elucidar os mecanismos de formação de granulomas no modelo de sobrecarga de adenina, são consistentes com o conceito de que o sistema NF-B é ativado pela precipitação intratubular de cristais e contribui, juntamente com outros mecanismos ligados à imunidade inata, para iniciar a intensa resposta inflamatória associada a esse modelo / Excessive dietary adenine (ADE) promotes intratubular precipitation of crystals, leading to the installation of progressive interstitial nephritis and renal function loss. Recent observations indicate that ADE overload in mice in which genes for TLR-2, -4, MyD88, ASC or caspase-1 were inactivated causes less renal damage than when administered to wild-type mice, suggesting the existence of a pathogenic role for the activation of TLRs and the assembly of inflamassomes in this model. The present study was designed to investigate whether another important component of innate immunity, the NF-B system, also plays a role in the pathogenesis of the nephropathy associated with excess ADE. Adult Male Munich-Wistar rats were distributed among three groups: C (n = 17), receiving standard diet; ADE (N = 17), given ADE in the diet at 0.7% for 1 week and 0.5% for 2 weeks; and ADE + PDTC (N = 14), receiving ADE as described above, associated with the NF-B inhibitor, pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), 120 mg/kg/ day in drinking water. After three weeks, there was widespread deposition of crystals in the renal tissue, mostly within granulomas, accompanied by florid tubulointerstitial proliferative activity. Part of these crystals was enclosed in a layer of cells apparently derived from the tubular epithelium, which appeared to segregate the precipitates, and in some cases, to extrude them to the interstitium. These changes were associated with marked interstitial expansion, collagen deposition, and glomerular hypotrophy. Increased expression of interleukin-6, interferon-, fibroblast specific protein (FSP-1) and macrophage chemoattractant protein (MCP-1) were also shown. The abundance of IKK-, a kinase that activates the NF-B system, was also markedly elevated in these mice. Treatment with PDTC normalized the expression of IKK-, reducing the number of granulomas and cell proliferation, and strongly attenuated interstitial fibrosis and the decline of renal function. These findings, which contribute to illuminate some mechanisms of granuloma formation in the ADE overload model, are consistent with the concept that the NF-B system is activated by intratubular precipitation of crystals and contributes, along with other mechanisms related to innate immunity, to initiate the intense inflammatory response associated with this model

A oxidação do resíduo de cisteína 56 (ANT-cys56) do transportador de nucleotídeos de adenina (ANT) é descrita como evento crítico da Transição de Permeabilidade Mitocondrial (TPM), fenômeno caracterizado pela sensibilidade ao fármaco imunossupressor ciclosporina A (CsA), responsável pela ligação e inibição do componente promotor da abertura do Poro de Transição de Permeabilidade (PTP), a enzima peptidil-prolil-cis trans isomerase (cyp D). Aspectos bioquímico-estruturais do ANT, das cardiolipinas (CDL) que envolvem o transportador e da cyp D na TPM foram avaliados por meio de ensaios turbidimétricos de inchamento mitocondrial e estado conformacional do ANT em mitocôndrias isoladas de fígado de rato, associados a abordagens de química computacional para análises de campos de interação molecular (MIF) e dinâmica molecular (MD), visando a predição de eventos envolvidos na abertura do PTP. As análises computacionais revelaram aumento da mobilidade relativa do ANT-cys56, como resultado da interação preferencial do Ca2+ com a molécula de CDL ligada à hélice 4 do transportador, enquanto que a inversão da configuração do resíduo de prolina do ANT (ANT-pro61) potencializou o efeito induzido por Ca2+. A presença de ADP no interior do ANT preveniu o aumento da mobilidade relativa do ANT-cys56 promovida pelo Ca2+, enquanto que a inversão da configuração do ANT-pro61, de trans para cis, potencializou o efeito promovido pelo Ca2+ na mobilidade relativa do ANT-cys56, de forma insensível ao nucleotídeo. Os ensaios com mitocôndrias isoladas demonstraram que o Ca2+ induz a conformação c do ANT e promove abertura do PTP, de forma sensível à CsA e ADP. A presença de cyp D estabilizou a conformação c do ANT induzida por Ca2+, sendo que Atractilosídeo (ATR) tornou o efeito parcialmente insensível aos inibidores da TPM. Os resultados sugerem que a abertura do PTP induzida por Ca2+ envolve a mudança conformacional do ANT para o estado c, cuja estabilização é obtida pela cyp D na função de inversão do ANT-pro61, com base na avaliação da mobilidade relativa do ANT-cys56 parcialmente sensível ao ADP. / Oxidation of the Adenine Nucleotide Translocase (ANT) cysteine residue 56 (ANT-cys56) is potentially involved in Ca2+-induced Mitochondrial Permeability Transition (MPT), a process which is prevented by cyclosporine A (CsA), due to its inhibition of Permeability Transition Pore (PTP) opener component, the peptidyl-prolyl cis-trans isomerase cyclophylin D (cyp D). The main aspects of ANT, cardiolipins (CDL) and cyp D on Ca2+-induced PTP opening were addressed by employing light scattering techniques in isolated rat liver mitochondria to assess both ANT conformational change and mitochondrial swelling in association with computational chemistry analysis of Molecular Interaction Fields (MIF) and Molecular Dynamics (MD) for PTP events predictions. Computational analysis revealed that Ca2+ interacts preferentially with the ANT surrounding CDL bound to the H4 helix of the carrier and weakens the CDL/ANT interactions accounting for the ADP-sensitive increase of ANT-cys56 relative mobility while ANT-pro61 cis to trans configuration inversion intensified the Ca2+ effect in a ADP-insensitive way. The ANT conformation and mitochondrial swelling analyses demonstrated that Ca2+ induces conformation c of ANT and opens PTP in a CsA- and ADP-sensitive way. Cyp D stabilizes Ca2+-induced ANT conformation c, whereas ATR renders a PTP opening less sensitive to the inhibition by CsA or ADP. The results suggest that Ca2+-induced PTP opening involves ANT conformation c change supported by a cyp D-induced trans to cys ANT-pro61 configuration inversion based on the relative mobility of ANT-cys56, in a ADP-sensitive manner.

O excesso de adenina na dieta (ADE) promove precipitação intrabular de cristais, levando a uma nefrite intersticial progressiva com perda de função renal. Estudo recente demonstrou que esse processo requer ativação do sistema NF-kB. No presente estudo investigamos o possível envolvimento de outros componentes da imunidade inata, além do NF-kB. Verificamos também a hipótese de que a nefropatia associada aos cristais continua a progredir mesmo depois de cessada a sobrecarga de adenina. Foram estudados ratos Munich-Wistar machos e adultos sem tratamento (C) ou recebendo 0.5% de ADE na dieta. Após 1 semana, a ADE foi removida da dieta e os animais foram seguidos por 4 ou 24 semanas. A administração de ADE por 1 semana promoveu uma inflamação intersticial aguda, com perda de função renal, alteração da pressão caudal, sem alterações glomerulares. Os mediadores da imunidade inata, como TLR2, TLR4, inflamassoma NLRP3, IL1beta e IL-6, apresentaram-se ativados sem, no entanto, ativar o sistema NF-kB. Após cessada a sobrecarga de ADE, a inflamação persistiu, com infiltração por macrófagos, expressão elevada de AngII, deposição progressiva de colágeno e, na fase mais tardia, glomeruloesclerose, caracterizando um processo inflamatório crônico, autônomo, que não contou com a participação do eixo NLR/IL1beta. Em contraste, o sistema NF-kB foi ativado, sendo um dos possíveis estímulos a produção intra-renal de AngII. Dois mecanismos patogênicos podem ser identificados neste estudo: 1) agudo, associado à ativação do eixo NLR-IL1beta; 2) crônico, associado à produção de AngII renal e à ativação do sistema NF-kB / Excess adenine in the diet (ADE) promotes intratubular crystal precipitation, leading to progressive interstitial nephritis and loss of renal function. A recent study has shown that this process requires activation of the NF-kB system. In the present study we investigated the possible involvement of other components of innate immunity, in addition to NF-kB, as well as whether nephropathy associated with excess adenine continues to progress even after dietary cessation. Male Munich-Wistar rats without treatment (C) or receiving 0.5% of ADE in the diet were studied. After 1 week, ADE was removed from the diet and the animals were followed for 4 or 24 weeks. Administration of ADE for 1 week promote acute interstitial inflammation, with loss of renal function, alteration of caudal pressure, without glomerular changes. Mediators of innate immunity, such as TLR2, TLR4, NLRP3 inflamassome, IL1beta and IL-6 , were shown to be activated, with no apparent activation of the NF-kB system. In the late phases of the model, the inflammation persisted, with significant infiltration by macrophages, high expression of AngII, progressive collagen deposition and glomerulosclerosis, characterizing a chronic, autonomic inflammatory process that did not involve the participation of the NLR/IL1beta axis. By contrast, the NF-kB system was activated, with intra-renal AngII production as a possible stimulus. Two mechanisms operated this study: 1) an acute one, associated with activation of the NLR-IL1beta axis; 2) a chronic one, associated with intrarenal AngII production and NF-kB activation

Diferentes estratégias têm sido propostas a fim de melhorar o desempenho dos bioeletrodos utilizados nas biocélulas a combustíveis e nos biossensores. Por examplo, a funcionalização de eletrodos de carbono tem sido feita para esse fim. Neste estudo, propomos o desenvolvimento de fibras flexíveis de carbono (FFCs) funcionalizadas com grupos quinona e modificados com álcool desidrogenase (ADH) NAD-dependente para obter bioeletrodos para uma bio-eletrocatálise eficiente de etanol. Grupos quinona na superfície das FFCs foram obtidas utilizando o tratamento oxidativo com permanganato e também pelo ancoramento eletroquímico de antraquinona: ambas metodologias resultaram em bioeletrodos para a eletro-oxidação de NADH que pode aumentar a bio-eletrocatálise do etanol. De acordo dados espectroscópicos, microscópicos, e eletroquímicos, defeitos contendo grupos C=O nos eletrodos de FFCs são atribuídos à melhora na oxidação do NADH, aumentando a bio-eletrocatálise do etanol. Para se investigar o papel dos grupos quinona na eletro-oxidação do NADH, propomos uma configuração experimental baseado na espectroscopia de ressonância paramagnética de elétrons em modo operando (operando EPR). Com essa técnica, fomos capaz de mostrar a correlação entre o número de elétrons livres desemparelhados, a concentração superficial de quinonas e a oxidação do NADH com controle eletroquímico. Correlação para a concentração de spins revela um aumento no número de elétrons desemparelhados livres com o aumento do sobrepotencial aplicado e a oxidação do NADH, o que corrabora com a hipótese de que grupos quinona podem afetar a eletrocatálise rumo à oxidação do NADH a NAD+. É vislumbrado que operando EPR pode fornecer infromação útil para provar a dinâmica da transferência de elétrons em superfície de carbono e possa ser extendida a outros sistemas bioeletroquímicos. / There are several strategies to improve the performance of bioelectrodes applied in biosensors and biofuel cells. For instance, surface functionalization of the carbon-based electrodes has been used to this intend. Herein, we propose the development of flexible carbon fibers (FCFs) functionalized with quinone groups and modified with NAD-dependent alcohol dehydrogenase (ADH) to obtain bioelectrodes for efficient ethanol bio-electrocatalysis. Quinones groups on FCFs surfaces were obtained by using oxidative treatment with permanganate, and also by electrochemical grafting of anthraquinone: both these methodologies result in bioelectrodes for the electro-oxidation of NADH that can improve the ethanol bio-electrocatalysis. Based on spectroscopic, microscopic and electrochemical data, defects containing C=O groups on FCFs electrodes are attributed to improve the NADH oxidation, enhancing the ethanol bio-electrocatalysis. In order to investigate the role of quinone groups on the NADH electro-oxidation, we propose an experimental setup based on operando electron paramagnetic resonance spectroscopy (operando EPR). With this technique, we are able to show a correlation among the number of free unpaired electrons, surface concentration of quinones and NADH oxidation under electrochemical control. Correlation for the spin concentration reveals an increasing number of free unpaired electrons with increasing applied overpotential and NADH oxidation, which corroborates the hypothesis that quinone groups can act as electrocatalysts towards the oxidation of NADH to NAD+. It is glimpsed that operando EPR can provide useful information in probing the electron transfer dynamics on a carbon surface and may be extended to others bioelectrochemical systems.