The aim of this work was to characterise the influence of adenosine on imaginal disc cell line Cl8+ of Drosophila. I prepared stable cell lines with the overexpression or RNA interference of genes coding adenosine receptor AdoR (CG9753) and adenosine transporter DmENT2 (CG11045) in D. melanogaster. These cell lines were subsequently used to test their response to extracellular adenosine signal by the measurement of cell viability and level of second messengers cAMP and Ca2+ in Cl8+ cells.

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Les nucléotides et nucléosides sont des molécules essentielles à la vie. Outre leurs fonctions intracellulaires, ils jouent un rôle dans la communication intercellulaire. Les nucléotides et nucléosides sont libérés dans l’espace extracellulaire par différents mécanismes et ensuite rapidement métabolisés par des ecto-nucléotidases. Ils exercent leurs effets paracrines et/ou autocrines en activant des récepteurs présents à la surface membranaire des cellules. Les récepteurs P1, au nombre de quatre (A1, A2A, A2B et A3), sont activés par l’adénosine. Les récepteurs P2X1-7 ont une activité intrinsèque de canal ionique et sont essentiellement activés par l’ATP. Les récepteurs P2Y possèdent sept domaines transmembranaires et sont couplés à des protéines G. A ce jour huit sous-types ont été identifiés : P2Y1,2,4,6,11,12,13,14. Ces récepteurs sont activés par des nucléotides adényliques (ATP et ADP) et/ou uridyliques (UTP, UDP et UDP-glucose). Les récepteurs P1 et P2 modulent l’activité de multiples processus biologiques : système immunitaire (A2A, P2X7, P2Y11,…), agrégation plaquettaire (P2Y1, P2Y12, P2X1), tonus vasculaire, angiogenèse,… Notre laboratoire a identifié et caractérisé plusieurs récepteurs P2Y : P2Y4, P2Y6, P2Y11 et P2Y13. Ce dernier est activé par l’ADP et est couplé à une protéine Gi. L’abondance du transcrit P2Y13 murin est caractérisée par l’ordre suivant : rate >> pancréas > foie = cerveau. Afin de déterminer son rôle physiologique, nous avons généré une lignée de souris invalidées pour le récepteur P2Y13. Après avoir validé l’inactivation du gène P2Y13 dans ces souris, nous avons analysé leur phénotype. Les souris P2Y13-/- ne présentent pas d’anomalie évidente : elles sont viables, fertiles et se développent normalement. Etant donné le profil d’expression de ce récepteur, nous avons analysé leur système immunitaire, en particulier les cellules dendritiques (DC). In vivo, l’invalidation du récepteur P2Y13 ne semble pas avoir d’impact sur les réponses inflammatoires (choc septique, infiltration de neutrophiles, test à la formaline) et auto-immunes (uvéorétinite expérimentale). In vitro, nous avons montré que l’ADPβS induit une mobilisation de calcium cytoplasmique dans les DC spléniques et qu’il stimule l’endocytose d’antigènes par celles-ci. L’utilisation de DC transgéniques a permis d’exclure l’implication du récepteur P2Y13 et a montré que ces effets sont médiés par le récepteur P2Y12 qui est également activé par l’ADPβS. Ces observations suggèrent qu’il serait intéressant d’analyser le système immunitaire des souris P2Y12-/-, en particulier les réponses immunes dépendantes des DC. D’autre part, ce travail a débouché sur la mise en évidence d’un effet anti-inflammatoire médié par le récepteur de l’adénosine A2B dans les DC dérivées de la moelle osseuse. Enfin, nous avons récemment mis en évidence un rôle potentiel du récepteur P2Y13 dans le métabolisme des glucides et des lipides. Nous avons observé que les souris P2Y13-/- produisent plus d’insuline en réponse à une injection de glucose que les souris contrôles tandis que leur glycémie ne semble pas altérée. De plus, les souris P2Y13-/- sous régime riche en graisses reproduisent 3 caractéristiques du syndrome métabolique chez l'homme : surpoids, dyslipidémie (augmentation des triglycérides et du non HDL-cholestérol) et hyperinsulinémie. Notre travail de thèse débouche donc sur deux conclusions et une perspective : • l’adénosine exerce une action anti-inflammatoire sur les cellules dendritiques dérivées de moelle osseuse via l’activation du récepteur A2B ; • le récepteur P2Y12 est exprimé fonctionnellement dans les cellules dendritiques murines et stimule l’endocytose ; • le récepteur P2Y13 pourrait jouer un rôle important dans le contrôle du métabolisme des lipides et des glucides ainsi que du poids corporel, suggérant que des agonistes spécifiques de ce récepteur pourraient permettre de contrecarrer l’obésité et ses conséquences métaboliques néfastes.

Animal models are crucial to improve the knowledge of the mechanisms underlying the different pathological processes. These models are also excellent tools to facilitate the research of new targets for the treatment of different diseases and to evaluate the benefit/risk ratio of the potential new treatments. We have focussed this research work in the study of a new potential targets for pain, cognitive and eating disorders using new animal models developed in our laboratory. We first investigated the effects of the interaction between cannabinoids and nicotine on cognitive processes and metabolism using different behavioural models and new experimental devices. In a second part of this work, we investigated new therapeutic targets for neuropathic pain and for this purpose we developed a new behavioural model to improve the study of the therapeutic potential and possible side-effects of novel compounds. / Los modelos animales son cruciales para mejorar el conocimiento sobre los mecanismos que constituyen la base de los diversos procesos patológicos. Estos modelos representan también excelentes herramientas para facilitar la investigación de nuevas dianas para el tratamiento de estas enfermedades y para evaluar el cociente beneficio/riesgo de los nuevos tratamientos potenciales. Este trabajo de investigación se encuentra centrado en el estudio de nuevos dianas terapéuticas para el dolor, los procesos cognitivos y los desórdenes alimentarios utilizando nuevos modelos animales desarrollados en nuestro laboratorio. En primer lugar, hemos investigado los efectos de la interacción entre los cannabinoinoides y la nicotina a nivel los procesos cognitivos y del metabolismo usando diversos modelos comportamentales y nuevos dispositivos experimentales. En una segunda parte de este trabajo, hemos estudiado nuevas dianas terapéuticas para el dolor neuropático y hemos desarrollado para este propósito un nuevo modelo comportamental que permite evaluar el potencial terapéutico y los posibles efectos secundarios de nuevos compuestos.

This study investigated the role of opioid, adenosine, bradykinin, and calcitonin-gene related peptide (CGRP) receptors, and potential ‘cross-talk’ among suspected G-protein coupled receptors in a humoral model of remote ischemic preconditioning (rIPC) cardioprotection. Compared to Control dialysate (from non-preconditioned donor rabbit blood), rIPC dialysate (from remotely preconditioned blood) reduced cell death in rabbit cardiomyocytes following simulated ischemia and reperfusion. Non-selective, δ-, or κ-opioid receptor blockade and non-selective adenosine receptor blockade abolished rIPC dialysate protection; whereas, bradykinin B2 and CGRP receptor blockade had no effect. Non-selective adenosine receptor blockade fully and partially abolished protection by κ- and δ-opioid receptors, respectively. Multiple reaction monitoring mass spectrometry detected low levels of adenosine, and other preconditioning substances, in the dialysate. An increase in extracellular adenosine was not detected during opioid-induced preconditioning to explain this cross-talk. These results suggest that δ-opioid, κ-opioid, adenosine receptors, and opioid-adenosine cross-talk are involved in rIPC of freshly isolated cardiomyocytes.

This study investigated the role of opioid, adenosine, bradykinin, and calcitonin-gene related peptide (CGRP) receptors, and potential ‘cross-talk’ among suspected G-protein coupled receptors in a humoral model of remote ischemic preconditioning (rIPC) cardioprotection. Compared to Control dialysate (from non-preconditioned donor rabbit blood), rIPC dialysate (from remotely preconditioned blood) reduced cell death in rabbit cardiomyocytes following simulated ischemia and reperfusion. Non-selective, δ-, or κ-opioid receptor blockade and non-selective adenosine receptor blockade abolished rIPC dialysate protection; whereas, bradykinin B2 and CGRP receptor blockade had no effect. Non-selective adenosine receptor blockade fully and partially abolished protection by κ- and δ-opioid receptors, respectively. Multiple reaction monitoring mass spectrometry detected low levels of adenosine, and other preconditioning substances, in the dialysate. An increase in extracellular adenosine was not detected during opioid-induced preconditioning to explain this cross-talk. These results suggest that δ-opioid, κ-opioid, adenosine receptors, and opioid-adenosine cross-talk are involved in rIPC of freshly isolated cardiomyocytes.

L’adénosine (ADO) est un nucléoside ubiquitaire issu de l’ATP et du cycle de la méthionine. Via les récepteurs A1 (A1R), elle favorise la fibrillation atriale (FA). Via les récepteurs A2A (A2AR), elle induit une dilatation coronaire. L’ADO est donc un intermédiaire métabolique et un neurotransmetteur du système cardiovasculaire.La 1ère étude montre que, chez les patients coronariens, l’ADO est corrélée à l’homocystéine (Hcy) et l’uricémie. De plus, l’ADO et l’Hcy sont corrélées au score évaluant l’étendue de l’athérosclérose (score SYNTAX). Enfin, sur un modèle d’hépatocyte, l’ADO induit la production d’Hcy selon un effet dose et un effet temps. L’hyperadénosinémie semble ainsi participer à l’augmentation de l’homocystéinémie et de l’uricémie. Ces données apportent un nouvel éclairage sur la physiopathologie de la maladie coronarienne.Dans le 2nd travail, l’ADO augmente significativement uniquement chez les patients coronariens à test d’effort positif. De plus, leur expression des A2AR est plus faible que les patients à test négatif. Ainsi, la faible expression A2AR chez les coronariens à test d’effort positif participe au défaut d’adaptation coronaire durant le test. Un faible niveau d’A2AR pourrait être alors un biomarqueur de coronaropathie.Dans la 3ème étude, les patients avec FA sans cardiopathie sous-jacente ont une adénosinémie normale et une surexpression des A2AR. Sachant que l’ADO peut favoriser la FA, la surexpression des A2AR pourrait donc participer au déclenchement de FA en augmentant la sensibilité à l’adénosine.En conclusion, les médicaments modulant le système adénosinergique pourraient être utiles au traitement de la coronaropathie ou de la FA. / Adenosine (ADO) is an ubiquitous nucleoside that comes from ATP and from the methionine cycle. Via A1 receptors (A1R), it promotes atrial fibrillation (AF). Via A2A receptors (A2AR), it leads to coronary vasodilatation. Thus, adenosine is a metabolic intermediate and a neurotransmitter of the cardiovascular system.The first study showed that adenosine plasma level (APL) is correlated with homocystein (Hcy) and uric acid in coronary artery disease (CAD) patients. Furthermore, APL and Hcy are correlated with the SYNTAX score which evaluate CAD severity. Finally, in cellulo, ADO induced a dose and time dependant increase of HCY production by human hepatocytes. We concluded that high APL may participate into the high HCY and uric acid levels. These data bring new highlight on the physiopathology of CAD.In the second work, APL increased significantly only in patients with positive exercise stress testing (EST). Furthermore, A2AR expression was lower in positive EST patients compared with those with negative EST. Then, we concluded that the low expression of A2AR in CAD patients with positive EST, participates in the lack of adaptive response (coronary vasodilatation) to the EST. This result suggests that low A2AR expression may be a biological marker of CAD.In the third study, patients with AF and no structural heart disease have a normal APL but an increase in A2AR expression. Because adenosine promotes AF, we concluded that high A2AR expression may participate into the triggering of AF by increasing the sensitivity to adenosine.In conclusion, drugs that modulate the purinergic system should be useful tools for the treatment of CAD or AF.

Biochemical processes all involve associations and dissociations of chemical entities. Understanding these is of substantial importance for many modern pharmaceutical applications. In this thesis, longstanding problems with regard to ligand binding are treated with computational methods, applied to proteins of key pharmaceutical importance. Homology modeling, docking, molecular dynamics simulations and free-energy calculations are used here for quantitative characterization of ligand binding to proteins. By combining computational tools, valuable contributions have been made for pharmaceutically relevant areas: a neglected tropical disease, an ion channel anti-drug-target, and GPCR drug-targets. We report three compounds inhibiting cruzain, the main cysteine protease of the protozoa causing Chagas’ disease. The compounds were found through an extensive virtual screening study and validated with experimental enzymatic assays. The compounds inhibit the enzyme in the μM-range and are therefore valuable in further lead optimization studies. A high-resolution crystal structure of the BRICHOS domain is reported, together with molecular dynamics simulations and hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry studies. This work revealed a plausible mechanism for how the chaperone activity of the domain may operate. Rationalization of structure-activity relationships for a set of analogous blockers of the hERG potassium channel is given. A homology model of the ion channel was used for docking compounds and molecular dynamics simulations together with the linear interaction energy method employed for calculating the binding free-energies. The three-dimensional coordinates of two GPCRs, 5HT1B and 5HT2B, were derived from homology modeling and evaluated in the GPCR Dock 2013 assessment. Our models were in good correlation with the experimental structures and all of them placed among the top quarter of all models assessed.  Finally, a computational method, based on molecular dynamics free-energy calculations, for performing alanine scanning was validated with the A2A adenosine receptor bound to either agonist or antagonist. The calculated binding free-energies were found to be in good agreement with experimental data and the method was subsequently extended to non-alanine mutations. With extensive experimental mutation data, this scheme is a valuable tool for quantitative understanding of ligand binding and can ultimately be used for structure-based drug design.

Les nucléotides et nucléosides sont des molécules essentielles à la vie. Outre leurs fonctions intracellulaires, ils jouent un rôle dans la communication intercellulaire. Les nucléotides et nucléosides sont libérés dans l’espace extracellulaire par différents mécanismes et ensuite rapidement métabolisés par des ecto-nucléotidases. Ils exercent leurs effets paracrines et/ou autocrines en activant des récepteurs présents à la surface membranaire des cellules. Les récepteurs P1, au nombre de quatre (A1, A2A, A2B et A3), sont activés par l’adénosine. Les récepteurs P2X1-7 ont une activité intrinsèque de canal ionique et sont essentiellement activés par l’ATP. Les récepteurs P2Y possèdent sept domaines transmembranaires et sont couplés à des protéines G. A ce jour huit sous-types ont été identifiés :P2Y1,2,4,6,11,12,13,14. Ces récepteurs sont activés par des nucléotides adényliques (ATP et ADP) et/ou uridyliques (UTP, UDP et UDP-glucose). Les récepteurs P1 et P2 modulent l’activité de multiples processus biologiques :système immunitaire (A2A, P2X7, P2Y11,…), agrégation plaquettaire (P2Y1, P2Y12, P2X1), tonus vasculaire, angiogenèse,…<p><p>Notre laboratoire a identifié et caractérisé plusieurs récepteurs P2Y :P2Y4, P2Y6, P2Y11 et P2Y13. Ce dernier est activé par l’ADP et est couplé à une protéine Gi. L’abondance du transcrit P2Y13 murin est caractérisée par l’ordre suivant :rate >> pancréas > foie = cerveau. Afin de déterminer son rôle physiologique, nous avons généré une lignée de souris invalidées pour le récepteur P2Y13. Après avoir validé l’inactivation du gène P2Y13 dans ces souris, nous avons analysé leur phénotype. Les souris P2Y13-/- ne présentent pas d’anomalie évidente :elles sont viables, fertiles et se développent normalement. Etant donné le profil d’expression de ce récepteur, nous avons analysé leur système immunitaire, en particulier les cellules dendritiques (DC). <p>In vivo, l’invalidation du récepteur P2Y13 ne semble pas avoir d’impact sur les réponses inflammatoires (choc septique, infiltration de neutrophiles, test à la formaline) et auto-immunes (uvéorétinite expérimentale). In vitro, nous avons montré que l’ADPβS induit une mobilisation de calcium cytoplasmique dans les DC spléniques et qu’il stimule l’endocytose d’antigènes par celles-ci. L’utilisation de DC transgéniques a permis d’exclure l’implication du récepteur P2Y13 et a montré que ces effets sont médiés par le récepteur P2Y12 qui est également activé par l’ADPβS. Ces observations suggèrent qu’il serait intéressant d’analyser le système immunitaire des souris P2Y12-/-, en particulier les réponses immunes dépendantes des DC. D’autre part, ce travail a débouché sur la mise en évidence d’un effet anti-inflammatoire médié par le récepteur de l’adénosine A2B dans les DC dérivées de la moelle osseuse. Enfin, nous avons récemment mis en évidence un rôle potentiel du récepteur P2Y13 dans le métabolisme des glucides et des lipides. Nous avons observé que les souris P2Y13-/- produisent plus d’insuline en réponse à une injection de glucose que les souris contrôles tandis que leur glycémie ne semble pas altérée. De plus, les souris P2Y13-/- sous régime riche en graisses reproduisent 3 caractéristiques du syndrome métabolique chez l'homme :surpoids, dyslipidémie (augmentation des triglycérides et du non HDL-cholestérol) et hyperinsulinémie.<p><p>Notre travail de thèse débouche donc sur deux conclusions et une perspective :<p>•\ / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished