Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2016-2017. / L’accumulation excessive de gras viscéral est un marqueur majeur des altérations cardiométaboliques associées à l’obésité, telles que les dyslipidémies, la résistance à l’insuline et l’inflammation chronique de faible intensité. À l’inverse, pour un même niveau d’adiposité, l’accumulation préférentielle de tissu sous-cutané semble conférer un effet neutre, voire protecteur. Plusieurs mécanismes peuvent contribuer à l’apparition de l’obésité viscérale et à sa relation avec les facteurs de risque cardiométabolique. L’objectif général de ce mémoire est d’examiner la contribution de l’alimentation et de la morphologie des adipocytes à la physiopathologie de l’obésité viscérale chez l’humain. Pour atteindre cet objectif, nous avons d’abord effectué une revue de la littérature sur la modulation de la distribution des graisses par les composants nutritionnels. Cette étude a révélé que l’effet des nutriments sur la distribution des graisses survenait en grande partie via son effet sur la masse grasse totale. Nous avons ensuite réalisé une analyse critique de la littérature sur l’hypertrophie adipocytaire comme un marqueur de la dysfonction du tissu adipeux. Cette étude a confirmé que la taille adipocytaire des dépôts sous-cutané et viscéral est un excellent prédicteur des altérations du profil lipidique et de l’homéostasie du glucose et de l’insuline, indépendamment des mesures d’adiposité totale. Nous avons également constaté que chaque technique de mesure de la taille adipocytaire générait des résultats variables, et ce, sur tout l’intervalle des valeurs d’indice de masse corporelle. Enfin, dans une étude originale visant à comparer trois techniques de mesure de la taille adipocytaire, nous avons démontré que le choix d’une technique n’influençait pas de manière prononcée les associations entre la taille adipocytaire et les facteurs de risque cardiométabolique ainsi que les associations avec les différentes mesures d’adiposité, régionales ou totales. En conclusion, l’hypertrophie de l’adipocyte viscéral humain est une mesure importante dans l’évaluation du risque associé à l’obésité. / Excess accumulation of visceral fat is a major marker of the cardiometabolic alterations associated with obesity such as dyslipidemia, insulin resistance and chronic low-grade inflammation. Conversely, for the same level of adiposity, preferential accumulation of subcutaneous adipose tissue has a neutral or protective effect. Several factors may contribute to the development of visceral adiposity and its relationship with cardiometabolic risk factors. The general objective of this master thesis is to examine the contribution of diet and the morphology of adipocytes in the pathophysiology of visceral obesity in humans. To achieve this goal, we first conducted a literature analysis on the modulation of fat distribution by nutritional components. This analysis revealed that the effect of nutrients on body fat distribution was mediated in large part by its effect on total fat accumulation. Second, we conducted a critical review of the literature on adipocyte hypertrophy as a marker of adipose tissue dysfunction. This study confirmed that adipocyte size of both subcutaneous and visceral depots is a strong predictor of alterations in the lipid profile and in glucose-insulin homeostasis, independently of adiposity. We also found that each of the measurement techniques for fat cell sizing generated variable results on the entire range of body mass index values. Third, in an original study aimed at comparing three measurement methods for cell sizing, we reported that the choice of technique had little impact on the associations between adipocyte size and cardiometabolic risk factors as well as the various adiposity indices, regional or total. In conclusion, human visceral adipocyte hypertrophy is an important measure to evaluate the risk associated with obesity.

L'obésité est une maladie chronique complexe qui augmente le risque de complications cardio-métaboliques. Parmi les altérations qui lui sont associées, on retrouve la détérioration du profil lipidique-lipoprotéique, la résistance à l'insuline, le syndrome métabolique et les maladies cardiovasculaires. Au cœur de l'obésité se trouve le tissu adipeux, un organe de stockage et de mobilisation des lipides également doté d'une fonction sécrétoire. L'adiposopathie, caractérisée entre autres par une dysfonction sécrétoire du tissu adipeux, est couramment observée dans l'obésité. Le rapport plasmatique de deux hormones sécrétées par le tissu adipeux , l'adiponectine et la leptine, est souvent utilisé afin d'évaluer la fonction sécrétoire de cet organ. Un rapport faible entre ces deux adipokines, ou adiposopathie sécrétoire, s'ajoute à d'autres marqueurs de dysfonctions du TA, comme l'hypertrophie adipocytaire et l'infiltration macrophagique. Dans cette optique, la contribution du rapport adiponectine/leptine au niveau du profil cardio-métabolique et, plus précisément, l'homéostasie du glucose, a été comparée à celle de l'hypertrophie d'adipocytes sous-cutanés abdominaux et omentaux et de l'infiltration macrophagique, chez des femmes d'âge et d'adiposité variables. Les relations entre le rapport plasmatique adiponectine/leptine et le métabolisme des lipides ainsi que l'expression de gènes impliqués dans ce dernier ainsi que le développement du tissu adipeux ont été examinées au niveau des deux dépôts adipeux, chez ce même groupe de femmes. La combinaison d'un faible rapport adiponectine/leptine et de l'hypertrophie adipocytaire était observée chez les patientes ayant les niveaux les plus élevés de résistance à l'insuline. Par ailleurs, un faible rapport adiponectine/leptine était également associé à une réponse lipolytique plus importante, tant au niveau des adipocytes sous-cutanés abdominaux qu'omentaux. Ainsi, le rapport adiponectine/leptine est un marqueur important des dysfonctions du tissu adipeux et du risque cardio-métabolique associé, chez des femmes d'âge et d'adiposité variable. / Obesity is a complex chronic disease which increases the risk of cardiometabolic complications. Alterations associated with this disease include the deterioration of the lipid-lipoprotein profile, insulin resistance, metabolic syndrome, and cardiovascular disease. At the heart of obesity is the adipose tissue, a lipid storing and mobilizing organ to which is also attributed a secretory function. Adiposopathy characterized by a secretory dysfunction of adipose tissue is commonly observed in obesity. The plasma ratio of two hormones secreted by the adipose tissue, adiponectin/leptin, is often used as a marker of the secretory health of this organ. Beyond a low ratio between these two adipokines, other adipose tissue dysfunctions such as adipocyte hypertrophy and macrophage infiltration exist. In the context of obesity, the relationships between the plasma adiponectin/leptin ratio and the cardiometabolic profile, and more specifically glucose-insulin homeostasis, was compared to that of hypertrophy of subcutaneous abdominal and omental adipose cells and macrophage infiltration in women of variable age and adiposity. In addition, the association between the plasma adiponectin/leptin ratio and gene expression involved in lipid metabolism and adipose tissue development was examined in the two fat depots, in this same group of women. The combination of a low adiponectin/leptin ratio and adipocyte hypertrophy was observed in patients with the highest levels of insulin resistance. Moreover, a low adiponectin/leptin ratio was associated with a greater lipolytic response, both in subcutaneous abdominal and omental adipocytes. Thus, the adiponectin/leptin ratio is an important marker of adipose tissue dysfunctions and its increased cardiometabolic risk in women of varying age and adiposity.

Par la sécrétion d’adipokines, le tissu adipeux blanc viscéral présent chez des patients souffrant d’obésité promeut l’installation d’altérations métaboliques telles que l’intolérance au glucose, la résistance à l’insuline et le diabète de type 2. Les complications cardiovasculaires, en particulier l’athérosclérose, sont les principales causes de mortalité chez les patients atteints de diabète de type 2. Il a été démontré que la fraction vasculaire stromale du tissu adipeux est composée de cellules régénératives dérivées du tissu adipeux (CRTA) et que ces cellules possèdent des caractéristiques des cellules progénitrices stromales (CPS). L’impact de l’intolérance au glucose et du diabète de type 2 sur les adipocytes sont assez bien documentés. Par contre, les conséquences de ces pathologies sur le comportement des CRTA n’ont pas été mesurées d’une façon approfondie. Plus particulièrement, l’impact de ces altérations métaboliques sur le potentiel de différenciation des CRTA en adipocytes et en cellules endothéliales n’a pas été étudié. Ce projet a pour but d’évaluer, dans un modèle murin, l’effet de ces altérations métaboliques sur l’équilibre de la différenciation in vitro des CRTA en adipocytes ou en cellules endothéliales. L’intolérance au glucose et le diabète de type 2 ont été induit chez les souris par la prise de deux diètes riches en acides gras de provenance végétale (DV) ou animale (DA). L’impact de l’origine des acides gras sur la différenciation des CRTA a également été étudié. Pour ce faire, une mise au point de la culture cellulaire des CRTA s’est avérée nécessaire et compte pour une partie de ces travaux de maîtrise. Nos travaux ont démontré en premier lieu, que le DMSO est un agent qui conserve la viabilité et les propriétés progénitrices des CRTA suite à leur congélation. De plus, parmi les matrices testées, le collagène s’est avéré être celle qui conserve le mieux les caractéristiques des progéniteurs et même, qui enrichie la population cellulaire ensemencée en cellules progénitrices. La densité cellulaire des cellules non-adipeuses du tissu adipeux s’avère être significativement plus élevée chez les souris du groupe de la DV comparativement aux souris contrôles. De plus, l’évaluation in vitro de la différenciation adipogénique démontre un potentiel de différenciation plus important pour les CRTA provenant des souris de la DV par rapport au groupe contrôle et à la DA. Cependant, la différenciation en cellules endothéliales est inhibée chez les CRTA de la DV, comparativement à un retard de ce processus pour la DA. Nos travaux suggèrent que le potentiel de différenciation adipogénique et endothéliale des CRTA est affecté par le statut métabolique des souris ainsi que par la nature de la diète. Ces résultats mettent en lumière pour la première fois l’importance d’évaluer le comportement des CRTA en fonction du statut métabolique du donneur, un paramètre pouvant avoir un impact majeur dans l’utilisation des CRTA autologues en thérapie cellulaire pour la réparation de tissus vasculaires chez des patients diabétiques. / The secretion of a large number of bioactive mediators by adipose tissue in abdominal obesity promotes metabolic diseases such as glucose intolerance, insulin resistance and type 2 diabetes. Cardiovascular complications, in particular atherosclerosis, are the leading causes of mortality in patients with type 2 diabetes. It has been shown that the stromal vascular fraction of adipose tissue comprised adipose-derived regenerative cells (ADRC) and that these cells possess progenitor cells characteristics. Effects of glucose intolerance and type 2 diabetes on adipocytes are well documented. However, consequences of these pathologies on ADRC behaviors are not well understood. Particularly, the impact of these metabolic alterations on the adipogenic and endothelial differentiation potential of ADRC has not been investigated. Aim of this project was to evaluate, in a murine model, the effect of these metabolic alterations on the balance of the in vitro ADRC differentiation into adipocytes or endothelial cells. Glucose intolerance and type 2 diabetes were induced in mice by the intake of two high-fat diets enriched in vegetal (VD) or animal (AD) fat. The impact of the fat origin on the ADRC differentiation was then evaluated. To do this, the development of cellular culture conditions of ADRC was necessary and an important part of this work. Our results suggest that DMSO is an efficient cryoprotective agent that conserves the viability and progenitor properties of ADRC following their freezing. Moreover, among tested scaffolds for the culture of ADRC, collagen is the best matrix to maintain progenitor characteristics and this matrix enriched the cellular population in progenitor cells. The cellular density of non-adipose cells fraction in the adipose tissue was significantly more elevated for VD mice than for the control group. The in vitro evaluation of adipogenic differentiation demonstrated an increase in the differentiation potential for ADRC from VD group compared to AD and control groups. In addition, the endothelial differentiation was abrogated for ADRC from VD group, compared to a delayed one for AD. These results suggest that the adipogenic and endothelial differentiation potential of ADRC and, consequently, the balance between emerging mature cells, are affected by the metabolic status of mice together with the nature of fatty acids. These results highlight, for the first time, the importance to evaluate the ADRC behavior in function to the metabolic status of donor, a parameter that could have an important impact in the use of autologous ADRC in cell-based therapy for the repair of injured vascular tissues in diabetic patients.

Mon travail de thèse a été axé sur l'étude du rôle des lipides musculaires dans la régulation du métabolisme énergétique et la sensibilité à l'insuline. Les lipides sont présents sous deux formes au sein du muscle squelettique : soit sous forme d'adipocytes insérés entre les fibres/faisceaux musculaires, soit sous forme de gouttelettes lipidiques à l'intérieur des fibres musculaires (i.e. triglycérides intramyocellulaires ou IMTG). Ces deux dépôts de lipides, lorsqu'ils sont présents en excès, sont associés à la mise en place de l'insulino-résistance musculaire chez l'homme, via l'accumulation intracellulaire d'espèces lipidiques lipotoxiques altérant la signalisation insulinique pour les IMTG, et par un mécanisme inconnu pour les adipocytes. Dans un premier temps, nous avons isolé et mieux caractérisé, à partir de biopsies musculaires humaines, deux populations de cellules progénitrices. La première population présente un potentiel de différenciation myogénique en culture, il s'agit des cellules satellites (cellules progénitrices musculaires). La deuxième population est composée de cellules capables d'acquérir les propriétés phénotypiques et métaboliques d'adipocytes blancs matures, il s'agit des progéniteurs fibro/adipocytaires (FAPs). Grace à ces modèles d'étude, nous avons mis en évidence que les sécrétions des adipocytes dérivés des FAPs sont capables d'altérer la voie de signalisation et les effets de l'insuline sur des fibres musculaires humaines in vitro. Cet effet paracrine pourrait en partie expliquer la corrélation négative observée entre le contenu en adipocytes intramusculaires et la sensibilité à l'insuline chez l'homme. Dans un second temps, nous avons étudié le rôle de deux protéines, G0/G1 Switch Gene 2 (G0S2) et la périlipine 5 (PLIN5), dans la dynamique des gouttelettes lipidiques ainsi que leur impact sur le métabolisme des lipides et la sensibilité à l'insuline. Nous avons montré in vitro que ces deux protéines jouent un rôle clé dans le contrôle de la lipolyse musculaire (i.e. hydrolyse des IMTG) via l'adipose triglyceride lipase (ATGL, enzyme limitante de la lipolyse musculaire), et que G0S2 et PLIN5 inhibent l'activité de l'ATGL par des mécanismes directs et indirects, respectivement. Par ailleurs, nos données ont montré que l'invalidation de G0S2 et PLIN5 dans le muscle squelettique active la lipolyse, augmente la lipotoxicité et diminue la sensibilité à l'insuline in vivo chez la souris. Nous avons également démontré un rôle important de PLIN5 dans la régulation de l'oxydation des acides gras en ajustant finement leur disponibilité aux besoins énergétiques des cellules. En résumé, ces travaux démontrent d'une part qu'une communication entre adipocytes et fibres au sein du muscle peut entraîner une altération de la sensibilité à l'insuline musculaire chez l'homme, et d'autre part que G0S2 et PLIN5, deux protéines de la gouttelette lipidique, sont au centre du contrôle de l'homéostasie lipidique et du maintien de l'insulino-sensibilité musculaire. Ces données permettent ainsi d'élargir les connaissances existantes sur le lien entre les lipides musculaires et la sensibilité à l'insuline chez l'homme. / My PhD research work was focused on the role of muscle lipids in the regulation of energy metabolism and insulin sensitivity. Lipids can be found under two different forms in skeletal muscle: adipocytes located between muscle fibers/bundles and lipid droplets inside muscle fibers (i.e. intramyocellular triacylglycerols or IMTG). These depots, when present in excess, have both been associated with insulin-resistance in humans, mainly because of intracellular lipotoxic lipid accumulation known to impair insulin signaling for IMTG, and through a yet unknown mechanism for adipocytes. First, we isolated and characterized two distinct populations of progenitor cells from human muscle biopsies. The first population is composed of satellite cells (muscle progenitor cells) and display a myogenic differentiation potential in vitro. The second population is composed of cells that acquire the phenotypic and metabolic properties of functional white adipocytes, called fibro/adipogenic progenitors (FAPs). By using these cell models, we showed that FAPs-derived adipocytes secretions are able to impair insulin signaling and action in human skeletal muscle fibers in vitro. This paracrine effect could explain, at least partly, the inverse relationship observed between intramuscular adipocyte content and insulin sensitivity in humans. Secondly, we studied the role of two proteins, G0/G1 Switch Gene 2 (G0S2) and perilipin 5 (PLIN5), in lipid droplets dynamics as well as their impact on lipid metabolism and insulin sensitivity. We showed in vitro that these two proteins play a key role in the control of muscle lipolysis (i.e. IMTG hydrolysis) via the adipose triglyceride lipase (ATGL, catalyzing the limiting step of muscle lipolysis), and that G0S2 and PLIN5 inhibit ATGL activity through direct and indirect mechanisms, respectively. Furthermore, our data showed that G0S2 and PLIN5 invalidation in vivo in mouse skeletal muscle activates lipolysis, increases lipotoxicity and impairs insulin sensitivity. We have also highlighted an important role for PLIN5 in the regulation of fatty acids oxidation, by finely adjusting their availability to energy demand. Overall, these results clearly show on one hand that a crosstalk between adipocytes and fibers within skeletal muscle can lead to an alteration of insulin sensitivity in humans, and on the other hand that G0S2 and PLIN5, two lipid droplet proteins, play a central role in the control of muscle lipid homeostasis and insulin sensitivity. These data help to develop our current understanding of the link between muscle lipids and insulin sensitivity in humans.

Introduction Adipocytes are part of hematopoietic microenvironment, even though they are generally believed to play no active role during hematopoiesis. We have shown that accumulation of fat cells in femoral bone marrow (BM) coincides with increased expression of neuropilin-1 (NP-1), while it is weakly expressed in hematopoietic iliac crest BM. Starting from this observation, we postulated that adipocytes might exert a negative effect on hematopoiesis mediated through NP-1. Material and Methode To test this hypothesis, we set up BM adipocytes differentiated into fibroblast-like fat cells (FLFC), which share the major characteristics of primitive unilocular fat cells, as an experimental model. Results Morphological and immunophenotypic analysis of FLFCs in co-culture with CD34+ cells revealed that FLFCs constitutively produced M-CSF and induced CD34+ differentiation into macrophages independently of cell-to-cell contact. By contrast, granulopoiesis was hampered by cell-to-cell contact but could be restored in transwell culture conditions, together with G-CSF production. Both functions were also recovered when FLFCs cultured in contact with CD34+ cells were treated with an antibody neutralizing NP-1, which proved its critical implication in contact inhibition. Conclusion Our data provide the first evidence that adipocytes exert regulatory functions during hematopoiesis that might be implicated in some pathological processes.

Par la sécrétion d’adipokines, le tissu adipeux blanc viscéral présent chez des patients souffrant d’obésité promeut l’installation d’altérations métaboliques telles que l’intolérance au glucose, la résistance à l’insuline et le diabète de type 2. Les complications cardiovasculaires, en particulier l’athérosclérose, sont les principales causes de mortalité chez les patients atteints de diabète de type 2. Il a été démontré que la fraction vasculaire stromale du tissu adipeux est composée de cellules régénératives dérivées du tissu adipeux (CRTA) et que ces cellules possèdent des caractéristiques des cellules progénitrices stromales (CPS). L’impact de l’intolérance au glucose et du diabète de type 2 sur les adipocytes sont assez bien documentés. Par contre, les conséquences de ces pathologies sur le comportement des CRTA n’ont pas été mesurées d’une façon approfondie. Plus particulièrement, l’impact de ces altérations métaboliques sur le potentiel de différenciation des CRTA en adipocytes et en cellules endothéliales n’a pas été étudié. Ce projet a pour but d’évaluer, dans un modèle murin, l’effet de ces altérations métaboliques sur l’équilibre de la différenciation in vitro des CRTA en adipocytes ou en cellules endothéliales. L’intolérance au glucose et le diabète de type 2 ont été induit chez les souris par la prise de deux diètes riches en acides gras de provenance végétale (DV) ou animale (DA). L’impact de l’origine des acides gras sur la différenciation des CRTA a également été étudié. Pour ce faire, une mise au point de la culture cellulaire des CRTA s’est avérée nécessaire et compte pour une partie de ces travaux de maîtrise. Nos travaux ont démontré en premier lieu, que le DMSO est un agent qui conserve la viabilité et les propriétés progénitrices des CRTA suite à leur congélation. De plus, parmi les matrices testées, le collagène s’est avéré être celle qui conserve le mieux les caractéristiques des progéniteurs et même, qui enrichie la population cellulaire ensemencée en cellules progénitrices. La densité cellulaire des cellules non-adipeuses du tissu adipeux s’avère être significativement plus élevée chez les souris du groupe de la DV comparativement aux souris contrôles. De plus, l’évaluation in vitro de la différenciation adipogénique démontre un potentiel de différenciation plus important pour les CRTA provenant des souris de la DV par rapport au groupe contrôle et à la DA. Cependant, la différenciation en cellules endothéliales est inhibée chez les CRTA de la DV, comparativement à un retard de ce processus pour la DA. Nos travaux suggèrent que le potentiel de différenciation adipogénique et endothéliale des CRTA est affecté par le statut métabolique des souris ainsi que par la nature de la diète. Ces résultats mettent en lumière pour la première fois l’importance d’évaluer le comportement des CRTA en fonction du statut métabolique du donneur, un paramètre pouvant avoir un impact majeur dans l’utilisation des CRTA autologues en thérapie cellulaire pour la réparation de tissus vasculaires chez des patients diabétiques. / The secretion of a large number of bioactive mediators by adipose tissue in abdominal obesity promotes metabolic diseases such as glucose intolerance, insulin resistance and type 2 diabetes. Cardiovascular complications, in particular atherosclerosis, are the leading causes of mortality in patients with type 2 diabetes. It has been shown that the stromal vascular fraction of adipose tissue comprised adipose-derived regenerative cells (ADRC) and that these cells possess progenitor cells characteristics. Effects of glucose intolerance and type 2 diabetes on adipocytes are well documented. However, consequences of these pathologies on ADRC behaviors are not well understood. Particularly, the impact of these metabolic alterations on the adipogenic and endothelial differentiation potential of ADRC has not been investigated. Aim of this project was to evaluate, in a murine model, the effect of these metabolic alterations on the balance of the in vitro ADRC differentiation into adipocytes or endothelial cells. Glucose intolerance and type 2 diabetes were induced in mice by the intake of two high-fat diets enriched in vegetal (VD) or animal (AD) fat. The impact of the fat origin on the ADRC differentiation was then evaluated. To do this, the development of cellular culture conditions of ADRC was necessary and an important part of this work. Our results suggest that DMSO is an efficient cryoprotective agent that conserves the viability and progenitor properties of ADRC following their freezing. Moreover, among tested scaffolds for the culture of ADRC, collagen is the best matrix to maintain progenitor characteristics and this matrix enriched the cellular population in progenitor cells. The cellular density of non-adipose cells fraction in the adipose tissue was significantly more elevated for VD mice than for the control group. The in vitro evaluation of adipogenic differentiation demonstrated an increase in the differentiation potential for ADRC from VD group compared to AD and control groups. In addition, the endothelial differentiation was abrogated for ADRC from VD group, compared to a delayed one for AD. These results suggest that the adipogenic and endothelial differentiation potential of ADRC and, consequently, the balance between emerging mature cells, are affected by the metabolic status of mice together with the nature of fatty acids. These results highlight, for the first time, the importance to evaluate the ADRC behavior in function to the metabolic status of donor, a parameter that could have an important impact in the use of autologous ADRC in cell-based therapy for the repair of injured vascular tissues in diabetic patients.

Recent studies suggest adipose tissue plays a critical role in regulating whole body energy homeostasis in both animals and humans. In particular, activating brown adipose tissue (BAT) activity is now appreciated as a potential therapeutic strategy against obesity and metabolic disease. However, the signaling circuits that coordinate nutrient uptake and BAT function are poorly understood. Here, I investigated the role of the nutrient-sensing mTOR signaling pathway in BAT by conditionally deleting Rictor, which encodes an essential component of mTOR Complex 2 (mTORC2) either in brown adipocyte precursors or mature brown adipocytes. In general, inhibiting BAT mTORC2 reduces glucose uptake and de novo lipogenesis pathways while increases lipid uptake and oxidation pathways indicating a switch in fuel utilization. Moreover, several key thermogenic factors (Ucp1, Pgc1α, and Irf4) are elevated in Rictor-deficient BAT, resulting in enhanced thermogenesis. Accordingly, mice with mTORC2 loss in BAT are protected from HFD-induced obesity and metabolic disease at thermoneutrality. In vitro culture experiments further suggest that mTORC2 cell-autonomously regulates the BAT thermogenic program, especially Ucp1 expression, which depends on FoxO1 activity. Mechanistically, mTORC2 appears to inhibit FoxO1 by facilitating its lysine-acetylation but not through the canonical AKT-mediated phosphorylation pathway. Finally, I also provide evidence that β-adrenergic signaling which normally triggers thermogenesis also induces FoxO1 deacetylation in BAT. Based on these data, I propose a model in which mTORC2 functions in BAT as a critical signaling hub for coordinating nutrient uptake, fuel utilization, and thermogenic gene expression. These data provide a foundation for future studies into the mTORC2-FoxO1 signaling axis in different metabolic tissues and physiological conditions.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Charles university in Prague, Pharmaceutical faculty in Hradci Králové, Department of biological and medical sciences Rheinische Friedrich-Wilhelms-University Bonn, Institute of Pharmacology and Toxicology Candidate: Michaela Čajková Supervisor: PharmDr. Miroslav Kovařík, Ph.D. Consultant: Dr. Linda Sarah Hoffmann Title of diploma thesis: Role of Gq-coupled receptors in brown adipocytes In my diploma thesis, we focused on four Gq-coupled receptors (F2R, LPHN1, α1DAR, TSHR) in brown adipocytes (BAs), which were identified in the screen as the highest expressed in immature and mature BAs. Our goal was to validate suggestion, that Thyroid stimulating hormone receptor (TSHR) plays a key role in differentiation of BAs and that F2R, LPHN1, α1D-AR might be important for BAs. In our study, we investigated gene expression of these four receptors in BAs, using analytical methodsquantitative reverse-transcriptase polymerase chain reaction (qRT-PCR) and Western blot. Results from analysis revealed, that expression of TSHR was increased in mature BAs, it means, that TSHR induce differentiation of BAs. The BAs transduced with short hairpin RNA (sh-RNA) against TSHR were less differentiated, this we proved also with Oil Red-O staining. Expression of adipocyte Protein 2 (aP2), peroxisome proliferator-activated...

Li, Sui Mui. / On t.p. "beta" appears as the Greek letter. / Thesis submitted in: December 2006. / Thesis (M.Phil.)--Chinese University of Hong Kong, 2007. / Includes bibliographical references (leaves 182-189). / Abstracts in English and Chinese. / Abstract --- p.i / Abstract (Chinese) --- p.iii / Acknowledgements --- p.v / Table of contents --- p.vi / List of figures --- p.xii / List of appendices --- p.xix / Abbreviations --- p.xx / Chapter Chapter 1 --- General Introduction --- p.1 / Chapter Chapter 2 --- Role of PPARP in adipocyte differentiation - an in vitro study --- p.20 / Chapter 2.1 --- Introduction --- p.21 / Chapter 2.2 --- Materials and Methods --- p.23 / Chapter 2.2.1 --- Preparation ofPPARβ (+/+) and PPARβ (-/-) MEFs --- p.23 / Chapter 2.2.1.1 --- Materials --- p.23 / Chapter 2.2.1.2 --- Methods --- p.23 / Chapter 2.2.1.2.1 --- Isolation of MEFs --- p.23 / Chapter 2.2.1.2.2 --- Passage ofMEF culture --- p.25 / Chapter 2.2.2 --- Genotyping of PPARβ (+/+) and PPARβ (-/-) MEFs --- p.25 / Chapter 2.2.2.1 --- Materials --- p.26 / Chapter 2.2.2.2 --- Methods --- p.26 / Chapter 2.2.2.2.1 --- Primer design --- p.26 / Chapter 2.2.2.2.2 --- Genomic DNA extraction --- p.27 / Chapter 2.2.2.2.3 --- PCR reaction --- p.29 / Chapter 2.2.3 --- Western blotting of PPARβ(+/+) and PPARβ (-/-) MEFs --- p.30 / Chapter 2.2.3.1 --- Materials --- p.30 / Chapter 2.2.3.2 --- Methods --- p.31 / Chapter 2.2.3.2.1 --- Preparation of nuclear extracts --- p.31 / Chapter 2.2.3.2.2 --- Western blot --- p.32 / Chapter 2.2.4 --- Induction of adipocyte differentiation of PPARβ (+/+) and PPARβ(-/-) MEFs --- p.33 / Chapter 2.2.4.1 --- Materials --- p.34 / Chapter 2.2.4.2 --- Methods --- p.34 / Chapter 2.2.4.2.1 --- Seeding ofMEFs --- p.34 / Chapter 2.2.4.2.2 --- Adipocyte differentiation --- p.35 / Chapter 2.2.5 --- Oil Red O staining of differentiated PPARβ(+/+) and PPARβ(-/-) MEFs --- p.36 / Chapter 2.2.5.1 --- Materials --- p.36 / Chapter 2.2.5.2 --- Method --- p.37 / Chapter 2.2.5.2.1 --- Oil Red O staining --- p.37 / Chapter 2.2.6 --- Determination of triglyceride-protein assay of differentiated PPARβ (+/+) and PPARβ (-/-) MEFs --- p.37 / Chapter 2.2.6.1 --- Materials --- p.39 / Chapter 2.2.6.2 --- Methods --- p.39 / Chapter 2.2.6.2.1 --- Lysis of differentiated MEFs --- p.39 / Chapter 2.2.6.2.2 --- Measurement of triglyceride concentration in cell lysate --- p.40 / Chapter 2.2.6.2.3 --- Measurement of protein concentration in cell lysate --- p.41 / Chapter 2.2.7 --- Preparation of PPARβ(+/+) and PPARβ (-/-) MEF RNA for RT-PCR and Northern blot analysis --- p.42 / Chapter 2.2.7.1 --- Materials --- p.42 / Chapter 2.2.7.2 --- Method --- p.42 / Chapter 2.2.7.2.1 --- RNA isolation --- p.42 / Chapter 2.2.8 --- RT-PCR analysis of differentiated PPARβ(+/+) and PPARβ (-/-) MEFs --- p.44 / Chapter 2.2.8.1 --- Materials --- p.45 / Chapter 2.2.8.2 --- Methods --- p.45 / Chapter 2.2.8.2.1 --- Primer design --- p.45 / Chapter 2.2.8.2.2 --- RT-PCR --- p.46 / Chapter 2.2.9 --- Northern blot analysis of differentiated PPARβ(+/+) and PPARβ (-/-) MEFs --- p.47 / Chapter 2.2.9.1 --- Materials --- p.48 / Chapter 2.2.9.2 --- Methods --- p.49 / Chapter 2.2.9.2.1 --- Preparation of cDNA probes for Northern blotting --- p.49 / Chapter 2.2.9.2.1.1 --- RNA extraction --- p.49 / Chapter 2.2.9.2.1.2 --- Primer design --- p.49 / Chapter 2.2.9.2.1.3 --- RT-PCR of extracted mRNA --- p.50 / Chapter 2.2.9.2.1.4 --- Subcloning of amplified cDNA products --- p.50 / Chapter 2.2.9.2.1.5 --- Screening of recombinant clones by phenol-chloroform extraction --- p.51 / Chapter 2.2.9.2.1.6 --- Confirmation of the recombinant clones by restriction enzyme site mapping --- p.52 / Chapter 2.2.9.2.1.7 --- Confirmation of the recombinant clones by PCR method --- p.52 / Chapter 2.2.9.2.1.8 --- Mini-preparation of plasmid DNA from the selected recombinant clones --- p.54 / Chapter 2.2.9.2.1.9 --- Preparation of cDNA probes --- p.54 / Chapter 2.2.9.2.1.10 --- Formaldehyde agarose gel electrophoresis of RNA --- p.55 / Chapter 2.2.9.2.1.11 --- Hybridization and color development --- p.56 / Chapter 2.3 --- Results --- p.58 / Chapter 2.3.1 --- Confirmation of PPARβ(+/+) and PPARβ (-/-) MEFs genotypes --- p.58 / Chapter 2.3.2 --- PPARβ (-/-) MEFs differentiated similarly to PPARβ(+/+) MEFs as measured by Oil Red O staining --- p.61 / Chapter 2.3.3 --- PPARβ (-/-) MEFs differentiated similarly to PPARβ(+/+) MEFs as reflected by their intracellular triglyceride contents --- p.64 / Chapter 2.3.4 --- PPARβ(-/-) MEFs expressed the adipocyte differentiation marker genes similarly to PPARβ (+/+) MEFs --- p.66 / Chapter 2.4 --- Discussion --- p.77 / Chapter Chapter 3 --- Role of PPARβ in adipocyte differentiation and lipid homeostasis - an in vivo study --- p.82 / Chapter 3.1 --- Introduction --- p.83 / Chapter 3.2 --- Materials and Methods --- p.85 / Chapter 3.2.1 --- Animal and high fat diet treatment --- p.85 / Chapter 3.2.1.1 --- Materials --- p.85 / Chapter 3.2.1.2 --- Method --- p.86 / Chapter 3.2.1.2.1 --- Animal treatment --- p.86 / Chapter 3.2.2 --- Tail-genotyping of PPARβ (+/+) and PPARβ (-/-) mice --- p.87 / Chapter 3.2.2.1 --- Materials --- p.87 / Chapter 3.2.2.2 --- Methods --- p.88 / Chapter 3.2.2.2.1 --- DNA extraction from tail --- p.88 / Chapter 3.2.2.2.2 --- PCR tail-genotyping --- p.89 / Chapter 3.2.3 --- "Measurement of serum triglyceride, cholesterol and glucose levels by enzymatic and spectrophometric methods" --- p.89 / Chapter 3.2.3.1 --- Materials --- p.90 / Chapter 3.2.3.2 --- Methods --- p.91 / Chapter 3.2.3.2.1 --- Serum preparation --- p.91 / Chapter 3.2.3.2.2 --- Measurement of serum triglycerides --- p.91 / Chapter 3.2.3.2.3 --- Measurement of serum cholesterol --- p.92 / Chapter 3.2.3.2.3 --- Measurement of serum glucose --- p.93 / Chapter 3.2.4 --- Measurement of serum insulin and leptin levels by ELISA --- p.94 / Chapter 3.2.4.1 --- Materials --- p.95 / Chapter 3.2.4.2 --- Methods --- p.95 / Chapter 3.2.4.2.1 --- Measurement of serum insulin --- p.95 / Chapter 3.2.4.2.2 --- Measurement of serum leptin --- p.97 / Chapter 3.2.5 --- "Histological studies of liver, interscapular BF and gonadal WF pads" --- p.99 / Chapter 3.2.5.1 --- Materials --- p.100 / Chapter 3.2.5.2 --- Methods --- p.100 / Chapter 3.2.5.2.1 --- "Fixation, dehydration, embedding in paraffin and sectioning" --- p.100 / Chapter 3.2.5.2.2 --- H&E staining --- p.101 / Chapter 3.2.6 --- Analyses of fecal lipid contents --- p.102 / Chapter 3.2.6.1 --- Materials --- p.102 / Chapter 3.2.6.2 --- Method --- p.103 / Chapter 3.2.6.2.1 --- Extraction of lipid contents from stools --- p.103 / Chapter 3.2.7 --- Statistical analysis --- p.104 / Chapter 3.3 --- Results --- p.105 / Chapter 3.3.1 --- Confirmation of genotypes by PCR --- p.105 / Chapter 3.3.2 --- PPARβ (-/-) mice were more resistant to high fat diet-induced obesity --- p.105 / Chapter 3.3.3 --- PPARβ (-/-) mice consumed similarly as to PPARβ (+/+) counterparts… --- p.122 / Chapter 3.3.4 --- Effect of high fat diet on organ weights --- p.128 / Chapter 3.3.4.1 --- PPARβ (-/-) mice were more resistant to high fat diet-induced liver hepatomegaly --- p.134 / Chapter 3.3.4.2 --- PPARβ (-/-) mice were resistant to high fat diet-induced increased white fat depots --- p.134 / Chapter 3.3.4.3 --- PPARβ (-/-) mice were resistant to high fat diet-induced increased brown fat mass --- p.137 / Chapter 3.3.5 --- Effect of high fat diet on organ histology --- p.142 / Chapter 3.3.5.1 --- PPARβ(-/-) mice were more resistant to high fat diet-induced liver steatosis --- p.143 / Chapter 3.3.5.2 --- No defect in white adipocyte expansion in PPARβ(-/-) mice upon high fat diet feeding --- p.153 / Chapter 3.3.5.3 --- No defect in brown adipocyte expansion in PPARβ (-/-) mice upon high fat diet feeding --- p.159 / Chapter 3.3.6 --- "Effect on high fat diet on serum cholesterol, triglyceride, glucose, insulin and leptin levels" --- p.164 / Chapter 3.3.6.1 --- "PPARβ (-/-) mice had a lower serum cholesterol level, but a similar triglyceride level as compared to PPARβ (+/+) mice upon high fat diet feeding" --- p.165 / Chapter 3.3.6.2 --- PPARβ (-/-) mice were resistant to high fat diet-induced insulin resistance --- p.167 / Chapter 3.3.6.3 --- PPARβ (-/-) mice had a similar serum leptin level as PPARβ (+/+) mice --- p.170 / Chapter 3.3.7 --- No decision made in fecal lipid content of PPARβ (+/+) and PPARβ (-/-) mice --- p.173 / Chapter 3.4 --- Discussion --- p.176 / References --- p.182 / Appendices --- p.190