Orientador: Maria Cecília Rui Luvizotto / Resumo: Nas últimas décadas biomarcadores de angiogênese e linfangiogênese tumoral são alvos de estudos e, em humanos, estes aspectos da vasculatura tumoral já são utilizados como fatores prognósticos em neoplasias mamárias. Em cadelas não há estudos suficientes para demonstrar o significado clínico-patológico da linfangiogênese em neoplasias mamárias. De maneira similar, não há estudos que demonstrem efeitos antilinfangiogênicos de terapias como a quimioterapia metronômica (QM), classicamente caracterizada como uma terapia antiangiogênica. Este estudo teve como objetivos estabelecer os efeitos da QM na angiogênese e linfangiogênese tumoral destas neoplasias, assim como obter o significado clínico-patológico da densidade de vasos linfáticos em neoplasias mamárias caninas. Foram utilizadas 40 cadelas portadoras de carcinomas mamários, divididas em dois grupos, sendo um tratado somente com mastectomia e outro tratado com quimioterapia metronômica (QM) seguida de mastectomia. A biópsia do linfonodo sentinela foi preconizada para estabelecimento do “status” do tecido linfoide sentinela. Após, foi realizada a classificação e graduação histopatológica das neoplasias, e procedeu-se a imunomarcação para determinar a densidade de vasos linfáticos (DVL), a densidade microvascular (DMV), índice de proliferação celular (IP), índice apoptótico (IA), escore de COX-2, grau do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e metástase nodal. As imunomarcações foram comparadas entre os grupos e a DV... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In recent decades biomarkers of tumor angiogenesis and lymphangiogenesis have been studied and, in humans, these aspects of tumor vasculature are already used as prognostic factors in breast cancer. In bitches there are no studies that prove the clinicopathological significance of lymphangiogenesis in mammary neoplasms. Similarly, there are no studies demonstrating anti-lymphangiogenic effects of therapies such as metronomic chemotherapy (MC), classically characterized as anti-angiogenic therapy. This study aimed to establish the effects of MC on tumor angiogenesis and lymphangiogenesis of these neoplasms, as well as to obtain the clinical-pathological significance of lymphatic vessel density in canine mammary tumors. Forty bitches with mammary carcinomas were used, divided into two groups, one treated with mastectomy and the other treated with MC followed by mastectomy. Sentinel lymph node biopsy was recommended for establishing the status of the sentinel lymph node. Afterwards, classification and histopathological graduation of the neoplasms was performed, followed by immunostaining and determination of lymphatic vessel density (LVD), microvascular density (MVD), cell proliferation index (PI), apoptotic index (AI), COX-2 score, and vascular endothelial growth factor (VEGF) grade. Immunostain were compared between the groups and the LVD compared to clinicopathological aspects. Antiangiogenic and pro-apoptotic effects were observed in the group treated with MC, but without an... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

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O objetivo deste estudo foi avaliar a qualidade de vida de pacientes oncológicos, diagnosticados com câncer de mama e câncer de intestino, no início do tratamento quimioterápico adjuvante e três meses após, de instituições ou clínicas da cidade de Ribeirão Preto/SP. Trata-se de estudo descritivo exploratório, longitudinal do tipo, estudo de acompanhamento, de abordagem quantitativa, tendo sido utilizado um instrumento contendo duas partes: dados sócio-demográficos e clínicos e, itens referentes ao instrumento que avalia QV em pacientes oncológicos, o EORTC QLQ-C- 30. A amostra constou de 21 pacientes atendidos em três diferentes clínicas: Clínica de Tratamento Oncológico (CTO), Centro Especializado de Oncologia (CEON) e Fundação para Pesquisa, Prevenção e Tratamento do Câncer (Fundação Sobeccan), localizadas na cidade de Ribeirão Preto/ São Paulo, no período de outubro de 2005 a junho de 2006. O instrumento mostrou propriedades psicométricas satisfatórias quanto à consistência interna e validade do construto. Quanto às características sóciodemográficas e clínicas, verificou-se que 61,9% eram do sexo feminino e 38,1% do sexo masculino. A média de idade foi de 55,5 anos, com desvio padrão de 12 anos. Pacientes diagnosticados com câncer de mama correspondeu a 47,6% e com câncer de intestino, os restantes 52,4%. Foi ainda verificado que apenas 9,5% do total de 21 pacientes, apresentavam metástases. Nos pacientes com câncer de mama, os tratamentos utilizados foram: 70% tratados com Fluorouracil, Adriamicina, Ciclofosfamida (FAC), 20% com Ciclofosfamida, Metotrexate, Fluorouracil (CMF) e 10% 7 com Adriamicina, Ciclofosfamida (AC). Para os pacientes com câncer de intestino, o protocolo utilizado para tratamento adjuvante foi o Fluorouracil (5-FU)+leucovorin em 100% dos pacientes. Radioterapia concomitante à quimioterapia foi realizada em apenas 9,5% dos pacientes. A análise de QV da amostra estudada para o EORTC QLQ-C30 revelou que a média foi de 60,8 com desvio padrão (DP) igual a 28,9 no início e, 73,4 (DP=29,6) após três meses, referente ao estado geral de saúde para pacientes com câncer de mama. Foram estatisticamente significantes as escalas: função física, desempenho de papel, função emocional, função cognitiva, função social, fadiga, náuseas e vômitos, dor, insônia, perda de apetite, constipação e estado geral de saúde. Em relação aos pacientes com câncer de intestino, a média referente ao estado geral de saúde no início foi de 78,0 (DP=16,0) e três meses após foi de 78,2 (DP=19,5). Foram estatisticamente significativos os resultados obtidos nas escalas: função física, desempenho de papel, função emocional, função cognitiva, função social, fadiga, dificuldade financeira e estado geral de saúde. Concluindo, o conjunto de resultados apresentados permitiu visualizar o impacto positivo da QV em pacientes com câncer de mama e câncer de intestino tratados com quimioterapia adjuvante, ao final dos três meses. / The objective of this study was to evaluate the quality of life of patients who had been breast and bowels cancer diagnosed, during initial disease adjuvant chemotherapy treatment and also after three months treatment in the city of Ribeirão Preto. This study is a longitudinal exploratory descriptive one , classified as following study, based on approaching quantity in which an instrument containing two parts was utilized : social and clinic demographic data and items referring to the instrument for evaluation of QV in oncologic patients ? the EORTC QLQ-C 30. A sample of 21 patients medicated in three different clinics which were :Clinica de Tratamento Oncológico (CTO) Centro Especializado de Oncologia (CEON) and Fundação para Pesquisa , Prevenção e Tratamento do Câncer ( Fundação Soberccan) all of them located in the city of Ribeirão Preto, from October 2005 to June 2006. Concerning internal consistency and also constructo´s validity, the instrument showed satisfactory psychometric properties. Concerning social demography and clinic characteristics, 61,9% were female and 38,1% male. Medium age was 55,5 years old, considering standard deviation of 12 years. Breast cancer diagnosed patients amounted 47,6% and bowels cancer patients the remaining 52,4%. The study also revealed that only 9,5% from the whole 21 patients presented metastasis. Treatments for breath cancer patients were : 70% - FAC treatment - 20% CMF treatment ? 10% - AC treatment. or patients with bowels cancer the protocol utilized for adjuvant treatment was 5-FU+leucovorin in all 10% patients. 9 Radiotherapy concomitant to chemotherapy was applied in only 9,5% from the whole patients. QV analysis of the studied sample for EORTC QLQ-C30 has revealed that medium average was 60.8 with standard deviation (DP) equal to 28.9 at the begining and 73.4 (DP=29.6) after three months treatment referring to general health for breast cancer patients. The following scales were statistically significant : physical function, role performance, emotional function, cognitive function, social function, fatigue, nausea and vomit, pain, sleepleness, lack of hunger , constipation and general health. Concerning bowels cancer patients the medium average of general health at the beginning was 78.2 (DP=19.8). The results statistically obtained were significant in the following scales : physical function, role performance, emotional function, cognitive function, social function, fatigue, financial problems and general health. Conclusion the whole above presented results lead us to visualize the positive QV impact on breast and bowels cancer patients submitted to an adjuvant chemotherapy at the beginning and three months later.

O câncer é uma das principais causas de morte em todo o mundo e o fator limitante na terapia antitumoral é a resistência a processos terapêuticos. Diversos são os mecanismos de resistência à drogas antitumorais e é fundamental desvendar os mecanismos envolvidos na quimiorresistência para eliminá-lo e ter-se uma melhor eficácia terapêutica. Nesse trabalho investigamos os mecanismos que determinam resistência a cisplatina em células de glioma. Primeiramente, mostramos que a resistência celular a cisplatina era independente de p53, capacidade de reparo de DNA. Utilizando modelo in vitro e in vivo foi demonstrado que os níveis de glutationa (GSH) tinha papel fundamental na resistência a cisplatina e temozolamida (TMZ). A linhagem de glioma resistente a TMZ tinha maior proteção antioxidante, maior expressão do fator de transcrição NRF2, GCLM e GST (envolvidos na geração e utilização de GSH). Utilizando modelo in vitro e in vivo mostramos que BSO (inibidor da síntese de GSH) potencializava o efeito tóxico do TMZ. Assim, a combinação de BSO com cisplatina e TMZ é uma abordagem poderosa para otimizar a citotoxicidade em tumores, sendo uma alternativa excitante para o tratamento de pacientes com glioma ou melanoma. / Cancer is one of main cause of death worldwide and the limiting factor is antitumoral therapy resistance. Several mechanisms command drug resistance and fundamental question is how is to unveil the mechanisms involved in it to get a better therapeutic efficacy. We investigated the mechanisms of cisplatin resistance in glioma cells. We demonstrated that cisplatin resistance was p53 independent and DNA repair capacity. It was demonstrated in a in vitro a in vivo model that gluthatione (GSH) is the major resistant factor for cisplatin and temozolomide (TMZ). We observed that the TMZ resistant glioma cell line counted with a high expression of the antioxidant transcription factor NFR2, GCLM and GST. We observed that NFR2 silencing greatly enhanced cell death, high levels of DNA damage upon TMZ treatment. In addition, BSO potentiated TMZ killing in human and murine melanoma using in vitro and in vivo models. Thus, combination of BSO, cisplatin and TMZ is a powerful strategy to optimize tumor killing, thus providing an exciting alternative therapeutic protocol to glioma and melanoma patients.

O objetivo deste estudo foi avaliar a qualidade de vida de pacientes oncológicos, diagnosticados com câncer de mama e câncer de intestino, no início do tratamento quimioterápico adjuvante e três meses após, de instituições ou clínicas da cidade de Ribeirão Preto/SP. Trata-se de estudo descritivo exploratório, longitudinal do tipo, estudo de acompanhamento, de abordagem quantitativa, tendo sido utilizado um instrumento contendo duas partes: dados sócio-demográficos e clínicos e, itens referentes ao instrumento que avalia QV em pacientes oncológicos, o EORTC QLQ-C- 30. A amostra constou de 21 pacientes atendidos em três diferentes clínicas: Clínica de Tratamento Oncológico (CTO), Centro Especializado de Oncologia (CEON) e Fundação para Pesquisa, Prevenção e Tratamento do Câncer (Fundação Sobeccan), localizadas na cidade de Ribeirão Preto/ São Paulo, no período de outubro de 2005 a junho de 2006. O instrumento mostrou propriedades psicométricas satisfatórias quanto à consistência interna e validade do construto. Quanto às características sóciodemográficas e clínicas, verificou-se que 61,9% eram do sexo feminino e 38,1% do sexo masculino. A média de idade foi de 55,5 anos, com desvio padrão de 12 anos. Pacientes diagnosticados com câncer de mama correspondeu a 47,6% e com câncer de intestino, os restantes 52,4%. Foi ainda verificado que apenas 9,5% do total de 21 pacientes, apresentavam metástases. Nos pacientes com câncer de mama, os tratamentos utilizados foram: 70% tratados com Fluorouracil, Adriamicina, Ciclofosfamida (FAC), 20% com Ciclofosfamida, Metotrexate, Fluorouracil (CMF) e 10% 7 com Adriamicina, Ciclofosfamida (AC). Para os pacientes com câncer de intestino, o protocolo utilizado para tratamento adjuvante foi o Fluorouracil (5-FU)+leucovorin em 100% dos pacientes. Radioterapia concomitante à quimioterapia foi realizada em apenas 9,5% dos pacientes. A análise de QV da amostra estudada para o EORTC QLQ-C30 revelou que a média foi de 60,8 com desvio padrão (DP) igual a 28,9 no início e, 73,4 (DP=29,6) após três meses, referente ao estado geral de saúde para pacientes com câncer de mama. Foram estatisticamente significantes as escalas: função física, desempenho de papel, função emocional, função cognitiva, função social, fadiga, náuseas e vômitos, dor, insônia, perda de apetite, constipação e estado geral de saúde. Em relação aos pacientes com câncer de intestino, a média referente ao estado geral de saúde no início foi de 78,0 (DP=16,0) e três meses após foi de 78,2 (DP=19,5). Foram estatisticamente significativos os resultados obtidos nas escalas: função física, desempenho de papel, função emocional, função cognitiva, função social, fadiga, dificuldade financeira e estado geral de saúde. Concluindo, o conjunto de resultados apresentados permitiu visualizar o impacto positivo da QV em pacientes com câncer de mama e câncer de intestino tratados com quimioterapia adjuvante, ao final dos três meses. / The objective of this study was to evaluate the quality of life of patients who had been breast and bowels cancer diagnosed, during initial disease adjuvant chemotherapy treatment and also after three months treatment in the city of Ribeirão Preto. This study is a longitudinal exploratory descriptive one , classified as following study, based on approaching quantity in which an instrument containing two parts was utilized : social and clinic demographic data and items referring to the instrument for evaluation of QV in oncologic patients ? the EORTC QLQ-C 30. A sample of 21 patients medicated in three different clinics which were :Clinica de Tratamento Oncológico (CTO) Centro Especializado de Oncologia (CEON) and Fundação para Pesquisa , Prevenção e Tratamento do Câncer ( Fundação Soberccan) all of them located in the city of Ribeirão Preto, from October 2005 to June 2006. Concerning internal consistency and also constructo´s validity, the instrument showed satisfactory psychometric properties. Concerning social demography and clinic characteristics, 61,9% were female and 38,1% male. Medium age was 55,5 years old, considering standard deviation of 12 years. Breast cancer diagnosed patients amounted 47,6% and bowels cancer patients the remaining 52,4%. The study also revealed that only 9,5% from the whole 21 patients presented metastasis. Treatments for breath cancer patients were : 70% - FAC treatment - 20% CMF treatment ? 10% - AC treatment. or patients with bowels cancer the protocol utilized for adjuvant treatment was 5-FU+leucovorin in all 10% patients. 9 Radiotherapy concomitant to chemotherapy was applied in only 9,5% from the whole patients. QV analysis of the studied sample for EORTC QLQ-C30 has revealed that medium average was 60.8 with standard deviation (DP) equal to 28.9 at the begining and 73.4 (DP=29.6) after three months treatment referring to general health for breast cancer patients. The following scales were statistically significant : physical function, role performance, emotional function, cognitive function, social function, fatigue, nausea and vomit, pain, sleepleness, lack of hunger , constipation and general health. Concerning bowels cancer patients the medium average of general health at the beginning was 78.2 (DP=19.8). The results statistically obtained were significant in the following scales : physical function, role performance, emotional function, cognitive function, social function, fatigue, financial problems and general health. Conclusion the whole above presented results lead us to visualize the positive QV impact on breast and bowels cancer patients submitted to an adjuvant chemotherapy at the beginning and three months later.

O câncer de pulmão permanece a neoplasia mais letal com cerca de 1,59 milhões de mortes por ano em todo o mundo, com eficácia terapêutica limitada e mau prognóstico. Aproximadamente 80 % dos casos são de câncer de pulmão de não pequenas células (CPNPC), desses, cerca de 50 % são os adenocarcinomas (AdC). Atualmente o tratamento padrão-ouro no tratamento de AdC pulmonar é baseado em agentes de platina (cisplatina, carboplatina) normalmente administrados em combinação com outros agentes, entretanto a doença é raramente curável. Vários fatores contribuem para a alta taxa de mortalidade e um dos mais comuns é a quimioresistência. Portanto, existe uma necessidade urgente de terapias mais eficazes em aumentar a sobrevida global dos pacientes com essa patologia. Tendo em vista que o desenvolvimento de novos medicamentos requer muito tempo e investimento financeiro, o uso de drogas existentes como terapia combinada torna-se uma boa abordagem. Estudos anteriores de nosso grupo demonstraram que a agressividade do AdC de pulmão está associada com elevado estresse oxidativo onde o peróxido de hidrogênio (H2O2) tem um papel crucial, uma vez que o tratamento com a enzima antioxidante catalase (CAT) atenuou a agressividade do tumor. Assim, este estudo avaliou a eficácia da terapia combinada com CAT na linhagem celular A549 de AdC humano. Primeiramente, a adição de CAT causou uma inibição dose-dependente da proliferação celular com um efeito máximo na dose de 1000 U/mL. Essa inibição foi relacionada a um efeito citostático, não citotóxico, do consumo de H2O2 intracelular, já que a retirada da CAT restaurou a taxa proliferativa celular a níveis de controle. Após, a avaliação do “status” de ativação do NFB mostrou um aumento de 2,9 vezes no imunoconteúdo citosólico da subunidade p65, sugerindo uma diminuição da ativação do NFB em células tratadas com CAT. A análise do efeito do tratamento de CAT em parâmetros redox mostrou uma redução nos níveis intracelulares de tióis (-SH) e no potencial antioxidante total (TRAP) e um aumento na produção de H2O2 e nos níveis de glutationa (GSH). Entre as drogas testadas (Cisplatina, 5-Fluorouracil, Paclitaxel, Hidroxiuréia e Daunorrubicina), apenas o tratamento com paclitaxel e hidroxiureia mostraram aumento da produção de H2O2 quando comparados com o veículo. No entanto, o co-tratamento com CAT e paclitaxel não alterou a produção de H2O2. Hidroxiuréia e CAT promoveu uma redução na produção de H2O2, quando comparado com a droga sozinha. A cisplatina, por si só não teve efeito na produção de H2O2, mas cisplatina e CAT promoveram um aumento na produção de H2O2. A eficácia da terapia combinada com CAT em potencializar a citotoxicidade dos quimioterápicos, foi analisada pelo ensaio SRB e pelo software CalcuSyn®. Pela análise dos valores de “Combination Index” (CI) observamos que, com a exceção da combinação de CAT e paclitaxel, que gerou antagonismo, as combinações de CAT com cisplatina, 5-fluorouracil e hidroxiuréia exibiram um efeito sinérgico na eliminação de células da linhagem de AdC humano A549. Dessa forma, os dados aqui apresentados sugerem que a terapia combinada de CAT com cisplatina, 5-fluorouracil e hidroxiuréia pode surgir como uma nova estratégia terapêutica para o AdC. / Lung cancer remains the most lethal malignant disease with nearly 1.59 million deaths annually worldwide, limited efficacy of current therapeutics and dismal prognostic. Approximately 80% of the cases are non-small cell lung cancer (NSCLC), of these, roughly 50% are adenocarcinomas (AdC). Currently, the gold standard treatment for AdC is based on platinum agents, usually given in combination with other agents. Despite these therapies, the disease is rarely curable. Several factors contribute to the high mortality rate and one of the most common includes tumor cell chemoresistance to cytotoxic drugs. Therefore, there is an urgent need for more effective therapies that could increase the overall survival of lung AdC patients. With the notion that the development of novel drugs require much time and financial investment, the use of existing drugs as adjuvant treatment becomes a good approach. Previous studies of our group demonstrated that lung AdC aggressiveness is associated with elevated intracellular oxidative stress, in which hydrogen peroxide (H2O2) plays a crucial role, since the exogenous treatment with the antioxidant enzyme catalase (CAT) attenuated tumor aggressiveness. Then, this study evaluated the efficacy of CAT adjuvant treatment in the human AdC cell line A549. Firstly, exogenous addition of CAT caused a dose dependent inhibition on cellular proliferation with a maximal dose effect of 1000 U/mL. Growth inhibition was related to a cytostatic, not cytotoxic, effect of intracellular H2O2 consumption, since CAT washout readily restored cellular proliferative rate similar to control. After that, evaluation of NFB activation status showed a 2.9-fold increase in the cytosolic immunocontent of the NFB subunit p65, suggesting a decreased NFB activation in CAT-treated cells. Analysis of CAT treatment effect in redox parameters showed decreased intracellular thiol levels (-SH) and non-enzymatic antioxidant potential (TRAP) and increases the H2O2 production and glutathione levels (GSH). Among drugs tested (cisplatin, paclitaxel, 5-fluorouracil, daunorubicin, hydroxurea) (GI50), only paclitaxel and hydroxyurea showed increased production of H2O2 when compared with vehicle. However, co-treatement with CAT and paclitaxel had no alteration in the H2O2 production. Hydroxyurea plus CAT had a decreased in H2O2 production when compared with the drug alone. Cisplatin, alone had no effect in H2O2 production, but cisplatin plus CAT, had an increased in H2O2 production. Regarding the effectiveness of adjuvant CAT treatment in potentiate chemotherapeutic drugs cytotoxicities, we used de SRB assay and Calcusyn Software to access this interaction. From analyzes of combination index (CI) values, generated by CalcuSyn, we observed that with the exception of CAT plus paclitaxel, all combinations exhibited a synergistic effect. Taken together, data presented here suggest that adjuvant CAT treatment can act synergistically with chemotherapeutics and modulate tumorassociated signaling pathways providing a new therapeutic strategy for AdC therapy.

O câncer de pulmão permanece a neoplasia mais letal com cerca de 1,59 milhões de mortes por ano em todo o mundo, com eficácia terapêutica limitada e mau prognóstico. Aproximadamente 80 % dos casos são de câncer de pulmão de não pequenas células (CPNPC), desses, cerca de 50 % são os adenocarcinomas (AdC). Atualmente o tratamento padrão-ouro no tratamento de AdC pulmonar é baseado em agentes de platina (cisplatina, carboplatina) normalmente administrados em combinação com outros agentes, entretanto a doença é raramente curável. Vários fatores contribuem para a alta taxa de mortalidade e um dos mais comuns é a quimioresistência. Portanto, existe uma necessidade urgente de terapias mais eficazes em aumentar a sobrevida global dos pacientes com essa patologia. Tendo em vista que o desenvolvimento de novos medicamentos requer muito tempo e investimento financeiro, o uso de drogas existentes como terapia combinada torna-se uma boa abordagem. Estudos anteriores de nosso grupo demonstraram que a agressividade do AdC de pulmão está associada com elevado estresse oxidativo onde o peróxido de hidrogênio (H2O2) tem um papel crucial, uma vez que o tratamento com a enzima antioxidante catalase (CAT) atenuou a agressividade do tumor. Assim, este estudo avaliou a eficácia da terapia combinada com CAT na linhagem celular A549 de AdC humano. Primeiramente, a adição de CAT causou uma inibição dose-dependente da proliferação celular com um efeito máximo na dose de 1000 U/mL. Essa inibição foi relacionada a um efeito citostático, não citotóxico, do consumo de H2O2 intracelular, já que a retirada da CAT restaurou a taxa proliferativa celular a níveis de controle. Após, a avaliação do “status” de ativação do NFB mostrou um aumento de 2,9 vezes no imunoconteúdo citosólico da subunidade p65, sugerindo uma diminuição da ativação do NFB em células tratadas com CAT. A análise do efeito do tratamento de CAT em parâmetros redox mostrou uma redução nos níveis intracelulares de tióis (-SH) e no potencial antioxidante total (TRAP) e um aumento na produção de H2O2 e nos níveis de glutationa (GSH). Entre as drogas testadas (Cisplatina, 5-Fluorouracil, Paclitaxel, Hidroxiuréia e Daunorrubicina), apenas o tratamento com paclitaxel e hidroxiureia mostraram aumento da produção de H2O2 quando comparados com o veículo. No entanto, o co-tratamento com CAT e paclitaxel não alterou a produção de H2O2. Hidroxiuréia e CAT promoveu uma redução na produção de H2O2, quando comparado com a droga sozinha. A cisplatina, por si só não teve efeito na produção de H2O2, mas cisplatina e CAT promoveram um aumento na produção de H2O2. A eficácia da terapia combinada com CAT em potencializar a citotoxicidade dos quimioterápicos, foi analisada pelo ensaio SRB e pelo software CalcuSyn®. Pela análise dos valores de “Combination Index” (CI) observamos que, com a exceção da combinação de CAT e paclitaxel, que gerou antagonismo, as combinações de CAT com cisplatina, 5-fluorouracil e hidroxiuréia exibiram um efeito sinérgico na eliminação de células da linhagem de AdC humano A549. Dessa forma, os dados aqui apresentados sugerem que a terapia combinada de CAT com cisplatina, 5-fluorouracil e hidroxiuréia pode surgir como uma nova estratégia terapêutica para o AdC. / Lung cancer remains the most lethal malignant disease with nearly 1.59 million deaths annually worldwide, limited efficacy of current therapeutics and dismal prognostic. Approximately 80% of the cases are non-small cell lung cancer (NSCLC), of these, roughly 50% are adenocarcinomas (AdC). Currently, the gold standard treatment for AdC is based on platinum agents, usually given in combination with other agents. Despite these therapies, the disease is rarely curable. Several factors contribute to the high mortality rate and one of the most common includes tumor cell chemoresistance to cytotoxic drugs. Therefore, there is an urgent need for more effective therapies that could increase the overall survival of lung AdC patients. With the notion that the development of novel drugs require much time and financial investment, the use of existing drugs as adjuvant treatment becomes a good approach. Previous studies of our group demonstrated that lung AdC aggressiveness is associated with elevated intracellular oxidative stress, in which hydrogen peroxide (H2O2) plays a crucial role, since the exogenous treatment with the antioxidant enzyme catalase (CAT) attenuated tumor aggressiveness. Then, this study evaluated the efficacy of CAT adjuvant treatment in the human AdC cell line A549. Firstly, exogenous addition of CAT caused a dose dependent inhibition on cellular proliferation with a maximal dose effect of 1000 U/mL. Growth inhibition was related to a cytostatic, not cytotoxic, effect of intracellular H2O2 consumption, since CAT washout readily restored cellular proliferative rate similar to control. After that, evaluation of NFB activation status showed a 2.9-fold increase in the cytosolic immunocontent of the NFB subunit p65, suggesting a decreased NFB activation in CAT-treated cells. Analysis of CAT treatment effect in redox parameters showed decreased intracellular thiol levels (-SH) and non-enzymatic antioxidant potential (TRAP) and increases the H2O2 production and glutathione levels (GSH). Among drugs tested (cisplatin, paclitaxel, 5-fluorouracil, daunorubicin, hydroxurea) (GI50), only paclitaxel and hydroxyurea showed increased production of H2O2 when compared with vehicle. However, co-treatement with CAT and paclitaxel had no alteration in the H2O2 production. Hydroxyurea plus CAT had a decreased in H2O2 production when compared with the drug alone. Cisplatin, alone had no effect in H2O2 production, but cisplatin plus CAT, had an increased in H2O2 production. Regarding the effectiveness of adjuvant CAT treatment in potentiate chemotherapeutic drugs cytotoxicities, we used de SRB assay and Calcusyn Software to access this interaction. From analyzes of combination index (CI) values, generated by CalcuSyn, we observed that with the exception of CAT plus paclitaxel, all combinations exhibited a synergistic effect. Taken together, data presented here suggest that adjuvant CAT treatment can act synergistically with chemotherapeutics and modulate tumorassociated signaling pathways providing a new therapeutic strategy for AdC therapy.

O câncer de pulmão permanece a neoplasia mais letal com cerca de 1,59 milhões de mortes por ano em todo o mundo, com eficácia terapêutica limitada e mau prognóstico. Aproximadamente 80 % dos casos são de câncer de pulmão de não pequenas células (CPNPC), desses, cerca de 50 % são os adenocarcinomas (AdC). Atualmente o tratamento padrão-ouro no tratamento de AdC pulmonar é baseado em agentes de platina (cisplatina, carboplatina) normalmente administrados em combinação com outros agentes, entretanto a doença é raramente curável. Vários fatores contribuem para a alta taxa de mortalidade e um dos mais comuns é a quimioresistência. Portanto, existe uma necessidade urgente de terapias mais eficazes em aumentar a sobrevida global dos pacientes com essa patologia. Tendo em vista que o desenvolvimento de novos medicamentos requer muito tempo e investimento financeiro, o uso de drogas existentes como terapia combinada torna-se uma boa abordagem. Estudos anteriores de nosso grupo demonstraram que a agressividade do AdC de pulmão está associada com elevado estresse oxidativo onde o peróxido de hidrogênio (H2O2) tem um papel crucial, uma vez que o tratamento com a enzima antioxidante catalase (CAT) atenuou a agressividade do tumor. Assim, este estudo avaliou a eficácia da terapia combinada com CAT na linhagem celular A549 de AdC humano. Primeiramente, a adição de CAT causou uma inibição dose-dependente da proliferação celular com um efeito máximo na dose de 1000 U/mL. Essa inibição foi relacionada a um efeito citostático, não citotóxico, do consumo de H2O2 intracelular, já que a retirada da CAT restaurou a taxa proliferativa celular a níveis de controle. Após, a avaliação do “status” de ativação do NFB mostrou um aumento de 2,9 vezes no imunoconteúdo citosólico da subunidade p65, sugerindo uma diminuição da ativação do NFB em células tratadas com CAT. A análise do efeito do tratamento de CAT em parâmetros redox mostrou uma redução nos níveis intracelulares de tióis (-SH) e no potencial antioxidante total (TRAP) e um aumento na produção de H2O2 e nos níveis de glutationa (GSH). Entre as drogas testadas (Cisplatina, 5-Fluorouracil, Paclitaxel, Hidroxiuréia e Daunorrubicina), apenas o tratamento com paclitaxel e hidroxiureia mostraram aumento da produção de H2O2 quando comparados com o veículo. No entanto, o co-tratamento com CAT e paclitaxel não alterou a produção de H2O2. Hidroxiuréia e CAT promoveu uma redução na produção de H2O2, quando comparado com a droga sozinha. A cisplatina, por si só não teve efeito na produção de H2O2, mas cisplatina e CAT promoveram um aumento na produção de H2O2. A eficácia da terapia combinada com CAT em potencializar a citotoxicidade dos quimioterápicos, foi analisada pelo ensaio SRB e pelo software CalcuSyn®. Pela análise dos valores de “Combination Index” (CI) observamos que, com a exceção da combinação de CAT e paclitaxel, que gerou antagonismo, as combinações de CAT com cisplatina, 5-fluorouracil e hidroxiuréia exibiram um efeito sinérgico na eliminação de células da linhagem de AdC humano A549. Dessa forma, os dados aqui apresentados sugerem que a terapia combinada de CAT com cisplatina, 5-fluorouracil e hidroxiuréia pode surgir como uma nova estratégia terapêutica para o AdC. / Lung cancer remains the most lethal malignant disease with nearly 1.59 million deaths annually worldwide, limited efficacy of current therapeutics and dismal prognostic. Approximately 80% of the cases are non-small cell lung cancer (NSCLC), of these, roughly 50% are adenocarcinomas (AdC). Currently, the gold standard treatment for AdC is based on platinum agents, usually given in combination with other agents. Despite these therapies, the disease is rarely curable. Several factors contribute to the high mortality rate and one of the most common includes tumor cell chemoresistance to cytotoxic drugs. Therefore, there is an urgent need for more effective therapies that could increase the overall survival of lung AdC patients. With the notion that the development of novel drugs require much time and financial investment, the use of existing drugs as adjuvant treatment becomes a good approach. Previous studies of our group demonstrated that lung AdC aggressiveness is associated with elevated intracellular oxidative stress, in which hydrogen peroxide (H2O2) plays a crucial role, since the exogenous treatment with the antioxidant enzyme catalase (CAT) attenuated tumor aggressiveness. Then, this study evaluated the efficacy of CAT adjuvant treatment in the human AdC cell line A549. Firstly, exogenous addition of CAT caused a dose dependent inhibition on cellular proliferation with a maximal dose effect of 1000 U/mL. Growth inhibition was related to a cytostatic, not cytotoxic, effect of intracellular H2O2 consumption, since CAT washout readily restored cellular proliferative rate similar to control. After that, evaluation of NFB activation status showed a 2.9-fold increase in the cytosolic immunocontent of the NFB subunit p65, suggesting a decreased NFB activation in CAT-treated cells. Analysis of CAT treatment effect in redox parameters showed decreased intracellular thiol levels (-SH) and non-enzymatic antioxidant potential (TRAP) and increases the H2O2 production and glutathione levels (GSH). Among drugs tested (cisplatin, paclitaxel, 5-fluorouracil, daunorubicin, hydroxurea) (GI50), only paclitaxel and hydroxyurea showed increased production of H2O2 when compared with vehicle. However, co-treatement with CAT and paclitaxel had no alteration in the H2O2 production. Hydroxyurea plus CAT had a decreased in H2O2 production when compared with the drug alone. Cisplatin, alone had no effect in H2O2 production, but cisplatin plus CAT, had an increased in H2O2 production. Regarding the effectiveness of adjuvant CAT treatment in potentiate chemotherapeutic drugs cytotoxicities, we used de SRB assay and Calcusyn Software to access this interaction. From analyzes of combination index (CI) values, generated by CalcuSyn, we observed that with the exception of CAT plus paclitaxel, all combinations exhibited a synergistic effect. Taken together, data presented here suggest that adjuvant CAT treatment can act synergistically with chemotherapeutics and modulate tumorassociated signaling pathways providing a new therapeutic strategy for AdC therapy.

O câncer é uma das principais causas de morte em todo o mundo e o fator limitante na terapia antitumoral é a resistência a processos terapêuticos. Diversos são os mecanismos de resistência à drogas antitumorais e é fundamental desvendar os mecanismos envolvidos na quimiorresistência para eliminá-lo e ter-se uma melhor eficácia terapêutica. Nesse trabalho investigamos os mecanismos que determinam resistência a cisplatina em células de glioma. Primeiramente, mostramos que a resistência celular a cisplatina era independente de p53, capacidade de reparo de DNA. Utilizando modelo in vitro e in vivo foi demonstrado que os níveis de glutationa (GSH) tinha papel fundamental na resistência a cisplatina e temozolamida (TMZ). A linhagem de glioma resistente a TMZ tinha maior proteção antioxidante, maior expressão do fator de transcrição NRF2, GCLM e GST (envolvidos na geração e utilização de GSH). Utilizando modelo in vitro e in vivo mostramos que BSO (inibidor da síntese de GSH) potencializava o efeito tóxico do TMZ. Assim, a combinação de BSO com cisplatina e TMZ é uma abordagem poderosa para otimizar a citotoxicidade em tumores, sendo uma alternativa excitante para o tratamento de pacientes com glioma ou melanoma. / Cancer is one of main cause of death worldwide and the limiting factor is antitumoral therapy resistance. Several mechanisms command drug resistance and fundamental question is how is to unveil the mechanisms involved in it to get a better therapeutic efficacy. We investigated the mechanisms of cisplatin resistance in glioma cells. We demonstrated that cisplatin resistance was p53 independent and DNA repair capacity. It was demonstrated in a in vitro a in vivo model that gluthatione (GSH) is the major resistant factor for cisplatin and temozolomide (TMZ). We observed that the TMZ resistant glioma cell line counted with a high expression of the antioxidant transcription factor NFR2, GCLM and GST. We observed that NFR2 silencing greatly enhanced cell death, high levels of DNA damage upon TMZ treatment. In addition, BSO potentiated TMZ killing in human and murine melanoma using in vitro and in vivo models. Thus, combination of BSO, cisplatin and TMZ is a powerful strategy to optimize tumor killing, thus providing an exciting alternative therapeutic protocol to glioma and melanoma patients.

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第24831号 / 医博第4999号 / 新制||医||1067(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 山本, 洋介, 教授 武藤, 学, 教授 永井, 純正 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM