Agamaglobulinemia ligada ao X (XLA) é uma imunodeficiência primária caracterizada por ausência ou número reduzido de células B maduras em sangue periférico, de todos os isotipos de imunoglobulina e um aumento da susceptibilidade a infecções bacterianas e enterovirais graves. XLA é causada por mutações no gene Bruton\'s tirosino quinase, que codifica um membro da proteína da família das tirosino quinases citoplasmáticas que tem papel vital na modulação de muitos processos celulares. Neste estudo foram analisados trinta e três pacientes quanto à presença de mutações de BTK, por SSCP/HA e seqüenciamento. A análise da expressão foi realizada pela técnica por PCR em tempo real. Foram encontradas mutações do tipo stop codons, substituições de aminoácido, defeitos de splicing, pequenas deleções/inserções e frameshift nestes pacientes afetando os domínios PH, SH3, SH2 e o domínio da quinase da proteína. A análise da expressão mostrou níveis baixos nos pacientes com mutação do tipo stop codon, e nas outras mutações, os níveis de expressão foram de aproximadamente 15% e se correlacionaram com os tipos de mutação. / X-linked Agammaglobulinemia (XLA) is a primary immunodeficiency characterized by the absence or decreased numbers of mature B cells in peripheral blood, and by a lack of all immunoglobulin isotypes, leading to an increased susceptibility to severe bacterial and enteroviral infections. XLA is caused by mutations in the gene encoding for Bruton\'s tyrosine kinase (BTK), a protein member of the Tec family of cytoplasmic tyrosine kinases and plays a vital modulation role in many cellular processes. In this study thirty-three patients were analyzed for the presence of BTK mutations by SSCP/HA and sequencing. The expression analysis was carried out by the technique of Real-Time PCR. It was found mutations of the stop codons type, amino acid substitutions, splice defects, small deletions/insertions and frameshift in these patients affecting the PH, SH3, SH2 and tyrosine kinase domains of protein. The expression levels were very low in the patients with stop codon mutations, and in the other mutations, the expression levels were about 15% and were correlated with the mutation types.

Agamaglobulinemia ligada ao X (XLA) é uma imunodeficiência primária caracterizada por ausência ou número reduzido de células B maduras em sangue periférico, de todos os isotipos de imunoglobulina e um aumento da susceptibilidade a infecções bacterianas e enterovirais graves. XLA é causada por mutações no gene Bruton\'s tirosino quinase, que codifica um membro da proteína da família das tirosino quinases citoplasmáticas que tem papel vital na modulação de muitos processos celulares. Neste estudo foram analisados trinta e três pacientes quanto à presença de mutações de BTK, por SSCP/HA e seqüenciamento. A análise da expressão foi realizada pela técnica por PCR em tempo real. Foram encontradas mutações do tipo stop codons, substituições de aminoácido, defeitos de splicing, pequenas deleções/inserções e frameshift nestes pacientes afetando os domínios PH, SH3, SH2 e o domínio da quinase da proteína. A análise da expressão mostrou níveis baixos nos pacientes com mutação do tipo stop codon, e nas outras mutações, os níveis de expressão foram de aproximadamente 15% e se correlacionaram com os tipos de mutação. / X-linked Agammaglobulinemia (XLA) is a primary immunodeficiency characterized by the absence or decreased numbers of mature B cells in peripheral blood, and by a lack of all immunoglobulin isotypes, leading to an increased susceptibility to severe bacterial and enteroviral infections. XLA is caused by mutations in the gene encoding for Bruton\'s tyrosine kinase (BTK), a protein member of the Tec family of cytoplasmic tyrosine kinases and plays a vital modulation role in many cellular processes. In this study thirty-three patients were analyzed for the presence of BTK mutations by SSCP/HA and sequencing. The expression analysis was carried out by the technique of Real-Time PCR. It was found mutations of the stop codons type, amino acid substitutions, splice defects, small deletions/insertions and frameshift in these patients affecting the PH, SH3, SH2 and tyrosine kinase domains of protein. The expression levels were very low in the patients with stop codon mutations, and in the other mutations, the expression levels were about 15% and were correlated with the mutation types.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:46:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Introdução: A ImunodefiCiência Comum Variavel (ICV) e a Agamaglobulinemia Ligada ao X (XLA) sao imunodefiCiências primarias (IDP´s) classificadas como defiCiências de anticorpos resultando em hipogamaglobulinemia. Em semelhanca com outras doencas cronicas, as IDPÆs podem cursar com disturbios inflamatorios, endocrinos e com a exacerbacao do estresse oxidativo. Com a melhoria nos protocolos de atendimento clinico houve impacto positivo na sobrevida destes pacientes, surgindo assim preocupacao com o risco para o desenvolvimento de outras doencas cronicas, como as cardiovasculares. Objetivos: Avaliar o perfil lipidico e a concentracao serica da apolipoproteina A-I (apo A-I) e da particula pequena e densa do LDL-c (sdLDL), e relaciona-las com biomarcadores associados ao risco de doenca cardiovascular dos pacientes com ICV e XLA. Casuistica e Metodos: Foram avaliados, por meio de estudo transversal e controlado, 24 pacientes atendidos no Departamento de Pediatria da UNIFESP e 12 controles saudaveis pareados por idade e sexo com os pacientes. Foram realizadas a avaliacao antropometrica e dosagens sericas de colesterol total (CT) e as fracoes HDL-c e LDL-c, com analise da apo A-I e quantificacao de sdLDL, triglicerideos (TG), proteina C reativa (CRP), fator de necrose tumoral alfa (TNF-alfa) e as enzimas relacionadas ao risco cardiovascular mieloperoxidase (MPO), proteina de transferencia de ester de colesterol (CETP) e a lecitina colesterol aciltransferase (LCAT). Resultados: As concentracoes da CRP (p=0,008) e TNF-alfa (p<0,001) foram significativamente mais elevadas, enquanto o HDL-c (p=0,025) e a apo A-1 (p=0,013) foram significantemente mais baixas nos pacientes comparativamente aos controles. No grupo de pacientes foi observada correlacao negativa e significante entre o HDL-c e o TNF-alfa (r=-0,406; p=0,049) e os TG (r=-0,641; p=0,001). Verificou-se diferenca estatisticamente significante para a idade (p= 0,024), indice de massa corporal (p=<0,001), circunferencia abdominal (p=0,001), TG (p=0,020), MPO (p=0,036) e TNF-alfa (p=0,045) quando se comparou entre os pacientes a presenca ou nao de dislipidemia para HDL-c. Conclusao: Os pacientes com IDPÆs demonstraram risco cardiovascular elevado caracterizado pela elevacao de marcadores inflamatorios em associacao com enzimas que participam da oxidacao de lipoproteinas. A identificacao precoce dessas alteracoes permite o estabelecimento de medidas de prevencao e tratamento visando a reducao do risco cardiovascular nesses pacientes / FAPESP: 2011/13336 / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Orientador: Maria Marluce dos Santos Vilela / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-15T09:35:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ramalho_VanessaDomingues_M.pdf: 1157730 bytes, checksum: 0cd719050713e1b2340be47d4d5f5b38 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A agamaglobulinemia ligada ao X (XLA; OMIM#300755) é uma imunodeficiência primária humoral caracterizada por um bloqueio na diferenciação dos linfócitos B na medula óssea, levando à profunda hipogamaglobulinemia e reduzido número ou ausência de células B periféricas. Os pacientes com XLA são susceptíveis a infecções recorrentes por bactérias encapsuladas e enterovírus devido à deficiência de anticorpos. Mutações no gene codificante da tirosina quinase de Bruton (Btk) são responsáveis pela doença. Btk é uma tirosina quinase citoplasmática da família Tec importante no desenvolvimento, na diferenciação e na sinalização dos linfócitos B. A detecção de mutações no gene btk possibilita o diagnóstico definitivo de XLA. O objetivo deste estudo foi identificar e caracterizar mutações em btk. Foram incluídos 6 pacientes conforme os critérios do PAGID e ESID: indivíduos do sexo masculino com menos de 2% de linfócitos B periféricos, hipogamaglobulinemia e história de infecções bacterianas de repetição. A triagem de mutações foi realizada com a técnica de SSCP e possíveis mutações foram confirmadas por seqüenciamento. A expressão de Btk nos pacientes e mães foi avaliada em monócitos por citometria de fluxo. Dentre os pacientes analisados as principais manifestações clínicas foram as infecções do trato respiratório. Todos tiveram início dos sintomas durante o primeiro ano de vida, linfócitos B periféricos abaixo de 2% e hipogamaglobulinemia anterior ao início da terapia de reposição de imunoglobulinas. Foram identificadas cinco mutações em btk, três novas (p.Ala347fsX55, p.I355T e p.Thr324fsX24) e duas já descritas na literatura (p.Q196X e p.E441X). A detecção das mutações nos pacientes permitiu a análise mutacional de mães, avós e tias maternas. Três mães e uma avó foram confirmadas portadoras de XLA. Em adição, os valores de expressão de Btk obtidos mostraram deficiência da proteína (4,5% a 65,2%) nos pacientes e um padrão bimodal de expressão de Btk foi observado nas mães, indicando o estado de portadora de XLA. Em um dos pacientes não foi identificada mutação, entretanto a expressão de Btk mostrou-se reduzida. O uso combinado da análise genética e da avaliação da expressão de Btk por citometria de fluxo possibilitou o diagnóstico definitivo de XLA e a identificação de portadoras da doença. / Abstract: X-linked agammaglobulinemia (XLA; OMIM# 300755) is a primary humoral immunodeficiency characterized by a block in early B cell differentiation, leading to profound hypogammaglobulinemia and few or no circulating B cells. Patients with XLA are susceptible to recurrent infections by encapsulated bacteria and enteroviruses due to antibody deficiency. Mutations in the Bruton tyrosine kinase (Btk) gene have been identified as responsible for XLA. Btk is a cytoplasmic tyrosine kinase of the Tec family important in B-lymphocyte development, differentiation, and signaling. Detection of a btk mutation allows definitive diagnosis of XLA. The aim of this study was to identify and characterize mutations in btk. Six patients were included according to the criteria of PAGID and ESID: males with less than 2% of circulating B cells, hypogammaglobulinemia and a history of recurrent bacterial infections. Mutation screening was performed with SSCP technique and possible mutations were confirmed by sequencing. Expression of Btk protein in patients and mothers was assessed in monocytes by flow cytometry. The major clinical manifestations among patients were respiratory tract infections. All had onset of symptoms during the first year of life, circulating B cells below 2% and hypogammaglobulinemia before the start of immunoglobulin replacement therapy. We identified five mutations in btk, three novel (p.Ala347fsX55, p.I355T and p.Thr324fsX24) and two recurrent mutations (p.Q196X and p.E441X). The btk mutations detection in patients enabled the screening of mothers, grandmothers and maternal aunts. Three mothers and one grandmother were confirmed XLA carriers. In addition, flow cytometric evaluation of Btk expression in monocytes revealed that Btk deficiency (4,5% a 65,2%) was present in patients and a bimodal pattern of Btk expression was observed in mothers, indicating that they were XLA carriers. In one patient no mutation was identified, but his Btk expression was reduced. The combined use of genetic analysis and flow cytometric assay of Btk protein expression allowed the definitive diagnosis of XLA and its carriers detection. / Mestrado / Saude da Criança e do Adolescente / Mestre em Saude da Criança e do Adolescente

Orientador: Maria Marluce dos Santos Vilela / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-24T17:02:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ramalho_VanessaDomingues_D.pdf: 1441004 bytes, checksum: a45d3f4f8825288e2959115ef25fc13a (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A agamaglobulinemia ligada ao X (XLA; OMIM#300755) é caracterizada por um bloqueio na diferenciação dos linfócitos B na medula óssea, levando à profunda hipogamaglobulinemia e reduzido número ou ausência de linfócitos B periféricos. Os pacientes são susceptíveis a infecções recorrentes por bactérias encapsuladas e enterovírus. XLA é causada por mutações no gene da tirosina quinase de Bruton (BTK). Contudo, não há estudos de relação entre expressão protéica e o tipo de mutação, nem sobre as conseqüências da retenção intracelular do excesso de proteínas mal formadas. Os objetivos deste trabalho foram avaliar a expressão de BTK e sua relação com o tipo de mutação em pacientes com XLA, assim como verificar suas conseqüências nos sensores de estresse do retículo endoplasmático. O diagnóstico de XLA foi baseado em infecções recorrentes, níveis significativamente reduzidos de IgM, IgG e IgA, linfócitos B circulantes <2% e mutação identificada no gene BTK. A expressão dos transcritos de BTK foi avaliada por PCR quantitativo em tempo real em oito pacientes XLA e oito controles. Pela mesma técnica, foi avaliada a expressão de 10 genes do estresse do retículo endoplasmático em seis pacientes e seis controles. Foram caracterizadas quatro mutações missense, uma mutação nonsense, dois frameshifts e um defeito em sítio de splicing. As mutações do tipo nonsense, frameshift e defeito em sítio de splicing levaram à formação de stop codon prematuro. Foi detectado um perfil de expressão de BTK diferenciado nos pacientes com mutações com stop codon prematuro em comparação aos pacientes com mutações missense e controles saudáveis. Especificamente, os pacientes com mutações com stop codon prematuro apresentaram redução da expressão de BTK (P = 0,004). No entanto, verificamos que as mutações missense não afetaram a expressão de BTK. Por meio de imunocitoquímica, encontramos que as mutações com stop codon prematuro levaram à deficiência da expressão da proteína BTK e as do tipo missense resultaram na localização anormal da proteína no citoplasma celular, o que evidencia a síntese de proteína não funcional. Os pacientes com XLA apresentaram expressão aumentada do marcador de estresse do retículo endoplasmático XBP1 (P = 0,002). Em conclusão, a quantificação da expressão de mRNA para BTK é uma ferramenta para diferenciar as conseqüências mutacionais em pacientes com XLA. Ela também pode contribuir para o estudo de transcritos em outras doenças genéticas com diferentes tipos de mutação. Este é o primeiro relato de estresse do retículo endoplasmático na agamaglobulinemia ligada ao X / Abstract: X-linked agammaglobulinemia (XLA, OMIM # 300755) is characterized by a block in differentiation of B lymphocytes in the bone marrow, leading to profound hypogammaglobulinemia and few or no peripheral B lymphocytes. Patients are susceptible to recurrent infections by encapsulated bacteria and enteroviruses. XLA is caused by mutations in the Bruton tyrosine kinase gene (BTK). However, there have been no studies on the relationship between protein expression and the type of mutation, nor on the consequences of the disruption of protein folding that results in intracellular retention. The objectives of this study were to evaluate BTK expression and its mutation type in patients with XLA, as well as to verify their consequences on the endoplasmic reticulum stress sensors. The XLA diagnosis was based on recurrent infections, significantly reduced levels of IgM, IgG and IgA, circulating B lymphocytes <2% and BTK gene mutation identified. The expression of BTK transcripts was assessed by quantitative real-time PCR in eight XLA patients and eight control subjects. By the same technique, the expression of 10 endoplasmic reticulum stress genes was measured in six patients and six controls. Four missense mutations, one nonsense mutation, two frameshifts and a splice site defect were characterized. Mutations of the nonsense type, frameshift and splice site defect led to a premature stop codon formation. A differential profile of expression of BTK was detected in patients with mutations that led to a premature stop codon compared to patients with missense mutations and healthy controls. Specifically, patients with mutations resulting in a premature stop codon exhibited reduced expression of BTK gene (P = 0.004). However, it was found that missense mutations did not affect BTK expression. By immunocytochemistry, we found that mutations with a premature stop codon impaired expression of BTK protein and that missense mutations led to an abnormal localization of the protein in the cell cytoplasm, showing the synthesis of a non-functional protein. Patients with XLA showed increased expression of the endoplasmic reticulum stress marker XBP1 (P = 0.002). In conclusion, the quantification of mRNA expression for BTK is a tool to differentiate mutational consequences in patients with XLA. It can also contribute to the study of transcripts in other genetic diseases with different types of mutation. This is the first report on endoplasmic reticulum stress in X-linked agammaglobulinemia / Doutorado / Saude da Criança e do Adolescente / Doutora em Ciências