Le récepteur aux hydrocarbures aromatiques (AhR) est un facteur de transcription de la famille bHLH/PAS, activé par différents ligands exogènes dont les hydrocarbures aromatiques polycycliques ou halogénés (dioxines). A ce titre, il est décrit historiquement comme un récepteur de xénobiotiques dont le principal rôle est l’élimination de ces composés via la régulation des enzymes du métabolisme des xénobiotiques. Toutefois, des études récentes menées à l’aide de modèles souris invalidées pour le AhR, suggèrent indirectement que cette protéine régule des fonctions endogènes, notamment dans le système nerveux de mammifères dans lequel aucun rôle du AhR n’a jusqu’à présent été démontré. Nous avons donc utilisé le modèle de souris C57BL/6J AhR-/- pour mener à la fois des études comportementales et mécanistiques afin de déterminer ce rôle. Tout d’abord, nous avons identifié un défaut oculomoteur chez les souris AhR-/-, caractérisé par des mouvements spontanés horizontaux. En étudiant l’ensemble des circuits neurosensoriels potentiellement impliqués dans ce nystagmus pendulaire, nous avons montré que son origine est liée à des déficits du système visuo-moteur. De plus, en caractérisant et comparant les profils d’expression génique des cervelets de souris AhR+/+ et AhR-/- traitées ou non par de la 2,3,7,8 TétraChloroDibenzo-p-Dioxine (TCDD), nous avons montré que ce polluant, ligand du AhR, perturbait les fonctions endogènes du récepteur. Cet effet de « perturbation endogène » a été retrouvé dans un autre organe et est associé à une toxicité (fibrose hépatique). Cette étude a permis d’identifier de nouvelles fonctions physiologiques du AhR dans le système nerveux des souris, de caractériser un nouveau modèle animal de nystagmus pendulaire et ouvre de nouvelles perspectives de travail en neurotoxicologie. / The AhR is a basic helix-loop-helix Per/ARNT/Sim family (bHLH-PAS) transcription factor which is activated by many diverse compounds including polyphenols and aromatic hydrocarbons such as 2,3,7,8 TétraChloroDibenzo-p-Dioxin (TCDD). Initially, the AhR was described as a ubiquitous xenobiotic-activated transcription factor which promotes the elimination of xenobiotics by regulating the expression of genes involved in xenobiotic metabolism. However, mouse AhR knockout models have demonstrated that the AhR also regulates other normal physiological functions. In particular, functioning of the nervous system of mammals, previously unexplored in this respect, might depend upon the activity of the AhR. We, thus, performed behavioral and gene expression studies in AhR-/- mice to discover these functions. We, first, found that AhR-/- mice exhibit an oculomotor deficit which is characterized by spontaneous horizontal pendular eye movements that are probably due to a deficit in the visuo-motor circuitry. Second, we found that the cerebellar gene expression profiles of AhR-/- as compared to AhR+/+ mice resembled those of AhR+/+ mice treated with TCDD (the ligand with the highest affinity for the AhR). This suggests that TCDD disrupts some normal physiological functions of the AhR in the nervous system. Third, AhR-/- mice and AhR+/+ treated with TCDD both develop liver fibrosis. This further suggests a role for the AhR in normal liver function. In conclusion, this study reveals new physiological functions for the AhR in the mouse nervous system and describes a new model of pendular nystagmus. Moreover, the results also provide novel research perspectives in the field of neurotoxicology.

L'insuffisance rénale chronique (IRC) se caractérise par la diminution progressive et irréversible des fonctions renales. Elle s'accompagne d'une accumulation d'un ensemble de toxines responsable du syndrome urémique. Le syndrome urémique touche tous les organes, et de façon préoccupante le système cardiovasculaire. Il est associé à une dysfonction endothéliale, à la production d'un stress oxydant et d'une inflammation. L'objectif de cette thèse était d'identifier les mécanismes moléculaires responsables des complications du syndrome urémique. La première partie a tenté d'identifier des épissages alternatifs associés à l'IRC. Deux épissages alternatifs ont été identifiés. Cependant, le petit nombre d'épissages alternatifs trouvé au vue du nombre de gènes étudiés, nous permet de conclure que si l'IRC peut être responsable de l'apparition d'épissages alternatifs, ce phénomène n'est pas déterminant dans la régulation de l'expression des gènes responsable des complications de l'IRC. Dans la deuxième partie, nous avons montré par une étude clinique que le taux d'une toxine urémique, l'acide indole acétique (IAA), était associé à la mortalité et à la survenue d'événements cardio-vasculaires. In vitro, l'IAA induit un stress oxydant et un signal inflammatoire par l'induction de la cyclooxygénase 2 (COX-2). Une voie inflammatoire non génomique impliquant aryl hydrocarbon receptor (AhR), p38 MAPK et NF-κB est responsable de l'induction de la COX-2 endothéliale par l'IAA. Nos travaux ont identifié de nouvelles cibles thérapeutiques dont la modulation pourrait avoir un impact sur la mortalité cardiovasculaire des patients présentant une maladie rénale chronique. / Chronic kidney disease (CKD) is characterized by an irreversible decrease in kidney functions. Accumulation of uremic toxins is implicated in the uremic syndrome. Uremic syndrome affects all organs and particularly the cardiovascular system. The aim of this thesis was to identify and understand the molecular mechanisms implicated in the uremic syndrome.The first part attempted to ascertain the existence of alternative splice events associated with CKD. Two alternative splicing were identified. The small number of alternative splice events highlighted allows us to conclude that this phenomenon does not seem to be a key event in the modulation of gene expression during CKD.In the second part of this work, we demonstrated that the plasmatic concentration of an uremic toxin, Indole-3-acetic acid (IAA), is associated with all-cause mortality and major cardiovascular events. In vitro, we demonstrated that IAA induced endothelial cyclooxygenase-2 expression and endothelial oxidative stress production. IAA activated an endothelial Aryl hydrocarbon receptor/P38MAPK/NF-κB pathway. The activation of this inflammatory AHR dependant pathway could play a critical role in the increase of cardiovascular morbidity and mortality observed during CKD.Our work provides new therapeutic targets. The modulation of their activation could reduce cardiovascular mortality in patients with chronic kidney disease.

Le sol est une ressource rare remplissant de nombreuses fonctions nécessaires au bon fonctionnement des écosystèmes et de nos sociétés. Malgré tout, il subit des pressions anthropiques à l’origine de sa déterioration. Ainsi en Europe, 16% du territoire est sujet à des degradations des sols. Une des menaces affectant l’homeostasie des sols est la contamination chimique issue des sites à activités industrielles. Ces sites contaminés, estimés au nombre 2,5 millions en Europe sont à l’origine d’un risque pour la santé humaine et environnementale. Malheureusement, à l’heure actuelle, il n’existe pas de cadre réglementaire européen commun concernant la gestion de ces sites, dont les diagnostics sont réalisés uniquement sur des listes restreintes de molécules et les polluants prioritaires. Cependant, la contamination des sols est généralement issue de mélanges complexes dont la toxicité est due à un ensemble de contaminants. L’objectif de cette thèse concerne l’identification de composés à l’origine de la toxicité des sols pollués en appliquant une analyse dirigée par l’effet (EDA), une technique qui combine des analyses biologiques et chimiques à un fractionnement physico-chimique. Après le développement de l’EDA pour les matrices solides, cette approche a été utilisée sur site afin d’identifier des composés liant le recepteur des hydrocarbures aromatiques (AhR). Ceci à permis de mettre au jour des contaminants à activité biologique non pris en compte dans les diagnostics des sols pollués tels que des hydrocarbures aromatiques polycycliques non prioritaires selon l’US-EPA, leurs produits d’oxydation ainsi que des composés contenant des N-,S-,O-Heterocyles. / The soil is a scarce resource fulfilling many functions necessary for the proper functioning of ecosystems and societies. Nevertheless, it suffers human pressures causing its deterioration. In Europe, 16% of the territory is subject to soil degradations. One of the threats to the soil homeostasis is the chemical contamination from industrial activity sites. These contaminated sites, estimated to number of 2.5 million in Europe are causing a risk to human and environmental health. Unfortunately, at present there is no common European regulatory framework for the management of these sites, whose diagnoses are made only on short lists of molecules and priority pollutants. However, soil contamination generally comes from complex mixtures whose toxicity is due to a combination of contaminants. The aim of this work concerns the identification of compounds responsible for the toxicity of the contaminated soil by applying an effect-directed analysis (EDA), a technique which combines biological and chemical analyzes to a physico-chemical fractionation. After the development of EDA on the solid matrices, this approach has been used on polluted sites to identify the compounds binding to the aryl hydrocabon receptor (AhR). This allowed to highlight contaminants with a biological activity not included in the diagnoses of polluted soils such as polycyclic aromatic hydrocarbons non-priority according to US-EPA, their oxidation products and compounds containing N -, S-, O-heterocycles.

Em alguns casos, pacientes que sobreviveram a uma sepse grave podem desenvolver um quadro de imunossupressão, caracterizado pela expansão dos linfócitos T reguladores (Tregs). Porém, apesar de inúmeros avanços, os mecanismos associados à expansão das Tregs, ainda não estão completamente esclarecidos. Nesse sentido, trabalhos recentes demonstraram que a atividade da enzima Indoleamina 2,3-Dioxigenase (IDO), responsável pela formação da quinurenina a partir da degradação do aminoácido essencial triptofano, está relacionada à diferenciação das Tregs e com o desenvolvimento de um quadro de tolerância. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi investigar o papel da IDO no desenvolvimento da imunossupressão induzida pela sepse. Os resultados demonstraram um aumento da expressão proteica e da atividade enzimática da IDO no baço de camundongos que sobreviveram à sepse grave. Para avaliar o desenvolvimento da imunossupressão, os camundongos foram desafiados com células do melanoma B16-F10. A inibição farmacológica da IDO promoveu redução do crescimento tumoral nos camundongos que sobreviveram à sepse, por um mecanismo dependente da redução na diferenciação das Tregs e das células C11b+ Ly6G+ no baço e da ativação de células CD8+ produtoras de IFN- ?, no linfonodo drenate da região tumoral. Adicionalmente, foi demonstrado que, o receptor de hidrocarbonetos de arila (AhR) está associado ao aumento da expressão da IDO, nos camundongos que sobreviveram à sepse. Ainda, os resultados demonstraram que células CD11C+ são as principais responsáveis por expressar a IDO no baço de camundongos que sobreviveram à sepse. Por fim, células CD11C+ isoladas do baço de camundongos que sobreviveram a sepse, foram mais efetivas em induzir a diferenciação das Tregs quando comparadas a células CD11C+ provenientes de camundongos naive. Em conjunto, os resultados sugerem que a ativação do AhR pela quinurenina é importante para expressão da IDO nas células CD11C+ encontradas no baço de camundongos que sobreviveram à sepse, o que por sua vez, está associado com a expansão das Tregs e com o desenvolvimento do quadro de imunossupressão. / Immunosuppression has been shown to be one long-term sequels of severe sepsis, which is mainly characterized by the expansion of regulatory T cells (Tregs). However, the mechanisms underlying Tregs expansion after sepsis remain poor understood. Indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), an enzyme that initiates the kynurenine pathway of tryptophan degradation, has been implicated in promoting Tregs generation. Therefore, we propose to investigate the role of IDO in the development of sepsis-induced immunosuppression. The results presented here demonstrated that there is an increase in both IDO protein expression and IDO enzymatic activity in spleen of sepsis-surviving mice. Employing a melanoma mouse model as a second challenge in sepsis-surviving mice, we found that pharmacological inhibition of IDO suppressed the enhanced tumor growth observed in sepsis-surviving mice. Importantly, inhibition of IDO decreased the expansion of Tregs in sepsis-surviving mice, leading to reduced CD11b+ Ly6G+ cells frequency in spleen and activation of INF-? production by CD8+ in draining lymph, after tumor challenge. Moreover, the results suggest that aryl hydrocarbon receptor (AhR) is associated with increased IDO expression found in sepsis-surviving mice. Furthermore, we identified that a CD11C+ population of cells are expressing IDO in spleen of sepsis surviving mice. In addition, CD11C+ cells isolated from spleen of sepsis-surviving mice, presented a higher capacity to induce a regulatory phenotype in naïve CD4+ CD25- T than CD11C+ isolated from naïve mice. Taken together, our results suggest that AhR activation by kynurenine during acute phase of sepsis is important to IDO expression in a specific CD11C+. This new sepsis-induced CD11C+ IDO+ population is important to Treg cells expansion and immunosuppression development in sepsis-surviving mice.

Em alguns casos, pacientes que sobreviveram a uma sepse grave podem desenvolver um quadro de imunossupressão, caracterizado pela expansão dos linfócitos T reguladores (Tregs). Porém, apesar de inúmeros avanços, os mecanismos associados à expansão das Tregs, ainda não estão completamente esclarecidos. Nesse sentido, trabalhos recentes demonstraram que a atividade da enzima Indoleamina 2,3-Dioxigenase (IDO), responsável pela formação da quinurenina a partir da degradação do aminoácido essencial triptofano, está relacionada à diferenciação das Tregs e com o desenvolvimento de um quadro de tolerância. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi investigar o papel da IDO no desenvolvimento da imunossupressão induzida pela sepse. Os resultados demonstraram um aumento da expressão proteica e da atividade enzimática da IDO no baço de camundongos que sobreviveram à sepse grave. Para avaliar o desenvolvimento da imunossupressão, os camundongos foram desafiados com células do melanoma B16-F10. A inibição farmacológica da IDO promoveu redução do crescimento tumoral nos camundongos que sobreviveram à sepse, por um mecanismo dependente da redução na diferenciação das Tregs e das células C11b+ Ly6G+ no baço e da ativação de células CD8+ produtoras de IFN- ?, no linfonodo drenate da região tumoral. Adicionalmente, foi demonstrado que, o receptor de hidrocarbonetos de arila (AhR) está associado ao aumento da expressão da IDO, nos camundongos que sobreviveram à sepse. Ainda, os resultados demonstraram que células CD11C+ são as principais responsáveis por expressar a IDO no baço de camundongos que sobreviveram à sepse. Por fim, células CD11C+ isoladas do baço de camundongos que sobreviveram a sepse, foram mais efetivas em induzir a diferenciação das Tregs quando comparadas a células CD11C+ provenientes de camundongos naive. Em conjunto, os resultados sugerem que a ativação do AhR pela quinurenina é importante para expressão da IDO nas células CD11C+ encontradas no baço de camundongos que sobreviveram à sepse, o que por sua vez, está associado com a expansão das Tregs e com o desenvolvimento do quadro de imunossupressão. / Immunosuppression has been shown to be one long-term sequels of severe sepsis, which is mainly characterized by the expansion of regulatory T cells (Tregs). However, the mechanisms underlying Tregs expansion after sepsis remain poor understood. Indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), an enzyme that initiates the kynurenine pathway of tryptophan degradation, has been implicated in promoting Tregs generation. Therefore, we propose to investigate the role of IDO in the development of sepsis-induced immunosuppression. The results presented here demonstrated that there is an increase in both IDO protein expression and IDO enzymatic activity in spleen of sepsis-surviving mice. Employing a melanoma mouse model as a second challenge in sepsis-surviving mice, we found that pharmacological inhibition of IDO suppressed the enhanced tumor growth observed in sepsis-surviving mice. Importantly, inhibition of IDO decreased the expansion of Tregs in sepsis-surviving mice, leading to reduced CD11b+ Ly6G+ cells frequency in spleen and activation of INF-? production by CD8+ in draining lymph, after tumor challenge. Moreover, the results suggest that aryl hydrocarbon receptor (AhR) is associated with increased IDO expression found in sepsis-surviving mice. Furthermore, we identified that a CD11C+ population of cells are expressing IDO in spleen of sepsis surviving mice. In addition, CD11C+ cells isolated from spleen of sepsis-surviving mice, presented a higher capacity to induce a regulatory phenotype in naïve CD4+ CD25- T than CD11C+ isolated from naïve mice. Taken together, our results suggest that AhR activation by kynurenine during acute phase of sepsis is important to IDO expression in a specific CD11C+. This new sepsis-induced CD11C+ IDO+ population is important to Treg cells expansion and immunosuppression development in sepsis-surviving mice.

Folate sind als Überträger von C1-Fragmenten verschiedener Oxidationsstufen direkt an der Nukleinsäuresynthese beteiligt und spielen somit eine entscheidende Rolle im Zellstoffwechsel. So kann ein suboptimaler Folatstatus zur Ausprägung einer klinischen Symptomatik führen, die sich primär in Zellen mit hoher Teilungsrate manifestiert. Dabei gilt die megaloblastäre Anämie als Leitsymptom für einen akuten Folatmangel. Herausragende Bedeutung besitzen Folate in der Schwangerschaft, wo ihnen bei der Entwicklung des fetalen Nervensystems eine besondere Rolle zukommt. Bei einem zu niedrigen Serumfolatspiegel der Mutter steigt das Risiko für embryonale Missbildungen wie Neuralrohrdefekte stark an. Die weitere medizinische Relevanz der Folate steht momentan im Fokus der Forschung, wie z. B. der protektive Effekt in Bezug auf bestimmte Krebsformen, die Risikoreduktion für verschiedene kardiovaskuläre Erkrankungen sowie Zusammenhänge zwischen dem Folatstatus und neurologischen Störungen (Alzheimer, Depressionen). Allerdings kann Folat als essentielles Vitamin von Säugetieren nicht selbst synthetisiert werden, sondern muss aus externen Quellen über den Verdauungstrakt aufgenommen werden. Die Resorption aus dem Darm erfolgt nach aktuellem Kenntnisstand insbesondere über den Reduced Folate Carrier (RFC, SLC19A1) und den Proton-Coupled Folate Transporter (PCFT, SLC46A1). Trotz der Existenz dieser spezifischen Transporter ist der Folatmangel des Menschen der häufigste Vitaminmangel in Mitteleuropa. Er lässt sich durch eine ausschließlich ernährungsphysiologische Problematik nur unzureichend erklären. Interessanterweise besitzen sowohl das PCFT-Gen als auch das RFC-Gen in ihrer Promoterregion verschiedene Regulationselemente, unter anderem auch funktionell aktive DREs (Dioxin Response Element), die als Bindungsstelle für einen ligandenaktivierten Transkriptionsfaktor, den nukleären Arylhydrocarbon-Rezeptor (AhR), dienen. DREs wurden bisher hauptsächlich bei fremdstoffmetabolisierenden Enzymen wie z. B. Cytochrom P450-Isoenzymen gefunden und vermitteln bekanntermaßen die toxischen und karzinogenen Effekte von AhR-Liganden. Von besonderem Interesse sind in diesem Zusammenhang ubiquitär verbreitete Umweltkontaminanten wie die polyzyklischen und die halogenierten aromatischen Kohlenwasserstoffe (PAK, HAK), da sie in der Umwelt sehr persistent sind und sich dadurch in der Lebensmittelkette anreichern. Infolgedessen wurde im Rahmen dieser Studie der mögliche Einfluss von AhR-Liganden wie TCDD (2,3,7,8-tetrachlordibenzo-p-dioxin) und B[a]P (Benzo[a]pyren) auf die carriervermittelte intestinale Folatresorption beim Menschen untersucht sowie die Regulation der Transportproteine RFC und PCFT auf transkriptioneller Ebene experimentell überprüft. Als adäquates in vitro Modell diente dabei die humane Kolonzelllinie LS180, für die zunächst eine Charakterisierung erfolgte. Mittels RT-PCR wurde der Nachweis erbracht, dass alle am Folattransport beteiligten Import-und Exportcarrier auf mRNA-Ebene exprimiert werden. Für die Transportproteine RFC und PCFT erfolgte über den Western Blot auch der Nachweis auf Proteinebene. Die Funktionalität der AhR-Signalkaskade, die über methylcholanthrenartige Induktoren wie TCDD zur Induktion von Cytochrom P450 führt, konnte im Folgenden mittels Ethoxyresorufin-O-deethylase-Assay (EROD) überprüft werden. Es zeigte sich nach Induktion mit TCDD (0,01 - 10 nM) oder B[a]P (0,01 - 1 μM) über 12 – 96 h ein hochsignifikanter, dosis- und zeitabhängiger Effekt auf die Cyp1A1 vermittelte Enzymaktivität der Ethoxyresorufin-O-deethylase in den LS180-Zellen. Dabei konnten ligandenabhängige Unterschiede im Induktionsmuster ermittelt werden. Im Anschluss wurde im intestinalen Zellmodell die initiale konzentrations- und zeitabhängige Folataufnahme bei pH 5.5 über funktionelle Aufnahmeversuche mit Tritium-markierter Folsäure untersucht und charakterisiert. Sie stellte sich als aktiver, sättigbarer Prozess dar, wobei in den unbehandelten LS180-Zellen ca. eine Verdreifachung der intrazellulären Radioaktivität über einen Zeitraum von 2,5 min beobachtet werden konnte. Als kinetische Parameter wurden ein Km-Wert von 27,91 μM sowie ein Vmax-Wert von 281,2 pmol/min berechnet. Nachfolgende Untersuchungen mit den spezifischen Inhibitoren Raltitrexed (RTX) und Pemetrexed (PMX) konnten zeigen, dass sowohl PCFT als auch RFC an der funktionellen Folsäureaufnahme bei einem pH-Wert von 5.5 in dem gewählten Versuchsaufbau beteiligt sind. Der RFC scheint jedoch einen etwas höheren Anteil an der Gesamtaufnahme zu haben als der PCFT. In LS180-Zellen, die vorher mit den Modellsubstanzen TCDD (1 bzw. 10 nM) oder B[a]P (0,1 bzw. 1 μM) über 24 - 120 h inkubiert wurden, konnte eine zeit- und dosisabhängige, statistisch signifikante Reduktion der carriervermittelten Folatresorption beobachtet werden, wobei die maximale Verminderung der Aufnahmerate ca. 75 % betrug. Da sich dieser Effekt durch die AhR-Antagonisten Salicylamid (SAL) und CH-223191 (CH) dosisabhängig umkehren ließ, erfolgt die Regulation vermutlich über den AhR-Signalweg. Um den Mechanismus der Regulation zu klären, wurde mit Hilfe der quantitativen qRT-PCR unter Verwendung von TaqMan-Sonden die Genexpression von RFC und PCFT nach Vorbehandlung mit 1 - 10 nM TCDD oder 0,1 – 1 μM B[a]P über 12 - 120 h untersucht. Analog zu den Aufnahmeversuchen konnte hier eine zeit- und dosisabhängige Reduktion beider Transporter auf transkriptioneller Ebene beobachtet werden. Auch führte eine Vorbehandlung mit CH und SAL wiederum zu einer Umkehr des Effektes, wobei CH wahrscheinlich einen ligandenselektiven AhR-Antagonisten darstellt. Zusammenfassend konnte durch die vorliegende Arbeit nachgewiesen werden, dass Cytochrom P450-Induktoren über die AhR-Signalkaskade die carriervermittelte Folatresorption in humanen Kolonzellen herabregulieren. Es erscheint anhand der gewonnen Erkenntnisse möglich, dass die Folathomoöstase durch verschiedene Umweltkontaminanten wie z. B. TCDD negativ beeinflusst werden kann und als Folge daraus auch eventuell der Folatmangel der Bevölkerung in Industrienationen zumindest teilweise erklärbar wird. Es ist darüber hinaus denkbar, dass auch andere Fremdstoffe die Folataufnahme beeinflussen, da große planare Strukturen häufig über den AhR-Weg wirken. Weiterführende Studien sind notwendig, um das Verständnis für den Einfluss von Umweltkontaminanten auf die intestinale Folataufnahme zu verbessern.

Folate sind als Überträger von C1-Fragmenten verschiedener Oxidationsstufen direkt an der Nukleinsäuresynthese beteiligt und spielen somit eine entscheidende Rolle im Zellstoffwechsel. So kann ein suboptimaler Folatstatus zur Ausprägung einer klinischen Symptomatik führen, die sich primär in Zellen mit hoher Teilungsrate manifestiert. Dabei gilt die megaloblastäre Anämie als Leitsymptom für einen akuten Folatmangel. Herausragende Bedeutung besitzen Folate in der Schwangerschaft, wo ihnen bei der Entwicklung des fetalen Nervensystems eine besondere Rolle zukommt. Bei einem zu niedrigen Serumfolatspiegel der Mutter steigt das Risiko für embryonale Missbildungen wie Neuralrohrdefekte stark an. Die weitere medizinische Relevanz der Folate steht momentan im Fokus der Forschung, wie z. B. der protektive Effekt in Bezug auf bestimmte Krebsformen, die Risikoreduktion für verschiedene kardiovaskuläre Erkrankungen sowie Zusammenhänge zwischen dem Folatstatus und neurologischen Störungen (Alzheimer, Depressionen). Allerdings kann Folat als essentielles Vitamin von Säugetieren nicht selbst synthetisiert werden, sondern muss aus externen Quellen über den Verdauungstrakt aufgenommen werden. Die Resorption aus dem Darm erfolgt nach aktuellem Kenntnisstand insbesondere über den Reduced Folate Carrier (RFC, SLC19A1) und den Proton-Coupled Folate Transporter (PCFT, SLC46A1). Trotz der Existenz dieser spezifischen Transporter ist der Folatmangel des Menschen der häufigste Vitaminmangel in Mitteleuropa. Er lässt sich durch eine ausschließlich ernährungsphysiologische Problematik nur unzureichend erklären. Interessanterweise besitzen sowohl das PCFT-Gen als auch das RFC-Gen in ihrer Promoterregion verschiedene Regulationselemente, unter anderem auch funktionell aktive DREs (Dioxin Response Element), die als Bindungsstelle für einen ligandenaktivierten Transkriptionsfaktor, den nukleären Arylhydrocarbon-Rezeptor (AhR), dienen. DREs wurden bisher hauptsächlich bei fremdstoffmetabolisierenden Enzymen wie z. B. Cytochrom P450-Isoenzymen gefunden und vermitteln bekanntermaßen die toxischen und karzinogenen Effekte von AhR-Liganden. Von besonderem Interesse sind in diesem Zusammenhang ubiquitär verbreitete Umweltkontaminanten wie die polyzyklischen und die halogenierten aromatischen Kohlenwasserstoffe (PAK, HAK), da sie in der Umwelt sehr persistent sind und sich dadurch in der Lebensmittelkette anreichern. Infolgedessen wurde im Rahmen dieser Studie der mögliche Einfluss von AhR-Liganden wie TCDD (2,3,7,8-tetrachlordibenzo-p-dioxin) und B[a]P (Benzo[a]pyren) auf die carriervermittelte intestinale Folatresorption beim Menschen untersucht sowie die Regulation der Transportproteine RFC und PCFT auf transkriptioneller Ebene experimentell überprüft. Als adäquates in vitro Modell diente dabei die humane Kolonzelllinie LS180, für die zunächst eine Charakterisierung erfolgte. Mittels RT-PCR wurde der Nachweis erbracht, dass alle am Folattransport beteiligten Import-und Exportcarrier auf mRNA-Ebene exprimiert werden. Für die Transportproteine RFC und PCFT erfolgte über den Western Blot auch der Nachweis auf Proteinebene. Die Funktionalität der AhR-Signalkaskade, die über methylcholanthrenartige Induktoren wie TCDD zur Induktion von Cytochrom P450 führt, konnte im Folgenden mittels Ethoxyresorufin-O-deethylase-Assay (EROD) überprüft werden. Es zeigte sich nach Induktion mit TCDD (0,01 - 10 nM) oder B[a]P (0,01 - 1 μM) über 12 – 96 h ein hochsignifikanter, dosis- und zeitabhängiger Effekt auf die Cyp1A1 vermittelte Enzymaktivität der Ethoxyresorufin-O-deethylase in den LS180-Zellen. Dabei konnten ligandenabhängige Unterschiede im Induktionsmuster ermittelt werden. Im Anschluss wurde im intestinalen Zellmodell die initiale konzentrations- und zeitabhängige Folataufnahme bei pH 5.5 über funktionelle Aufnahmeversuche mit Tritium-markierter Folsäure untersucht und charakterisiert. Sie stellte sich als aktiver, sättigbarer Prozess dar, wobei in den unbehandelten LS180-Zellen ca. eine Verdreifachung der intrazellulären Radioaktivität über einen Zeitraum von 2,5 min beobachtet werden konnte. Als kinetische Parameter wurden ein Km-Wert von 27,91 μM sowie ein Vmax-Wert von 281,2 pmol/min berechnet. Nachfolgende Untersuchungen mit den spezifischen Inhibitoren Raltitrexed (RTX) und Pemetrexed (PMX) konnten zeigen, dass sowohl PCFT als auch RFC an der funktionellen Folsäureaufnahme bei einem pH-Wert von 5.5 in dem gewählten Versuchsaufbau beteiligt sind. Der RFC scheint jedoch einen etwas höheren Anteil an der Gesamtaufnahme zu haben als der PCFT. In LS180-Zellen, die vorher mit den Modellsubstanzen TCDD (1 bzw. 10 nM) oder B[a]P (0,1 bzw. 1 μM) über 24 - 120 h inkubiert wurden, konnte eine zeit- und dosisabhängige, statistisch signifikante Reduktion der carriervermittelten Folatresorption beobachtet werden, wobei die maximale Verminderung der Aufnahmerate ca. 75 % betrug. Da sich dieser Effekt durch die AhR-Antagonisten Salicylamid (SAL) und CH-223191 (CH) dosisabhängig umkehren ließ, erfolgt die Regulation vermutlich über den AhR-Signalweg. Um den Mechanismus der Regulation zu klären, wurde mit Hilfe der quantitativen qRT-PCR unter Verwendung von TaqMan-Sonden die Genexpression von RFC und PCFT nach Vorbehandlung mit 1 - 10 nM TCDD oder 0,1 – 1 μM B[a]P über 12 - 120 h untersucht. Analog zu den Aufnahmeversuchen konnte hier eine zeit- und dosisabhängige Reduktion beider Transporter auf transkriptioneller Ebene beobachtet werden. Auch führte eine Vorbehandlung mit CH und SAL wiederum zu einer Umkehr des Effektes, wobei CH wahrscheinlich einen ligandenselektiven AhR-Antagonisten darstellt. Zusammenfassend konnte durch die vorliegende Arbeit nachgewiesen werden, dass Cytochrom P450-Induktoren über die AhR-Signalkaskade die carriervermittelte Folatresorption in humanen Kolonzellen herabregulieren. Es erscheint anhand der gewonnen Erkenntnisse möglich, dass die Folathomoöstase durch verschiedene Umweltkontaminanten wie z. B. TCDD negativ beeinflusst werden kann und als Folge daraus auch eventuell der Folatmangel der Bevölkerung in Industrienationen zumindest teilweise erklärbar wird. Es ist darüber hinaus denkbar, dass auch andere Fremdstoffe die Folataufnahme beeinflussen, da große planare Strukturen häufig über den AhR-Weg wirken. Weiterführende Studien sind notwendig, um das Verständnis für den Einfluss von Umweltkontaminanten auf die intestinale Folataufnahme zu verbessern.

L’ozone est un des polluants présents dans l’air que nous respirons. Les pics de ce polluant entrainent une augmentation des hospitalisations et des cas d’exacerbations d’asthme allergique. L’objectif de ce travail est d’étudier plus en détails les mécanismes inflammatoires mis en place après exposition à l’ozone. Cette étude s’est déroulée en trois axes, les deux premiers traitant du rôle de deux alarmines, l’IL-33 et l’IL-1α et le troisième se focalisant sur AhR, un récepteur impliqué dans la réponse à de nombreux polluants. Pour ce faire, des souris ont été exposées à l’ozone selon deux modèles, l’un aigu et l’autre chronique, puis les paramètres inflammatoires, le dommage tissulaire et les difficultés respiratoires ont été évalués. Nous montrons ici qu’une exposition aigüe à l’ozone induit la libération de molécules comme l’IL-33 et l’IL-1α. L’IL-33 agit au niveau de la barrière épithéliale, où elle permet l’expression et le maintien des jonctions serrées, qui sont augmentées en réponse à la pollution à l’ozone. L’IL-33 régule également l’infiltration des neutrophiles, alors que l’IL-1α l’induit. Ensuite nous avons montré que le récepteur AhR est activé après exposition chronique à l’ozone. AhR semble réguler la production de cytokines telles que l’IL-17A et l’IL-22 et ainsi protège d’une trop forte réponse inflammatoire. Pour conclure, nous avons montré que la production d’IL-33 et l’activation du récepteur AhR étaient nécessaires pour contrôler l’inflammation induite par l’ozone, alors que la production d’IL-1α l’induisait. Cette étude aura permis de mettre en évidence de potentielles cibles thérapeutiques pour soulager les maux provoqués par la pollution. / Ozone is a common ambient air polluant. Ozone peaks induce increase of asthma exacerbation, respiratory distress, emergencies and hospital admissions. The aim of this thesis project is to dissect inflammatory mechanisms induced after ozone exposure. This study is conducted according three axes, the first two dealing with the roles of two alarmines, IL-1α and IL-33 and the third is focused on the role of aryl hydrocarbon receptor (AhR), a receptor involved in several pollutant responses. Acute and chronic experimental models of ozone exposure were used to evaluate inflammatory parameters in lung, tissue damage and airway hyperresponsiveness. Here we show that acute ozone exposure induces IL-1α and IL-33 release. IL-33 acts on lung epithelial barrier, allowing the expression and maintenance of tight junctions induced after ozone exposure. Moreover, IL-33 represses neutrophils infiltration while IL-1α induces it. Furthermore we show that AhR is activated after chronic ozone exposure. AhR regulates cytokines production such as IL-17A and IL-22 and plays a protective role against higher inflammation. Overall, IL-33 production and AhR activation are necessary to control ozone-induced inflammation, in contrast to IL-1α. These findings highlight potential therapeutic targets for the treatment of lung inflammation following ozone exposure.

Long interspersed nuclear element-1 (L1) is a genetic element that mobilizes throughout the mammalian genome via retrotransposition and damages host DNA via mutational insertions, chromosomal rearrangements, and reprogramming of gene expression. The cellular mechanisms responsible for aberrant L1 expression during cancer pathogenesis are unclear. Previously, we have shown that L1 reactivation in several human cell lines is dependent upon the activation of aryl hydrocarbon receptor (AhR), a ligand-activated transcription factor member of the PAS superfamily of proteins. We also showed that ectopic expression of L1 reprograms the HepG2 genome leading to epithelial-to-mesenchymal transition (EMT). Here we present evidence that reactivation of L1 and modulation of EMT in HepG2 cells by the AhR ligand benzo(a)pyrene (BaP) is effected through the canonical TGF-β1 signaling pathway. BaP increased TGF-β1 mRNA, SMAD2 phosphorylation and decreased expression of E-Cadherin. The functional relevance of these interactions and the involvement of TGFBR1/ALK5 and SMAD2/3 were confirmed by siRNA interference. Furthermore, expression of L1-encoded ORF1p was positively correlated with the activation of TGF-β1 signaling in human hepatocarcinoma samples at various stages of malignant progression. These results indicate that ligand-mediated AhR activation regulates L1 via canonical TGF-β1 signaling and raise important questions about the molecular etiology of human hepatocarcinomas.

Pseudomonas aeruginosa (Pa) est un pathogène opportuniste responsable d’infections pulmonaires aigues graves chez les malades prédisposés. Devant l’émergence croissante de la résistance aux antibiotiques, le développement de thérapeutiques alternatives adjuvantes est indispensable et nécessite la compréhension des interactions hôte-pathogènes au cours de l’infection. La voie métabolique de dégradation du tryptophane appelée voie des kynurénines produit chez l’hôte des métabolites aux propriétés immunomodulatrices connues. Récemment, l’existence de cette voie a été mise en évidence chez Pa, bien que la nature et la quantité de métabolites produits ne soient pas parfaitement connus. La production bactérienne de kynurénines pourrait interférer avec la mise en place de la réponse immunitaire de l’hôte et sa régulation au cours des différentes phases de l’infection, altérant la balance immunitaire pulmonaire au profit du pathogène. A ce titre, la voie des kynurénines de Pa constituerait une cible thérapeutique potentielle. L’objectif de ce travail de thèse est d’étudier l’implication de la voie des kynurénines de Pa dans la virulence bactérienne et la réponse immune de l’hôte dans un modèle murin d’agression respiratoire aiguë. Pour cela, les souris sont infectées avec des souches sauvages de Pa, avec des souches mutantes ΔkynA, non productrices de kynurénines, et des souches ΔkynU, surproductrices de kynurénines. Les interactions potentielles avec la voie des kynurénines de l’hôte sont explorées en inhibant la première enzyme de la voie métabolique, l’indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO). Enfin, le rôle du récepteur arylhydrocarbone (AhR), récepteur connu des kynurénines et impliqué dans l’immunité pulmonaire, est exploré en comparant la réponse à l’infection de souris AhR KO à celle des souris sauvages. Dans ce travail, nous décrivons tout d’abord la production des différents métabolites de la voie des kynurénines de Pa in vitro et in vivo dans le modèle d’infection respiratoire aigue, en décrivant pour la première fois la production d’acide kynurénique et de 3-hydroxy-kynurénine pour cette bactérie. Ensuite, nous montrons que les kynurénines bactériennes interfèrent avec la réponse immune de l’hôte, en majorant le recrutement cellulaire alvéolaire, tout en atténuant le niveau d’inflammation et l’activation des cellules présentatrices d’antigènes. Enfin, nous rapportons que l’IDO et l’AhR sont impliqués dans cette immunomodulation, faisant des kynurénines bactériennes des agents du dialogue hôte-pathogène au cours de l’infection respiratoire aigue. A la lumière de ces résultats, la voie des kynurénines pourrait constituer une cible thérapeutique d’intérêt dans les infections respiratoires à P. aeruginosa. / Pseudomonas aeruginosa (Pa) is a Gram-negative bacteria frequently involved in healthcare-associated pneumonia and considered as a « problem-pathogen ». To face the announced post-antibiotic era due to increasing resistance and lack of new antibiotics, new treatment strategies have to be developed. During pneumonia, lung injury results from both bacterial-mediated virulence and host response. Modulation of an overreacting host response could be an alternative therapeutic target in Pa-induced lung infection. Kynurenines are small molecules resulting from tryptophan degradation with reported immunomodulatory properties. Pa is known to produce kynurenine, but the functional enzymes, types and amounts of secreted metabolites are poorly known. Interestingly, many host cells also possess the kynurenine pathway, whose metabolites are known to control immune system homeostasis. The following experiments aim to determine whether bacterial metabolites can interfere with the host’s immune response, leading to a possible immunomodulatory interplay between bacteria and host kynurenine pathways, impacting on the pathophysiology of P. aeruginosa infection. To that goal, we use a murin model of acute lung injury. Mice were infected with WT strain of Pa, compared to mutant strains unable to produce kynurenine (ΔkynA), and mutant strains overproducing them (ΔkynU). Moreover, we studied the interactions between bacterial and host kynurenine pathways by inhibiting the first enzyme of the host pathway called indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO). Finally, we assessed the role of the arylhydrocarbon receptor (AhR), a known receptor to kynurenine involved in lung immunity, using AhR KO mice. First, we assess types and levels of metabolites produced by Pa in an in vitro model, and the relevance of this production in vivo. We show for the first time that Pa is able to secrete kynurenine at clinically relevant levels, and other metabolites such as kynurenic acid and 3 OHkynurenine, what was unknown to date. Second, we show that bacterial metabolites were able to modulate the host innate immune response, by increasing alveolar recruitment of neutrophils, associated with decreased inflammatory cytokines levels and impairment of antigen-presenting cells activation. Finally, we report that IDO and AhR are involved in this kynurenine-mediated immunomodulation. These data suggest that pulmonary infection with a bacteria highly expressing the kynurenine pathway enzymes could lead to an imbalance in the immune response to infection, thus constituting a potential therapeutic target to improve Pa-induced pneumonia outcome.