Submitted by Sandra Pereira (srpereira@ufrrj.br) on 2017-01-11T12:09:07Z No. of bitstreams: 1 2016 - Joao Bosco Varela.pdf: 1890246 bytes, checksum: 359c15e2f52f2ea873d394cbbfa5479c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-11T12:09:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016 - Joao Bosco Varela.pdf: 1890246 bytes, checksum: 359c15e2f52f2ea873d394cbbfa5479c (MD5) Previous issue date: 2016-02-24 / The study of ticks and tick-borne disease is increasingly dependent upon the use of molecular biological techniques that are employed in pathogen detection and for the accurate identification of ticks, particularly immature stages. The successful application of molecular methods, principally the polymerase chain reaction (PCR), can only be achieved if the DNA present in the tick was effectively preserved and could be extracted efficiently. The current study compared three fixatives (RNAlater, zinc salts (ZN) and isopropanol) for the ability to preserve the nuclear and mitochondrial (mt) DNA of larvae and nymphs of Amblyomma parvum and larvae of Amblyomma scultptum. DNA was extracted from ticks at times between 72h to 12 months post fixation using a phenol-chloroform procedure and examined using PCR assays for nuclear (internal transcribed spacer 2; ITS2) and mitochondrial (12S rDNA, subunit 1 of cytochrome c oxidase (COI) and D-loop) sequences. The efficiency of amplification was analyzed quantitatively (number of samples which produced amplicon) and qualitatively (relative intensity of bands observed on agarose gels). It was observed that the ITS2 sequence could be amplified in the majority (93,39%, n= 283/303) of the samples, in each of the three fixatives, although qualitative differences were observed, particularly with A. sculptum preserved in ZN. In contrast, fixation in isopropanol effectively abolished the ability to amplify the mitochondrial marker sequences of A. parvum and also resulted in inferior amplification (qualitative), of the D-loop target with A. sculptum. Those effects were observed in samples fixed for as little as 72h. The detrimental effects of isopropanol were also observed in samples extracted using an alkaline lysis method (Hotshot). Samples of A. parvum larvae preserved in RNAlater for 30 months showed an amplification efficacy of 100% in the ITS2 and COI assays, irrespective of the extraction method. Mitochondrial sequences are a central component of the majority of molecular studies of ticks. The findings of this study indicate that isopropanol should be avoided as a fixative for immature stages of ticks. Instead, the use of RNAlater is recommended in order to permit the consistent recovery of amplifiable mtDNA / O estudo de carrapatos e doen?as transmitidas por eles ? cada vez mais dependente da utiliza??o de t?cnicas de biologia molecular que s?o empregadas na detec??o de pat?genos, e a acurada identifica??o desses artr?podes, em particular os est?gios imaturos. A aplica??o bem-sucedida dos m?todos moleculares, principalmente, a rea??o em cadeia da polimerase (PCR), s? pode ser alcan?ada se o DNA presente no carrapato foi eficazmente preservado e extra?do de forma eficiente. O estudo comparou tr?s fixadores (RNAlater, sais de zinco (ZN) e isopropanol) avaliando a sua capacidade de preservar DNA mitocondrial (mtDNA) e nuclear de larvas e ninfas de Amblyomma parvum e larvas de Amblyomma scultptum. O DNA foi extra?do dos carrapatos, em tempos entre 72h e 12 meses ap?s a fixa??o por meio da t?cnica de fenol-clorof?rmio e lise alcalina (?Hot Shot?) e examinadas usando ensaios de PCR para sequ?ncias nucleares (espa?ador interno transcrito 2; ITS2) e mitocondriais (12S rDNA, subunidade 1 do citocromo c oxidase (COI) e D-loop). A efici?ncia de amplifica??o foi analisada quantitativamente (n?mero de amostras que produziram ?amplicon?) e qualitativamente (intensidade relativa das bandas observadas em g?is de agarose). Foi observado que a sequ?ncia ITS2 foi amplificada na maioria (93,39%, n= 283/303) das amostras em cada um dos tr?s fixadores, embora tenham sido observadas diferen?as qualitativas, particularmente com A. sculptum preservado em ZN. Em contraste, a fixa??o em isopropanol afetou negativamente a capacidade de amplificar as sequ?ncias dos marcadores mitocondriais de A. parvum e tamb?m resultou na amplifica??o inferior (qualitativa), do alvo D-loop com A. sculptum. Esses efeitos foram observados em amostras fixadas por apenas 72 horas. Os efeitos prejudiciais de isopropanol tamb?m foram observados igualmente em amostras extra?das usando um m?todo de lise alcalina (?HotShot?). As amostras de larvas de A. parvum preservadas em RNAlater durante 30 meses, mostrou uma efic?cia de amplifica??o de 100% nos ensaios para ITS2 e COI, independentemente do m?todo de extra??o usado. Sequ?ncias mitocondriais s?o um componente central da maioria das pesquisas moleculares com carrapatos. Os resultados deste estudo indicam que isopropanol deve ser evitado como um fixador para fases imaturas de carrapatos. Em vez disso, o uso de RNAlater ? recomendado, a fim de permitir a recupera??o consistente de mtDNA amplific?ve

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-01-23T17:15:00Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1818736 bytes, checksum: f0144bc2993d278c4694161930ed6b35 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-23T17:15:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1818736 bytes, checksum: f0144bc2993d278c4694161930ed6b35 (MD5) Previous issue date: 2016-10-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Dentro da família Ixodidae, relatos recentes descreveram que o cruzamento de carrapatos de populações do táxon Amblyomma cajennense provenientes de diferentes regiões geográficas, apresentavam desempenho reprodutivo com taxa de fertilidade reduzida, podendo este táxon englobar um complexo de espécies diferentes, com subtipos determinados pela distribuição biogeográfica. Por estudos morfológicos, filogenéticos e de biogeografia, concluiu-se que este carrapato deveria ser diferenciado em seis clados definidos por regiões geográficas, todos pertencentes ao Complexo A. cajennense. Considerando este contexto, buscou-se neste estudo ampliar a base de conhecimentos acerca do genoma mitocondrial completo do carrapato Amblyomma sculptum, e diferenciá-lo do Amblyomma cajennense, ambos subtipos e pertencentes ao Complexo A. cajennense. Dentre os achados, destacam-se o gene ND5 e as regiões controle 1 e 2 com características que os credenciam a atuarem como marcadores moleculares evolutivos para a diferenciação destes dois subtipos de carrapatos. Análises comparativas futuras fazem-se necessárias com sequências mitogenômicas dos demais membros do Complexo A. cajennense. Na família Argasidae existem indivíduos que são morfologicamente de difícil identificação. Esta dificuldade ocorre tanto com espécimes adultos, quanto em estádios imaturos, constituindo assim, um importante obstáculo para o estabelecimento de arranjos taxonômicos mais precisos para esta família de carrapatos, sendo um ponto negativo para estudos filogenéticos e epidemiológicos. Desta forma, para o estudo referente à família Argasidae, realizou-se análises comparativa e filogenética do mitogenoma de Nothoaspis amazoniensis para com outros membros desta família, com o objetivo de promover uma melhor compreensão das inter- relações evolutivas entre os carrapatos argasídeos. Como conclusão, evidenciou-se que a abordagem filogenômica posicionou o mitogenoma de N. amazoniensis em um clado monofilético característico do arranjo taxonômico Cladísta, englobado por representantes das regiões Afrotropical e Neotropical, com parasitismo específico em morcegos, o que pode ser um indicativo de um processo evolutivo de coevolução entre vetor e seu hospedeiro. Paralelamente, também se investigou para o N. amazoniensis, a interação parasita-hospedeiro baseando-se na presença de material genético proveniente da ação hematófaga realizado por este argasídeo em seus hospedeiros. O mitogenoma completo referente ao hospedeiro de N. amazoniensis foi sequenciado, montado e anotado, caracterizando-o como oriundo de animal membro da ordem Chiroptera. Por análise filogenética comparando esta sequência contra outras de representantes da Ordem Chiroptera, depositadas em bancos de dados biológicos, obteve-se a identificação desta em nível de gênero, denominando-a como Pteronotus sp. PV-RO-BRA. Considerando os dados referentes à coleta do argasídeo N. amazoniensis, e aos resultados apresentados para este morcego, neste estudo, conclui-se que o N. amazoniensis apresenta uma dependência evolutiva, não somente ao seu provável hospedeiro do gênero Pteronotus, mas de uma forma geral, ao conjunto de condições específicas ecológicas bióticas e abióticas encontradas em seu ecossistema. No atual estudo, a abordagem filogenômica e o estabelecimento de genomas mitocondriais completos, como estratégias moleculares, foram de fundamental importância na inferência filogenética de carrapatos pertencentes às famílias Ixodidae e Argasidae, como também, no estudo sobre a associação evolutiva entre o N. amazoniensis, seu hospedeiro e o ecossistema habitado. / Within the Ixodidae family, recent reports have described that the crossing of populations of ticks Amblyomma cajennense taxon from different geographical regions, had reproductive performance with reduced fertility rate, which taxon may comprise a complex of different species, with subtypes determined by biogeographical distribution. Per morphologic, phylogenetic and biogeography studies have concluded that this tick should be differentiated into six clades defined by geographic regions, all belonging to the compound A. cajennense. In this context, this study targeted to expand the knowledge base about the complete mitochondrial genome of the tick Amblyomma sculptum, and differentiate it from Amblyomma cajennense, both subtypes and belonging to Complex A. cajennense. Among the findings, we can highlight the ND5 gene and control regions 1 and 2 which characteristics qualify them to act as evolutionary molecular markers for differentiation of these two subtypes of ticks. In the future is necessary more comparative analyzes with mitogenomics sequences of other members of the complex A. cajennense. In Argasidae family there are individuals who are morphologically difficult to identify. This difficulty occur in both, adult specimens and immature stages, then creating a major obstacle to the establishment of more precise taxonomic arrangements for this family of ticks, with a negative point for phylogenetic and epidemiological studies. Therefore, in the study relating to Argasidae family, it was carried comparative and phylogenetic analyzes of mitogenome of Nothoaspis amazoniensis to other members of this family, targeting a better understanding of the evolutionary interrelationships between ticks argasids. In conclusion, it was shown that the phylogenomic approach placed the mitogenome N. amazoniensis in a monophyletic clade typical of a taxonomic arrangement Cladist comprised by representatives of Afrotropical and Neotropical regions, with specific parasitism in bats, which may indicate an evolutionary process of coevolution between vector and its host. At the same time, it was also investigated for N. amazoniensis, the parasite-host interaction taking in account the presence of genetic material from hematophagous action performed by this argasid in their hosts. The complete mitogenome referring to the host of N. amazoniensis was sequenced, assembled and annotated, characterizing it as originated from an animal member of the order Chiroptera. Through phylogenetic analysis, comparing this sequence against other sequences of representatives of Chiroptera order, placed in biological databases, it was obtained an identification of this sequence in the genus level, terming it as Pteronotus sp. PV-RO-BRA. Considering the data regarding the collection of argasid N. amazoniensis, and the results presented for this bat in this study it was concluded that N. amazoniensis presents an evolutionary dependence, not only to the probable host Pteronotus gender, but in general, to the set of ecological specific conditions, biotic and abiotic, found in its ecosystem. In the current study, the phylogenomic approach and the establishment of complete mitochondrial genomes, as molecular strategies, have been of fundamental importance in the phylogenetic inference of ticks belonging to the Ixodidae and Argasidae families, as well as in the study of the evolutionary association between N. amazoniensis, its host and the ecosystem inhabited.