Trabalhos recentes de genética, morfologia e biologia conduzidos nas Américas, demostraram que Amblyomma cajennense é um complexo de pelo menos seis espécies distintas, cada espécie associada a uma área biogeográfica. Neste contexto, o presente estudo conduzido no Brasil realizou análises morfológicas e moleculares de carrapatos adultos, previamente identificados como A. cajennense e depositados nas coleções de carrapatos Coleção Nacional de Carrapatos, da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, e na Coleção Acarológica do Instituto Butantan do Instituto Butantan de São Paulo. Amostras adicionais de carrapatos foram obtidos através de trabalhos de campo. Os carrapatos foram coletados em vida livre, animais domésticos (equinos, suínos) e silvestres atropelados (anta, tamanduá), durante três expedições de coleta, sendo uma no nordeste do país entre os municípios de Bequimão/MA e Estrela do Norte/GO; uma no noroeste do país entre os municípios de Presidente Médici/RO e Vila Bela da Santíssima Trindade/MT; e uma terceira no centro-norte do país entre os municípios de Sinop/MT e Cuiabá/MT. Os resultados morfológicos e moleculares obtidos demonstraram a ocorrência de pelo menos duas espécies distintas de carrapatos (A. cajennense sensu stricto e Amblyomma sculptum) do complexo A. cajennense ocorrendo no território nacional. De modo geral, a distribuição da espécie A. cajennense s. s. está confirmada no Brasil em três estados da região Norte (Pará, Rondônia e Tocantins), em um estado da região Nordeste (Maranhão) e do Centro-Oeste (Mato Grosso). Salienta-se um único encontro de uma fêmea de A. cajennense s. s. em uma propriedade rural do município de Porangatu, no extremo norte do estado de Goiás, na divisa com o estado de Tocantins. A ocorrência de A. sculptum está confirmada nos seguintes estados brasileiros da região Norte: Pará, Rondônia e Tocantins; Nordeste: Bahia, Maranhão, Pernambuco e Piauí; Centro-Oeste: Distrito Federal, Goiás, Mato Grosso e Mato Grosso do Sul; Sudeste: Espírito Santo, Minas Gerais, Rio de Janeiro e São Paulo; e Sul: Paraná. Estes dados indicam que o papel de cada uma destas espécies na transmissão de patógenos deve ser reavaliado de acordo com seu novo status taxonômico. / Recent genetic, biological and morphological studies have demonstrated that Amblyomma cajennense is a complex of at least six distinct species, each species linked to a biogeographic area in the American continent. In this context, the present study aimed to perform morphological and molecular analyzes of adult ticks, previously identified as A. cajennense, deposited in the collections of ticks \"Coleção Nacional de Carrapatos\", the Faculty of Veterinary Medicine and Zootechny of the University of São Paulo and in the \"Coleção Acarológica do Instituto Butantan\" the Butantan Institute of São Paulo. Adicional tick specimens were obtained through fieldwork. Ticks were collected in the vegetation, domestic animals (horses, pigs) and road-killed wild animals (tapir, anteater) during three field expeditions, one in the northeast of the country between the municipalities of Bequimão/MA and Estrela do Norte/GO; one in the northwest of the country between the municipalities of Presidente Médici/RO and Vila Bela da Santíssima Trindade/MT; and a third one in the center-north of the country between the municipalities of Sinop/MT and Cuiabá/MT. The morphological and molecular results demonstrated the occurrence of at least two distinct species of ticks (A. cajennense sensu stricto and Amblyomma sculptum) of the A. cajennense species complex occurring in the Brazilian land. In general, the distribution of the species A. cajennense s. s. is confirmed in Brazil in three northernern states (Pará, Rondônia and Tocantins) one Northeast state (Maranhão) and one Midwest state (Mato Grosso). It is note worthy the findings of a single female of A. cajennense s. s. on a farm in the municipality of Porangatu, in the far north of the state of Goiás at the northern end of the state of Goiás, at the border with the state of Tocantins. The occurrence of A. sculptum is confirmed in the following Brazilian states Northern region: Pará, Rondônia and Tocantins; Northeastern region: Bahia, Maranhão, Piauí and Pernambuco; Midwester region: Distrito Federal, Goiás, Mato Grosso and Mato Grosso do Sul; Southeastern region: Espírito Santo, Minas Gerais, Rio de Janeiro and São Paulo; and Southern region: Paraná. These data indicate that the role of each of these species in pathogen transmission should be re-assessed according to its new taxonomic status.

Trabalhos recentes de genética, morfologia e biologia conduzidos nas Américas, demostraram que Amblyomma cajennense é um complexo de pelo menos seis espécies distintas, cada espécie associada a uma área biogeográfica. Neste contexto, o presente estudo conduzido no Brasil realizou análises morfológicas e moleculares de carrapatos adultos, previamente identificados como A. cajennense e depositados nas coleções de carrapatos Coleção Nacional de Carrapatos, da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, e na Coleção Acarológica do Instituto Butantan do Instituto Butantan de São Paulo. Amostras adicionais de carrapatos foram obtidos através de trabalhos de campo. Os carrapatos foram coletados em vida livre, animais domésticos (equinos, suínos) e silvestres atropelados (anta, tamanduá), durante três expedições de coleta, sendo uma no nordeste do país entre os municípios de Bequimão/MA e Estrela do Norte/GO; uma no noroeste do país entre os municípios de Presidente Médici/RO e Vila Bela da Santíssima Trindade/MT; e uma terceira no centro-norte do país entre os municípios de Sinop/MT e Cuiabá/MT. Os resultados morfológicos e moleculares obtidos demonstraram a ocorrência de pelo menos duas espécies distintas de carrapatos (A. cajennense sensu stricto e Amblyomma sculptum) do complexo A. cajennense ocorrendo no território nacional. De modo geral, a distribuição da espécie A. cajennense s. s. está confirmada no Brasil em três estados da região Norte (Pará, Rondônia e Tocantins), em um estado da região Nordeste (Maranhão) e do Centro-Oeste (Mato Grosso). Salienta-se um único encontro de uma fêmea de A. cajennense s. s. em uma propriedade rural do município de Porangatu, no extremo norte do estado de Goiás, na divisa com o estado de Tocantins. A ocorrência de A. sculptum está confirmada nos seguintes estados brasileiros da região Norte: Pará, Rondônia e Tocantins; Nordeste: Bahia, Maranhão, Pernambuco e Piauí; Centro-Oeste: Distrito Federal, Goiás, Mato Grosso e Mato Grosso do Sul; Sudeste: Espírito Santo, Minas Gerais, Rio de Janeiro e São Paulo; e Sul: Paraná. Estes dados indicam que o papel de cada uma destas espécies na transmissão de patógenos deve ser reavaliado de acordo com seu novo status taxonômico. / Recent genetic, biological and morphological studies have demonstrated that Amblyomma cajennense is a complex of at least six distinct species, each species linked to a biogeographic area in the American continent. In this context, the present study aimed to perform morphological and molecular analyzes of adult ticks, previously identified as A. cajennense, deposited in the collections of ticks \"Coleção Nacional de Carrapatos\", the Faculty of Veterinary Medicine and Zootechny of the University of São Paulo and in the \"Coleção Acarológica do Instituto Butantan\" the Butantan Institute of São Paulo. Adicional tick specimens were obtained through fieldwork. Ticks were collected in the vegetation, domestic animals (horses, pigs) and road-killed wild animals (tapir, anteater) during three field expeditions, one in the northeast of the country between the municipalities of Bequimão/MA and Estrela do Norte/GO; one in the northwest of the country between the municipalities of Presidente Médici/RO and Vila Bela da Santíssima Trindade/MT; and a third one in the center-north of the country between the municipalities of Sinop/MT and Cuiabá/MT. The morphological and molecular results demonstrated the occurrence of at least two distinct species of ticks (A. cajennense sensu stricto and Amblyomma sculptum) of the A. cajennense species complex occurring in the Brazilian land. In general, the distribution of the species A. cajennense s. s. is confirmed in Brazil in three northernern states (Pará, Rondônia and Tocantins) one Northeast state (Maranhão) and one Midwest state (Mato Grosso). It is note worthy the findings of a single female of A. cajennense s. s. on a farm in the municipality of Porangatu, in the far north of the state of Goiás at the northern end of the state of Goiás, at the border with the state of Tocantins. The occurrence of A. sculptum is confirmed in the following Brazilian states Northern region: Pará, Rondônia and Tocantins; Northeastern region: Bahia, Maranhão, Piauí and Pernambuco; Midwester region: Distrito Federal, Goiás, Mato Grosso and Mato Grosso do Sul; Southeastern region: Espírito Santo, Minas Gerais, Rio de Janeiro and São Paulo; and Southern region: Paraná. These data indicate that the role of each of these species in pathogen transmission should be re-assessed according to its new taxonomic status.

There are a huge number of pathogens with multi-component transmission cycles, involving ampli_er hosts, vectors, complex pathogen life cycles and particular environmental conditions. These complex systems present challenges in terms of modeling and policy development. The deadliest tick-borne infectious disease in the world, the Brazilian Spotted Fever (BSF), is a relevant example of that. The current increase of human cases of BSF has been associated with the presence and expansion of capybaras Hydrochoerus hydrochaeris, amplifer host for the agent Rickettsia rickettsii and primary host for the tick vector Amblyomma sculptum. The objective of this thesis was to analyze the dynamics of the FMB with the purpose of providing bases for the planning of strategies focused on the prevention of human cases. We proposed diferent approaches to evaluating: i) the contribution of hosts and vectors in the transmission of BSF, ii) potential risk areas and anthropogenic parameters associated with the occurrence of human cases, iii) the pattern and the spatial propagation velocity of BSF, and iv) climatic and landscape factors that could be related to the distribution of the vector. The proposed approaches elucidated how BSF control and prevention strategies can be focused on the management of amplifier hosts populations. We found that geographical barriers generated, for example, by areas of riparian reforestation, could prevent the spatial spread of BSF, since a positive association between the occurrence of human cases and the increment of sugarcane crop was determined, as well as a higher propagation velocity of BSF in places with higher carrying capacity. This thesis was interdisciplinary and required, on one hand, expertise in biology, computational epidemiology, mathematics and statistics and on the other hand, a datarich environment such as the Laboratory of Parasitology of the VPS/FMVZ/USP. The results of this thesis can be usefulness in the planning of public health policies related to the prevention of BSF. Furthermore, this work will open the path to further mathematical and computational studies focused on the dynamics and prevention of other vector-borne infectious diseases. / Existe um grande número de agentes patogênicos com ciclos de transmissão complexos, envolvendo hospedeiros amplificadores, vetores e condições ambientais particulares. Esses sistemas complexos apresentam desafios quanto a modelagem e desenvolvimento de políticas públicas. A Febre Maculosa Brasileira (FMB) é a doença transmitida por carrapatos mais letal do mundo e é um claro exemplo de um sistema complexo. O aumento atual de casos humanos de BSF tem sido associado à presença e expansão de capivaras Hydrochoerus hydrochaeris, hospedeiros amplificadores do agente Rickettsia rickettsii e hospedeiros primários do carrapato vetor Amblyomma sculptum. O objetivo desta tese foi analisar a dinâmica da FMB com o propósito de fornecer bases para o delineamento de estratégias de prevenção de casos em humanos. Diferentes abordagens foram propostas para avaliar: i) a contribuição específica de hospedeiros e vetores na transmissão da FMB, ii) os parâmetros antropogênicos associados com a ocorrência dos casos e potenciais áreas de risco, iii) o padrão e a velocidade de propagação espacial e da doença, e iv) os fatores climáticos e paisagísticos que poderiam estar relacionados à distribuição do vetor. Os modelos propostos elucidaram que as estratégias de controle e prevenção da FMB podem estar focadas em práticas de manejo das populações de hospedeiros amplificadores. Uma vez que uma associação positiva entre ocorrência de casos humanos e o incremento de cultura de cana-de-açúcar foi determinada, assim como uma maior velocidade de propagação da FMB em locais com alta quantidade desta cultura, barreiras geográficas geradas, por exemplo, por zonas de reflorestamento ciliar, poderiam impedir a disseminação da FMB. Esta tese foi interdisciplinar e exigiu, por um lado, conhecimentos em biologia, epidemiologia computacional, matemática e estatística e, em contrapartida, um ambiente rico em dados biológicos como o Laboratório de Parasitologia do VPS/USP. Os resultados desta tese poderão ser utilizados na planificação de políticas de saúde pública enfocadas à prevenção da FMB. Complementarmente, este trabalho abrirá o caminho para futuros estudos matemáticos e computacionais orientados no estudo da dinâmica e prevenção de outras doenças infecciosas transmitidas por vetores.

There are a huge number of pathogens with multi-component transmission cycles, involving ampli_er hosts, vectors, complex pathogen life cycles and particular environmental conditions. These complex systems present challenges in terms of modeling and policy development. The deadliest tick-borne infectious disease in the world, the Brazilian Spotted Fever (BSF), is a relevant example of that. The current increase of human cases of BSF has been associated with the presence and expansion of capybaras Hydrochoerus hydrochaeris, amplifer host for the agent Rickettsia rickettsii and primary host for the tick vector Amblyomma sculptum. The objective of this thesis was to analyze the dynamics of the FMB with the purpose of providing bases for the planning of strategies focused on the prevention of human cases. We proposed diferent approaches to evaluating: i) the contribution of hosts and vectors in the transmission of BSF, ii) potential risk areas and anthropogenic parameters associated with the occurrence of human cases, iii) the pattern and the spatial propagation velocity of BSF, and iv) climatic and landscape factors that could be related to the distribution of the vector. The proposed approaches elucidated how BSF control and prevention strategies can be focused on the management of amplifier hosts populations. We found that geographical barriers generated, for example, by areas of riparian reforestation, could prevent the spatial spread of BSF, since a positive association between the occurrence of human cases and the increment of sugarcane crop was determined, as well as a higher propagation velocity of BSF in places with higher carrying capacity. This thesis was interdisciplinary and required, on one hand, expertise in biology, computational epidemiology, mathematics and statistics and on the other hand, a datarich environment such as the Laboratory of Parasitology of the VPS/FMVZ/USP. The results of this thesis can be usefulness in the planning of public health policies related to the prevention of BSF. Furthermore, this work will open the path to further mathematical and computational studies focused on the dynamics and prevention of other vector-borne infectious diseases. / Existe um grande número de agentes patogênicos com ciclos de transmissão complexos, envolvendo hospedeiros amplificadores, vetores e condições ambientais particulares. Esses sistemas complexos apresentam desafios quanto a modelagem e desenvolvimento de políticas públicas. A Febre Maculosa Brasileira (FMB) é a doença transmitida por carrapatos mais letal do mundo e é um claro exemplo de um sistema complexo. O aumento atual de casos humanos de BSF tem sido associado à presença e expansão de capivaras Hydrochoerus hydrochaeris, hospedeiros amplificadores do agente Rickettsia rickettsii e hospedeiros primários do carrapato vetor Amblyomma sculptum. O objetivo desta tese foi analisar a dinâmica da FMB com o propósito de fornecer bases para o delineamento de estratégias de prevenção de casos em humanos. Diferentes abordagens foram propostas para avaliar: i) a contribuição específica de hospedeiros e vetores na transmissão da FMB, ii) os parâmetros antropogênicos associados com a ocorrência dos casos e potenciais áreas de risco, iii) o padrão e a velocidade de propagação espacial e da doença, e iv) os fatores climáticos e paisagísticos que poderiam estar relacionados à distribuição do vetor. Os modelos propostos elucidaram que as estratégias de controle e prevenção da FMB podem estar focadas em práticas de manejo das populações de hospedeiros amplificadores. Uma vez que uma associação positiva entre ocorrência de casos humanos e o incremento de cultura de cana-de-açúcar foi determinada, assim como uma maior velocidade de propagação da FMB em locais com alta quantidade desta cultura, barreiras geográficas geradas, por exemplo, por zonas de reflorestamento ciliar, poderiam impedir a disseminação da FMB. Esta tese foi interdisciplinar e exigiu, por um lado, conhecimentos em biologia, epidemiologia computacional, matemática e estatística e, em contrapartida, um ambiente rico em dados biológicos como o Laboratório de Parasitologia do VPS/USP. Os resultados desta tese poderão ser utilizados na planificação de políticas de saúde pública enfocadas à prevenção da FMB. Complementarmente, este trabalho abrirá o caminho para futuros estudos matemáticos e computacionais orientados no estudo da dinâmica e prevenção de outras doenças infecciosas transmitidas por vetores.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-06-22T17:13:14Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1578494 bytes, checksum: d7fa5a752b4c56f8611d2e504d7afa84 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-22T17:13:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1578494 bytes, checksum: d7fa5a752b4c56f8611d2e504d7afa84 (MD5) Previous issue date: 2017-02-10 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os carrapatos são artrópodes parasitas que se alimentam obrigatoriamente de sangue, sendo capazes de parasitar diversos hospedeiros vertebrados. O intestino dos carrapatos machos e fêmeas possui diferenças morfológicas, tendo como principal função a digestão intracelular dos componentes do sangue obtidos durante a alimentação. Este órgão possui várias proteínas relacionadas com o desenvolvimento, metabolismo e mecanismo de digestão da hemoglobina. Neste trabalho, as proteínas do intestino de carrapatos Amblyomma sculptum, machos e fêmeas foram analisadas com o auxílio da cromatografia líquida acoplada com a espectrometria de massas. O algoritmo PEAKS identificou um maior número de proteínas do intestino nas estratégias fracionadas e não fracionadas em relação aos algoritmos MASCOT e SCAFFOLD, tanto para o banco de dados Chelicerata quanto para o banco de dados Oryctolagus, utilizando os analisadores Ion Trap e QTOF. Pelo KOG, as classes das proteínas analisadas no intestino dos carrapatos machos e fêmeas que se destacaram estão envolvidas na dinâmica e estrutura da cromatina, tradução, biogênese e estrutura ribossomal, modificação pós-traducional, turnover proteico, chaperonas, citoesqueleto, conversão e produção de energia, metabolismo e transporte de carboidratos, lipídeos e íons inorgânicos. Na identificação das proteínas do hospedeiro, a hemoglobina, componente de maior volume no sangue, foi encontrada em ambos os sexos. As informações obtidas neste trabalho podem fornecer uma base sobre a fisiologia do intestino de machos e fêmeas A. sculptum e auxiliar na escolha de proteínas como alvos moleculares potenciais, visando avanço nas estratégias de controle aplicadas para estes artrópodes. / Ticks are parasitic arthropods that feed necessarily of blood, being able of parasitizing various vertebrate hosts. The midgut of males and females ticks has morphological differences, having as main function the intracellular digestion of blood components obtained during feeding. This organ has several proteins related to the development, metabolism, and mechanism of hemoglobin digestion. In this work, the midgut proteins of Amblyomma sculptum ticks, males and females were analyzed with aid of liquid chromatography coupled with mass spectrometry. The PEAKS algorithm identified a larger number of proteins in fractional and non-fractionated strategies in relation to algorithms MASCOT and SCAFFOLD for both Chelicerata and Oryctolagus databases, using Ion Trap and QTOF analyzers. By KOG, the classes of proteins analyzed in the midgut of the males and females ticks are involved in the chromatin structure and dynamics, translation, ribosomal structure and biogenesis, post- translational modification, protein turnover and chaperones, cytoskeleton, energy production and conversion, metabolism and transport of carbohydrates, lipids and inorganic ions. In the identification of the host proteins, the hemoglobin, greater blood volume component, was found in both genders. The informations obtained in this work can provide a basis about the midgut phisiology of males and females A. sculptum and assist in the selection of proteins as potencial molecular targets, aiming advance in the control strategies applied to these arthropods.

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-10-25T17:11:15Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1261921 bytes, checksum: 067fce7911dd12871ca7da328ba82529 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-25T17:11:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1261921 bytes, checksum: 067fce7911dd12871ca7da328ba82529 (MD5) Previous issue date: 2017-06-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O carrapato Amblyomma sculptum pertence ao complexo Amblyomma cajennnense, taxon mais importante na transmissão e como hospedeiro da bactéria Rickettsia rickettsii, principal agente etiológico da Febre Maculosa Brasileira e da Febre Maculosa das Montanhas Rochosas nos EUA. Como membro deste complexo de espécies, o carrapato A. sculptum é atualmente muito importante sob o aspecto médico veterinário atuando como vetor deste agente zoonótico no Brasil. Seu papel no ciclo biológico da riquétsia, bem como a relação Rickettsia-carrapato, precisam ser bem compreendidos pois estudos recentes encontraram esta espécie de bactéria no carrapato A. sculptum. Como parte desta relação, as funções de RNAs não codificantes de cadeias longas (lncRNA) são desconhecidas e precisam ser descobertas. Os lncRNAs estão envolvidos em uma infinidade de atividades celulares tais como transcrição, silenciamento gênico e abertura cromossômica, por exemplo. Dessa forma, apresentamos aqui uma abordagem in silico da modulação de lncRNAs pela Rickettsia amblyommii em carrapatos da espécie A. sculptum. Tomando como dados trabalhos publicados anteriormente nós identificamos e avaliamos possíveis lncRNAs para expressão diferencial em intestinos e ovários desta espécie de carrapato. Dois montadores de sequencias foram testados, Trinity e CLC Genomics, para construção de contigs e um filtro a partir de um pipeline caseiro para selecionar apenas sequências com características de lncRNA. Um total de 31.888 e 23.733 contigs foram montados pelo Trinity e CLC Genomics, respectivamente. Nós anotamos mais de 500 sequências possíveis de lncRNA contra os bancos de dados RefSeq RNA, RNA Central e NONCODE. Nossos resultados sugerem que a R. amblyommii está induzindo expressão diferencial de lncRNAs nos tecidos dos intestinos e ovários. Nosso trabalho contribui para o aumento do banco de dados de lncRNA de carrapatos bem como fornecer idéias iniciais de quais sequências de lncRNA estão envolvidas na relação Rickettsia- carrapato / The Amblyomma sculptum tick belongs to Amblyomma cajennnense complex, the most important taxon in transmission and host for Rickettsia rickettsii bacteria, the main etiologic agent of Brazilian Spotted Fever in Brazil and Rocky Mountain Spotted Fever in USA. As a member of this species complex, A. sculptum tick is actually very important under human and veterinary subject acting as vector for this zoonotic agent in Brazil. Its role in biological cycle of rickettsia strains, as well Rickettsia-tick interactions, still need to be better understood since recent studies found these strains infecting A. sculptum ticks. As putative modulators of these pathogen-host interaction, the roles of long non-coding RNAs (lncRNA) of ticks are unknown and need to be discovered and characterized. The lncRNAs are involving in modulation of a plethora of cell activities as transcription, gene silencing and chromosome opening, for example. Thus, herein we present an in silico approach for analyze the modulation of lncRNAs by R. amblyommii in A. sculptum tick. Using previously published data sets of A. sculptum transcriptomes, we identified putative lncRNAs and evaluated for differential expression in midgut and ovaries in this tick specie. Two assemblers were tested, Trinity and CLC Genomics, to construct the contigs and a pipeline to select the sequences with lncRNA characteristics. We obtained 31,888 and 23,733 contigs of putative lncRNAs using Trinity and CLC Genomics, respectively. We further identified more than 500 sequences of putative lncRNA that significantly aligned to sequences of RefSeq RNA, RNA Central and NONCODE databases. The transcriptome analysis further suggests that R. amblyommii is inducing differential expression of putative lncRNAs in midgut and ovary tissues. The work herein contributes for tick lncRNA database increasing and the initials insights of which lncRNA sequences are involving in Rickettsia-tick relationship

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-03-21T14:59:22Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3716003 bytes, checksum: 3011b5cf3648f69aa355d3ce6312b5c6 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-21T14:59:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3716003 bytes, checksum: 3011b5cf3648f69aa355d3ce6312b5c6 (MD5) Previous issue date: 2015-06-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / As lipocalinas constituem uma família de pequenas proteínas extracelulares com cerca de 200 resíduos de aminoácidos e massa molecular de 20 Kda possuem forte divergência em suas sequências de aminoácidos mas mantêm a sua estrutura tridimensional estritamente conservada. Sua diversidade funcional e reconhecimento molecular, contribuem para a utilização dessas proteínas como base para o desenvolvimento de alguns biofármacos. Os genes constitutivos participam de diversas funções do metabolismo celular e são utilizados como controle endógeno sendo fundamentais para validação dos resultados no estudo da expressão utilizando real time RTq-PCR. Em relação a esses genes, ainda não foram publicados trabalhos que identifiquem e validem genes constitutivos como genes de referência para a espécie Amblyomma sculptum (Complexo Amblyomma cajennense). Atualmente, transcriptomas de órgãos e tecidos de carrapatos do gênero Amblyomma têm sido publicados identificando uma variedade de transcritos de lipocalinas com domínio de ligação a histamina e serotonina (SHBP). Neste trabalho, realizamos por predição in silico a identificação de nove lipocalinas com domínio de ligação a serotonina e histamina estabelecendo possíveis relações filogenéticas funcionais de transcritos de lipocalinas identificadas no transcriptoma de glândula salivar do A. sculptum. Realizamos o desenho e a validação de 3 primers de genes de lipocalinas identificadas, lip4, lip7 e lip24. Foram analisados e validados 3 primers de genes constitutivos (g6pdh, 3ohcoadh e gapdh) candidatos potenciais a genes de referência em glândulas salivares, intestinos e ovários do carrapato A. sculptum em situação de não infecção/infecção com R. amblyommii. Foram validados 3 modelos estruturais correspondentes às proteínas lipocalina 4, lipocalina 7 e lipocalina 24. E ainda, realizou-se a análise da expressão diferencial de lipocalinas e potenciais genes de referência em glândula salivar, intestino e ovário de A. sculptum. Os dados obtidos na análise de expressão gênica por real time RT-qPCR suportam a hipótese de que os três genes de lipocalinas interferem na interação microrganismo-vetor sendo necessários trabalhos adicionais para verificação da validade desta hipótese, uma vez que dentre as 121 lipocalinas preditas no transcriptoma de glândulas salivares, somente nove apresentam domínios SHBP sugerindo um papel especial na função destas nos tecidos estudados. / The lipocalin’s family compound a small extracellular protein of about 200 amino acid residues and a molecular mass of 20 kDa present strong divergence in their amino acid sequences but retain its strictly conserved three dimensional structure. Its functional diversity and molecular recognition, contributing to the use of these proteins as a basis for the development of some biopharmaceuticals. The reference genes involved in various cellular metabolism functions and are used, as endogenous control is necessary to validate the results in the study of the expression for real RTQ-PCR analisys. For these genes have not yet been published works to identify and validate constitutive genes as the reference genes for Amblyomma sculptum (Amblyomma cajennense complex) species. Currently, transcriptomes of organs and tissues of the genus Amblyomma ticks have been published identifying a variety of lipocalins transcripts with binding domain histamine and serotonine (SHBP). We carried out by prediction in silico identification of nine lipocalins with serotonine and histamine binding domain setting possible functional phylogenetic relationships of lipocalins transcripts identified in salivary gland transcriptome of A. sculptum. We carry out the design and validation of three primers identified lipocalin genes, lip4, lip7 and lip24. They were analyzed and validated three primers of constitutive genes (g6pdh, 3ohcoadh and gapdh) potential candidate reference genes in the salivary glands, ovaries and intestines A. sculptum tick for a situation of no infection / infection with R. amblyommii. Were validated three corresponding structural models to lipocalins 4, 7 and 24. Yet, there was the analysis of differential expression of lipocalins and potential reference genes in the salivary gland, gut and ovarian A. sculptum tick. The results of analysis in experiment of gene expression by real time RT-qPCR support the hypothesis that the three lipocalins genes interfere with the microorganism-vector interactions. Finaly it is necessary a further work to verify the validity of this hypothesis, since among the 121 lipocalins predicted in transcriptome salivary glands, only nine have SHBP domains suggesting a special role in the function of these tissues studied.

Recentemente, o táxon Amblyomma cajennense sofreu uma divisão sistemática, através de estudos morfológicos, moleculares e biológicos. No Brasil, Amblyomma sculptum (pertencente ao complexo Amblyomma cajennense) tem sua importância em saúde pública relacionada à transmissão de Rickettsia rickettsii, agente etiológico da Febre Maculosa, doença esta considerada de maior importância dentre as enfermidades transmitidas por carrapatos na América Latina. A Febre Maculosa Brasileira (FMB) tem seu destaque de ocorrência na região sudeste do país, onde A. sculptum está bem estabelecido e quase sempre relacionado à presença de capivaras. Porém, nem todas as áreas da região sudeste com presença de carrapatos A. sculptum e capivaras tem notificações de transmissão de R. rickettsii para humanos. O intuito do presente estudo foi avaliar, em condições de laboratório, a susceptibilidade da infecção por R. rickettsii em seis populações geograficamente distintas de A. sculptum. Dessa forma, foi realizada a quantificação da perpetuação transestadial, da transmissão transovariana e de possíveis efeitos deletérios da infecção nos carrapatos. Além disso, tentou-se correlacionar a susceptibilidade à infecção das diferentes populações de carrapatos (de áreas endêmicas e não endêmicas para FMB) ao perfil genético das mesmas, através dos marcadores 16S rDNA mitocondrial e ITS2 nuclear. Com base nos resultados encontrados, pode-se constatar diferenças na susceptibilidade à infecção por R. rickettsii entre as seis populações de A. sculptum estudadas, muito embora todas elas se mostraram parcialmente refratárias à infecção por R. rickettsii. No entanto, não foi observado nenhum padrão específico de variabilidade nos parâmetros biológicos e reprodutivos de carrapatos infectados e não infectados. A partir dos resultados de caracterização molecular, não foi possível verificar divergências genéticas entre as diferentes populações para o marcador ITS2 nuclear. Da mesma forma, com a análise do marcador 16S rDNA mitocondrial não constatou-se divergências genéticas que pudessem ser atribuídas à maior susceptibilidade ou refratariedade dos carrapatos à infecção por R. rickettsii. Porém, vale ressaltar que variabilidade nucleotídica neste marcador foi observada entre algumas populações, que parece seguir padrões geográficos de origem. A exceção para este resultado foi a população de Belo Horizonte (Pampulha), que apresentou variabilidade intrapopulacional, com genótipo semelhante à população do Parque Nacional Grande Sertão Veredas (GSV), ambas do estado de Minas Gerais e um segundo genótipo idêntico ao de Itu, no estado de São Paulo / Recently, the taxon Amblyomma cajennense taxon resulted in a systematic division, through morphological, molecular and biological studies. In Brazil, Amblyomma sculptum (belonging to the Amblyomma cajennense complex) has its importance in public health related to Rickettsia rickettsii transmission, the etiologic agent of spotted fever, disease that is considered the most important among the tick-borne diseases in Latin America. Brazilian Spotted Fever (BSF) has its occurrence in the southeastern region of the country where A. sculptum is well established and is almost always related to presence of capybaras. However, not all areas of southeastern of Brazil with A. sculptum ticks and capybaras have notifications of transmission of R. rickettsii to humans. This study aimed to evaluate, under laboratory conditions, the R. rickettsii susceptibility among six geographically distinct populations of A. sculptum. To this purpose, the transestadial perpetuation, transovarial transmission and possible deleterious effects of R. rickettsii infection were quantified in the six tick populations. In addition, we attempted to correlate the susceptibility to infection of different populations of ticks (from BSF-endemic and BSF-non-endemic areas) to the genetic profile of them through the markers mitochondrial 16S rDNA and nuclear ITS2. The results show differences in the susceptibility to infection with R. rickettsii among the six A. sculptum populations, although all populations were partially refractory to R. rickettsii infection. However, it was not observed any specific pattern of variation in biological and reproductive parameters of infected and uninfected ticks. Results of molecular characterization did not indicate genetic divergence between the populations for nuclear ITS2 marker. In the same way, analysis of mitochondrial 16S rDNA marker found no genetic differences that could be attributed to increased susceptibility or refractory of ticks to infection by R. rickettsii. However, it is note worth that nucleotide variability in this marker was observed among some populations, which seems to follow geographical patterns of origin. The exception to this result was the Belo Horizonte (Pampulha) population, which showed intrapopulation variability, having a similar genotype to the Grande Sertão Veredas population (GSV), both from the state of Minas Gerais and a second identical genotype to the Itu, from the state of São Paulo

Cultura de células de carrapatos, é uma ferramenta importante, para isolar e estudar os agentes de doenças transmissíveis. Amblyomma sculptum é o principal vetor de Rickettsia rickettsii, o agente da febre maculosa. O objetivo deste estudo foi estabelecer e caracterizar as células deste carrapato, além de testar seu potencial uso, como substrato para o crescimento e isolamento de patógenos. A partir de massas de ovos de A. sculptum, culturas primárias foram, preparadas em meio L-15B, subcultivadas ao atingirem a confluência necessária e criopreservadas em diversas passagens. A boa recuperação celular estabeleceu a linhagem IBU/ASE-16, a qual foi testada para, Rickettsia spp, Trypanosoma theileri e Leishmania infantum chagasi, obtendo-se bons resultados. A citometria de fluxo analisou a expressão de marcadores de células-tronco, proliferação, diferenciação e regulação do ciclo celular, nas IBU/ASE-16. O Δψm mostrou atividade das mitocôndrias e ausência de células inativas. A microscopia confocal, localizou estruturas celulares marcadas com fluorocromos, enquanto que a MEV,mostrou, junções intercelulares, matriz extracelular e redes neuronais. O teste de tumorigênese em camundongos Balb/c nu/nu, não resultou em crescimento de tumores. / Cell cultures of ticks are important tools to isolate and study agents of transmissible diseases. Amblyomma sculptum is the main vector of Rickettsia rickettsii, the agent for spotted fever. The aim of this study was to establish and characterize the cells of this tick, and test their potential use as a substrate for the growth and isolation of pathogens. From a egg masses of A. sculptum, primary cultures were prepared in L-15B medium, subcultured as they reached the necessary convergence and cryopreserved in several passages. The good cell recovery established IBU/ASE-16 lineage, which was tested for Rickettsia spp, Trypanosoma theileri and Leishmania infantum chagasi, yielding good results. Flow cytometry analyzed the expression of stem cell markers, proliferation, differentiation and regulation of the cell cycle, in the IBU/ASE-16 lineage. The Δψm showed activity of mitochondria and absence of inactive cells. Confocal microscopy located cell structures marked with fluorochromes, while MEV showed intercellular junctions, extracellular matrix and neural networks. Tumorigenesis tests in Balb/c nu/nu mice resulted in no tumor growth.

Recentemente, o táxon Amblyomma cajennense sofreu uma divisão sistemática, através de estudos morfológicos, moleculares e biológicos. No Brasil, Amblyomma sculptum (pertencente ao complexo Amblyomma cajennense) tem sua importância em saúde pública relacionada à transmissão de Rickettsia rickettsii, agente etiológico da Febre Maculosa, doença esta considerada de maior importância dentre as enfermidades transmitidas por carrapatos na América Latina. A Febre Maculosa Brasileira (FMB) tem seu destaque de ocorrência na região sudeste do país, onde A. sculptum está bem estabelecido e quase sempre relacionado à presença de capivaras. Porém, nem todas as áreas da região sudeste com presença de carrapatos A. sculptum e capivaras tem notificações de transmissão de R. rickettsii para humanos. O intuito do presente estudo foi avaliar, em condições de laboratório, a susceptibilidade da infecção por R. rickettsii em seis populações geograficamente distintas de A. sculptum. Dessa forma, foi realizada a quantificação da perpetuação transestadial, da transmissão transovariana e de possíveis efeitos deletérios da infecção nos carrapatos. Além disso, tentou-se correlacionar a susceptibilidade à infecção das diferentes populações de carrapatos (de áreas endêmicas e não endêmicas para FMB) ao perfil genético das mesmas, através dos marcadores 16S rDNA mitocondrial e ITS2 nuclear. Com base nos resultados encontrados, pode-se constatar diferenças na susceptibilidade à infecção por R. rickettsii entre as seis populações de A. sculptum estudadas, muito embora todas elas se mostraram parcialmente refratárias à infecção por R. rickettsii. No entanto, não foi observado nenhum padrão específico de variabilidade nos parâmetros biológicos e reprodutivos de carrapatos infectados e não infectados. A partir dos resultados de caracterização molecular, não foi possível verificar divergências genéticas entre as diferentes populações para o marcador ITS2 nuclear. Da mesma forma, com a análise do marcador 16S rDNA mitocondrial não constatou-se divergências genéticas que pudessem ser atribuídas à maior susceptibilidade ou refratariedade dos carrapatos à infecção por R. rickettsii. Porém, vale ressaltar que variabilidade nucleotídica neste marcador foi observada entre algumas populações, que parece seguir padrões geográficos de origem. A exceção para este resultado foi a população de Belo Horizonte (Pampulha), que apresentou variabilidade intrapopulacional, com genótipo semelhante à população do Parque Nacional Grande Sertão Veredas (GSV), ambas do estado de Minas Gerais e um segundo genótipo idêntico ao de Itu, no estado de São Paulo / Recently, the taxon Amblyomma cajennense taxon resulted in a systematic division, through morphological, molecular and biological studies. In Brazil, Amblyomma sculptum (belonging to the Amblyomma cajennense complex) has its importance in public health related to Rickettsia rickettsii transmission, the etiologic agent of spotted fever, disease that is considered the most important among the tick-borne diseases in Latin America. Brazilian Spotted Fever (BSF) has its occurrence in the southeastern region of the country where A. sculptum is well established and is almost always related to presence of capybaras. However, not all areas of southeastern of Brazil with A. sculptum ticks and capybaras have notifications of transmission of R. rickettsii to humans. This study aimed to evaluate, under laboratory conditions, the R. rickettsii susceptibility among six geographically distinct populations of A. sculptum. To this purpose, the transestadial perpetuation, transovarial transmission and possible deleterious effects of R. rickettsii infection were quantified in the six tick populations. In addition, we attempted to correlate the susceptibility to infection of different populations of ticks (from BSF-endemic and BSF-non-endemic areas) to the genetic profile of them through the markers mitochondrial 16S rDNA and nuclear ITS2. The results show differences in the susceptibility to infection with R. rickettsii among the six A. sculptum populations, although all populations were partially refractory to R. rickettsii infection. However, it was not observed any specific pattern of variation in biological and reproductive parameters of infected and uninfected ticks. Results of molecular characterization did not indicate genetic divergence between the populations for nuclear ITS2 marker. In the same way, analysis of mitochondrial 16S rDNA marker found no genetic differences that could be attributed to increased susceptibility or refractory of ticks to infection by R. rickettsii. However, it is note worth that nucleotide variability in this marker was observed among some populations, which seems to follow geographical patterns of origin. The exception to this result was the Belo Horizonte (Pampulha) population, which showed intrapopulation variability, having a similar genotype to the Grande Sertão Veredas population (GSV), both from the state of Minas Gerais and a second identical genotype to the Itu, from the state of São Paulo